专利名称：非典型肺炎冠状病毒的基因检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测技术领域，更具体地涉及非典型肺炎冠状病毒的基因检测方法及试剂盒。
背景技术：
2003年我国和世界上许多国家遭到了一次大规模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵袭，由非典型肺炎引起的严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已经在22个国家和地区发生。世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)在疫情发生后迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。4月16日，WHO正式确认SARS的病原体是一种新型冠状病毒，这是一种单链RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些发病区其死亡率达到15％，给人民群众带来了极大的恐慌。及时开展SARS冠状病毒的病原学以及预防、诊断和治疗的研究，加强控制和治疗措施、对患者和疑似病例做到早发现、早隔离和早治疗，是控制疫情继续发生和传播的关键。
人体感染SARS病毒后，经过一定时间后能产生相应的抗体，可以通过抗原-抗体反应来检测血清中的抗体。用免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验等方法可以检测针对SARS病毒的特异性抗体。但是这种抗体出现较晚，一般要到感染后20天左右，不利于病毒感染的早期诊断。
诊断SARS最直接的方法是检测病人体内的病原体，可以利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)来检测病毒的遗传物质。逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)首先将标本中少量的SARS病毒RNA逆转录成DNA，再通过基因扩增将核酸放大几百万倍，可通过电泳或荧光定量检测，应用于在感染早期(10天内)检测人体呼吸道分泌物、血液、血清、尿液、粪便或死亡患者尸体解剖样品中SARS病毒的核酸，具有简便快速、特异性强等特点。
然而，由于在获取的生物样品中，SARS病毒的含量非常少，而且血液、粪便、呼吸分泌物等待测样品还含有大量其他的核酸物质。因此，这给有效扩增SARS特异性产物带来了极大的困难，在实验中往往造成假阴性的结果。
因此，本领域迫切需要开发新的快速、准确地检测SARS病毒的技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种快速、准确地检测SARS病毒的新方法和相关试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种标本中SARS病毒的浓缩方法，更佳地用PEG进行浓缩。例如用分子量为5000-25000道尔顿，如6000、8000、20000的PEG进行浓缩，尤其是分子量为20000的PEG进行浓缩。
在本发明的第二方面，提供了一种非典型肺炎冠状病毒特异性扩增的方法，它包括如下步骤(a)抽提样品中的病毒RNA；(b)用SEQ ID NO1和2所示的特异性引物和步骤(a)中的核酸，在特异性扩增条件下进行荧光RT-PCR扩增。
在本发明的第三方面，提供了一种对特异性扩增产物进行检测的方法，它包括如下步骤(c)对步骤(b)的产物进行荧光定量检测；(d)对部分荧光定量检测结果为阴性的步骤(b)的扩增产物，用SEQ IDNO3和4所示的特异性引物，在特定扩增条件下进行第二次PCR扩增；(e)对步骤(d)的PCR产物进行电泳，显示有特异性条带就表示样品中存在非典型肺炎冠状病毒。
在本发明的第四方面，提供了一种检测非典型肺炎冠状病毒的试剂盒，它含有浓缩标本的试剂、SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的引物、SEQID NO5所示核苷酸序列的Taqman探针。所述的试剂盒还含有制备模板所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有SEQ ID NO3和4所示的核苷酸序列的巢式PCR引物。
图1显示了实施例3中各标本的荧光定量PCR曲线。
