专利名称：一种快速测定糖化酶活力的方法
技术领域：
本发明涉及生物化学分析方法，具体地说是关于快速测定糖化酶活力的方法。
背景技术：
糖化酶广泛应用于发酵酒类、酶法生产葡萄糖、果萄糖浆、谷氨酸、柠檬酸、抗生素等行业。在糖化酶的生产和应用过程中都需要测定糖化酶的活力，对糖化酶活力的快速测定，可以真正了解糖化酶生产的各个环节及糖化酶应用过程中酶活力的变化情况，及时指导生产。目前，国内外糖化酶活力的测定方法有多种，我国国家标准测定糖化酶活力[1]和萃取化学公司法[2]相仿，是采用硫代硫酸盐滴定法，测定的是还原糖而不是葡萄糖，测定一个样品约一个小时。诺沃法[3]采用溶液酶法，需要消耗试剂酶，测定的是葡萄糖，需要将酶和底物在25℃下精确地保温30分钟。YSI公司[4]采用酶电极法测定糖化酶活力。他们的方法是用已知浓度的葡萄糖溶液作标准，根据酶反应在单位时间产生的葡萄糖量来计算酶活单位，测定时间约4分钟，结果的读出很麻烦，需要目测比较二个显示数的差值，然后通过计算得到糖化酶的活力单位。严格地说，它仅仅是利用葡萄糖分析仪的功能来测定糖化酶，不是一种专用的糖化酶分析仪。
发明内容
本发明的目的是根据这一反应过程，在葡萄糖氧化酶活力不变，并且糊精过量的条件下，一定时间内H2O2的生成量与糖化酶的活力成正比，利用这一原理，由过氧化氢电极检测相应的信号，经系统处理后，在屏幕上以数字直接显示糖化酶活力，并自动打印测定结果。
本发明快速测定糖化酶活力的技术方案是这样实现的测定系统反应池腔的侧面装有过氧化氢电极，电极表面为固定化的葡萄糖氧化酶膜圈，反应池还设有搅拌子和电磁搅拌器，底物和糖化酶通过进样口加入，由光控进样传感器检测加样动作，控制测定程序的运行，系统清洗时缓冲液通过缓冲液泵进入反应池腔，多余液体通过锥形溢流帽流入废液腔并经废液泵排出(附图1)；测定系统的二次仪表(附图2)是用单片机作中央控制器，控制采样、信号放大、A/D转换、清洗、搅拌、数据贮存和结果打印等功能。通过测定已知活力的葡萄糖糖化酶标样，获得每个酶活力单位相对应的H2O2电极电流，并以此作标定参数，以稀释一倍的标样对酶反应的米氏响应曲线作线性校正，在测定过程中通过运算，在显示屏上直接显示糖化酶的活力单位。
程序的工作流程如附图3所示。
图1、快速测定糖化酶活力的一次仪表2、快速测定糖化酶活力的二次仪表组成示意3、快速测定糖化酶活力程序4、PH对糖化酶活力测定的影响图5、酶反应动力学过程中1.进样口 2.光控进样传感器 3.废液腔 4.反应池腔5.葡萄糖酶膜 6.过氧化氢电极 7.电极紧固帽 8.有机玻璃反应池体9.反应池搅拌子 10.磁力搅拌器 11.缓冲液泵 12.废液泵13.废液出口 14.缓冲液入口 15.锥形溢流帽
具体实施例方式测定方法仪器开机后，调整仪器进入正常工作状态，将定量的葡萄糖糖化酶样品和底物糊精注入反应池，系统将按设定的程序自动记录反应起点到反应终点的酶反应产生的电极电流的变化量并进行数据处理，显示出测定样品的酶活力单位，打印测定结果，反应的起点和终点可根据需要设定。测定时首先用已知活性单位的糖化酶溶液对系统进行定标和线性校正，然后将待测样品稀释后测定，系统显示数值乘以稀释倍数即为被测定样品中的糖化酶活性单位。
试剂材料葡萄糖氧化酶膜圈采用美国Sigma公司的葡萄糖氧化酶，经生物技术加工成固定化制成[5]。一个酶膜圈可以工作1000次以上，或连续使用一个多月不用更换；糊精浙江菱糊淀粉厂出品；葡萄糖糖化酶江阴星达生物工程有限公司出品的液体酶；缓冲溶液100mM磷酸缓冲液，pH6.0；葡萄糖标准液，山东省科学院生物研究所出品。其它药品均为分析纯。