图2显示了电泳检测图。其中泳道1为阴性对照；泳道2为阳性对照；泳道3、4均为第5号标本；泳道5为分子量标准物。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，首先利用PEG沉淀法浓缩标本中的病毒，设计合成了SARS特异性引物，通过荧光定量RT-PCR，结合巢式PCR，实现了SARS病毒的快速、准确的早期检测，在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人根据香港、广州、北京、多伦多等不同地区所分离的冠状病毒株的基因组序列，选择了CUHK-W1株P基因(编码病毒的聚合酶蛋白)18138bp-18294bp的157个碱基作为靶核苷酸，其序列如下所示atgaattacc aagtcaatgg ttaccctaat atgtttatca cccgcgaaga agctattcgt60cacgttcgtg cgtggattgg ctttgatgta gagggctgtc atgcaactag agatgctgtg120ggtactaacc tacctctcca gctaggattt tctacag 157(SEQ ID NO6)对以上157个碱基在Genebank中Blast的结果可知，该靶序列保守性很高，除广州株有一个碱基的差异外，其它序列均为同源。
根据SEQID NO6所示的序列，本发明设计和合成了以下RT-PCR的引物SARS-Fs5′-ATG AAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC-3′(SEQ ID NO1)SARS-Fas5′-CTG TAG AAA ATC CTA GCT GGA G-3′(SEQ ID NO2)实时荧光定量PCR是在PCR基础上发展起来的新技术，它利用了Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针，可对模板进行准确定量。一种优选的TaqMan探针的序列如下5′-FAM-TCG TGC GTG GAT TGG CTT TGA TGT-TAMRA-3′(SEQ ID NO5)其中，荧光发射基团和荧光淬灭基团可采用本领域常用的种类，例如荧光发射基团可采用6-羧基荧光素(FAM)，而荧光淬灭基团可采用6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)。
对于荧光定量检测结果为阴性的可疑样品，可以将荧光RT-PCR产物进行第二次扩增。在本发明的检测方法中，它可以有效提高检测的灵敏度。
在本发明中，非典型肺炎冠状病毒特异性巢式引物的序列对应于SEQ IDNO6所示的核苷酸序列，且长度为18-30bp(较佳地19-25bp)。一种优选的巢式PCR的引物如下SARS-ins5-GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG-3(SEQ ID NO3)SARS-Fas5-CTG TAG AAA ATC CTA GCT GGA G-3(SEQ ID NO4)当使用SEQ ID NO3和4所示的巢式引物时，扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳，在109bp处有特异性条带的标本可判为阳性结果，否则判为阴性结果。采用上述方法有利于非典型肺炎SARS冠状病毒的早期诊断。检测快速，一般4小时可得结果。
在本发明方法中，对PCR扩增条件并没有特别的限制，可以采用本领域常规的特异性PCR扩增条件。
在本发明方法中，RNA的提取是非常重要的。由于某些样品中所含病毒数量较少，在PCR检测中容易引起假阴性。一种优选的方法是用PEG沉淀RNA的方法来富集样品中的冠状病毒。样品沉淀物经RNA抽提后，在特异性引物、SuperscriptII逆转录酶、DNA Taq酶、荧光标记探针等的作用下进行荧光RT-PCR扩增。
本发明还提供了一种检测非典型肺炎冠状病毒的试剂盒，它含有浓缩标本的试剂、SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的引物、SEQ ID NO5所示核苷酸序列的Taqman探针。所述的试剂盒还含有制备模板所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂。
如本文所用，“制备模板所需的试剂”指将检测样本中的RNA提取纯化过程所用的试剂。例如Qiagen公司病毒RNA抽提试剂。
如本文所用，“进行PCR扩增所需的试剂”指将模板中的极微量非典型肺炎冠状病毒基因进行PCR扩增反应过程所用的试剂，其中包括例如dNTP、耐高温DNA多聚酶、Mg2+、特异性引物、和缓冲液等。
本发明的主要优点在于(a)对标本进行PEG浓缩处理，增加了标本中病毒的数量。
(b)产物检测采用荧光定量法，并与巢式PCR结合，提高了检测灵敏度。