最适pH实验不同pH的测定环境对葡萄糖糖化酶的活性测定的影响见附图4，本实验选用0.2mM的磷酸盐缓冲液。结果表明pH5.5时的测定值最高。但是考虑到葡萄氧化酶膜的稳定性和使用寿命，本测定系统选用pH6.0的缓冲液。
酶反应的动力学过程及测定参数的选择将不同活性单位的糖化酶样品分别注入反应池，记录酶反应过程中的数字增加量，反应时间180秒，每20秒读数、记录，计算出每20秒的增加数值结果如图5，图中测定1-6的糖化酶活性依次分别为500、400、300、200、100、50u./mL从图5可以看出不同活性单位的糖化酶样品，在一定的时间内的变化量不同。酶活性越高，变化速度越快，20秒内显示值增加越大，但是在20秒到140秒之间不同活性单位的糖化酶的反应速度基本是稳定的，因此，从进样20秒开始到140秒之间采样比较合适。
样品和底物中的游离葡萄糖对糖化酶活性单位测定的影响预加20uL500umL的糖化酶，再加5uL5％的糊精，以此测定结果定标为500，进行下述测定测定1预加20uL 500u/mL的糖化酶和10uL浓度为100mg/mL的葡萄糖后，再加5uL5％的糊精；测定2预加20uL 500u/mL的糖化酶和20uL浓度为100mg/mL的葡萄糖后，再加5uL5％的糊精测定3预加5uL 5％的糊精后，再加20uL 500u/mL的糖化酶和10uL浓度为100mg/mL的葡萄糖；测定4预加5uL5％的糊精后，再加20uL 500u/mL的糖化酶和20uL浓度为100mg/mL的葡萄糖，结果如表1所示。
表1、葡萄糖对测定结果的影响时间 20304050 60 70 80 100120140对照 285586112163218268318415500测定1305685112163218268314423501测定2305280122170214262316411499测定3255378106162215265311412501测定4255585108165213268318410500从上述结果看出采用本测定系统设计的测定程序测定糖化酶的活性单位时，样品和底物中所含的葡萄糖对糖化酶活性的测定结果不会产生干扰。
稳定性实验连续10次将100u/mL的糖化酶样品注入反应池，结果如表2所示表2连续进样10次的测定结果样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10结果 10010110199100100101 101 100 100对数据进行统计处理N＝10， X＝100.3S＝0.675CV＝0.67％结果证明，本测定系统对同一样品具有良好的稳定性。
线性实验依次取不同活性单位的糖化酶样品测定，结果如表3表3线性实验进样量(u/mL) 100120150200300375500线性标准误差结果1(u/mL)1031201512013013735001.344％结果2(u/mL)1161411682213203875024.645％测定结果1是先将仪器定标为500后，将测定系统进行了米氏校正后得到的测定结果2是定标为500后，测定系统没执行米氏校正得到的。
结果表明用本系统测定糖化酶时，先进行米氏校正后，进样量在100-500u/mL之间的不同酶量表现出良好的线性关系，计算得到线性标准误差为1.344％；而不进行米氏校正测得的结果的线性标准误差为4.645％。
回收实验将样品中加入一定量的已知活力糖化酶，作回收率实验，结果如表4所示。
表4回收率实验样品酶量加入酶量 测得酶量回收率样品(u/mL) (u/mL)(u/mL) (u/mL)1 100 50.3 151.0 101.42 100 99.7 201.0 101.33 100 149.8 248.5 99.14 100 199.4 299.0 99.85 100 251.8 345.0 97.36 100 149.8 246.2 97.67 100199.4 295.0 97.88 100 251.8 351.5 99.9结果表明，回收率在97.6％～101.4％之间，标准偏差为1.68％。
测定有关糖化酶的样品，并同碘量法进行比较对结果进行t检验，结果如下t＝1.652 t0.05(11)＝2.201t＜t0.05(11) p＞0.01传统的糖化酶测定方法中是根据还原糖测定的原理来计算糖化酶反应产生的葡萄糖，在实际分析中可能会有一定的误差，不能真实反映糖化酶的活性单位和糖化酶的质量，而且该方法测定时间过长，操作比较繁琐，人为误差大。本发明建立的方法快速、准确，操作简单，直接测定葡萄糖的产生量来表示糖化酶活性单位，专一性好，结果可靠。
参考文献[1]天津轻工学院等主编工业发酵分析，轻工业出版社，1991，北京。
Betriebsinterne Mitteilung der Fa.Amano，Nagya[3]Betriebsinterne Mitteilung der Fa.Novo，Kpenhagen，Danemark[4]Yellow Spring Instrument Co.，Inc.U.S.A.Application NoteNo.114[5]冯德荣等，山东科学1990，3(3)1-权利要求
1.一种快速测定糖化酶活力的方法，其特征在于根据 这一反应过程，在葡萄糖氧化酶活力不变，并且糊精过量的条件下，一定时间内H2O2的生成量与糖化酶的活力成正比，利用这一原理，设定的测定系统中反应池腔(4)侧面装有过氧化氢电极(6)，电极表面为固定化的葡萄糖氧化酶膜圈(5)，反应池腔(4)中有搅拌子(9)通过磁力搅拌器(10)使参与反应的糊精和糖化酶充分混匀，糊精底物和糖化酶通过进样口(1)加入到反应池内，光控进样传感器(2)检测到底物和糖化酶的加入，控制测定程序运行，反应结束后仪器自动完成清洗，缓冲液从缓冲液入口(14)通过连接管道，经缓冲液泵(11)进入反应池腔(4)，多余液体从锥形溢流帽(15)排出进入废液腔(3)，最后通过废液泵(12)经废液出口(13)排出；测定系统的二次仪表是用单片机作中央控制器，控制采样、信号放大、A/D转换、清洗、搅拌、数据贮存和结果打印等功能；系统通过测定H2O2电极对已知活力的葡萄糖糖化酶的响应电流进行定标和线性校正，在测定糖化酶样品时通过校正运算，直接得到样品的糖化酶活力单位。
全文摘要
本发明公开了一种快速测定糖化酶活力的方法，该方法根据酶促反应生成过氧化氢量与糖化酶作用于糊精产生的葡萄糖量成正比这一原理，设计的测定系统的反应池腔侧面装有过氧化氢电极，电极表面为固定化的葡萄糖氧化酶膜，反应池腔设有电磁搅拌器，底物和样品通过进样口加入，光控进样传感器检测加样动作，缓冲液通过缓冲液泵进入反应池腔，通过锥形溢流帽流入废液腔并经废液泵排出；测定系统的二次仪表具有信号采集与放大、A/D转换、清洗、搅拌、数据贮存和结果打印等功能，通过定标和线性校正操作，仪器可直接得到糖化酶的活力单位。本发明建立的方法专一性好、结果可靠、操作简单，在3分钟之内即可完成测定，用于生产过程的监控十分有效。
文档编号C12Q1/25GK1524965SQ03139048
公开日2004年9月1日 申请日期2003年9月16日 优先权日2003年9月16日
发明者冯德荣, 朱思荣, 周万里, 冯东 申请人:山东省科学院生物研究所