荧光定量灵敏度103拷贝/ml；巢式PCR灵敏度102拷贝/ml。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1样本的浓缩取20％PEG溶液170ul加入1.5ml的离心管内，加入样本500ul，再加入10.2ul浓度为20％的硫酸，振荡混匀5s；4℃放置过夜，4℃离心17860g，20min；弃去上清液，4℃离心17860g，1min。用可调移液器小心吸去多余的上清液，沉淀用于样本抽提。
实施例2样本抽提采用Qiagen公司病毒RNA抽提试剂盒，按制造商提供的说明书操作。
实施例3荧光RT-PCR扩增引物采用SARS-Fs5-ATG，AAT，TAC，CAA，GTC，AAT，GGT，TAC-3(SEQ ID NO1)SARS-Fas5-CTG，TAG，AAA，ATC，CTA，GCT，GGA，G-3(SEQ ID NO2)TaqMan探针采用5′-FAM-TCG，TGC，GTG，GAT，TGG，CTT，TGA，TGT-TAMRA-3′(SEQ ID NO5)RT-PCR扩增试剂RT-PCR主反应液(含引物、dNTP/dUTP、探针、Mg2+等)RT-PCR酶混合液(含Superscript II逆转录酶、Taq酶和RNA酶抑制剂的溶液)尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)操作将33.8ul RT-PCR主反应液融化、混匀后简短离心，与0.8ulRT-PCR酶混合液、0.4ul UNG充分混合，在反应管中分别加入已处理好的样品滤液和工作标准品，盖上盖子，离心数秒后放入iCycler(Roche公司)中进行扩增。
结果获取选择荧光基团FAM-490，获取荧光结果，如图1和表1所示。
表1荧光RT-PCR检测结果
Ct值循环阈值N/A未检测到信号+判断结果为阳性-判断结果为阴性标本设置1为RNA阳性参考品；2为正常人的阴性血清；3、4为上海2例临床确证的SARS患者的血清。标本号5为某SARS可疑病人的血清。
该结果表明，3、4号标本检测结果为阳性，5号标本荧光定量检测结果虽然为N/A，但是结合其荧光定量检测曲线，结果可疑。
实施例4巢式PCR对于实施例3中荧光定量检测结果为阴性的可疑样品，可以将荧光PCR产物进行巢式PCR，巢式PCR的引物采用SARS-ins5-GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG-3(SEQ ID NO3)SARS-Fas5-CTG TAG AAA ATC CTA GCT GGA G-3(SEQ ID NO4)PCR扩增试剂2ndPCR Taq聚合酶2ndPCR反应液(含引物、dNTP/dUTP、Mg2+等)UNG操作将27.4ul 2ndPCR反应液融化，混匀后简短离心，与0.3ul 2ndPCR Taq聚合酶、0.3ul UNG充分混合，在反应管中加入可疑的荧光PCR产物2ul，放入PCR仪中进行扩增。
结果如图2所示，5号标本在109bp处有特异性条带，为SARS阳性。
实施例5非典型肺炎冠状病毒检测试剂盒为方便上述PCR检测，特制成一种非典型肺炎冠状病毒的基因检测试剂盒，该试剂盒包含下列试剂(1)样品病毒富集试剂20％PEG溶液(溶于0.9％NaCl溶液)(2)病毒RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)(3)RT-PCR试剂RT-PCR主反应液1×缓冲液2.5mM MgCl20.2uM引物SARS-Fs(SEQ ID NO1)0.2uM引物SARS-Fas(SEQ ID NO2)0.2mM dNTP0.2mM dUTP0.1uM探针RT-PCR酶混合液2U/ul Superscript II逆转录酶0.05U/ul Taq DNA聚合酶0.01U/ul UNG(4)巢式PCR试剂反应液1×缓冲液2.5mM MgCl20.2uM引物SARS-ins(SEQ ID NO3)0.2uM引物SARS-Fas(SEQ ID NO4)0.2mM dNTP
0.2mM dUTP0.05U/ul 2ndPCR Taq聚合酶0.01U/ul UNG(5)电泳试剂50×电泳缓冲液溴酚蓝缓冲液2％凝胶溴乙锭阳性参照物。
实施例6浓缩对检测结果的影响用不同分子量的PEG，按照实施例1的方法对检测样品进行浓缩。并按实施例2-4的方法进行RNA抽提、荧光RT-PCR扩增。与未经过浓缩处理，但同样进行抽提、荧光RT-PCR扩增的检测结果进行比较。
结果如下表所示
其中，标准品1、标准品2、标准品3用于确定标准曲线。未经浓缩处理的样品原液的测定值为4.27×102拷贝/ml，而用PEG20000、PEG8000和PEG6000浓缩处理后，测定值提高到2.07×105、4.81×104、和5.80×104拷贝/ml，其中尤其以PEG20000的浓缩效果最佳。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海复旦悦达生物技术有限公司<120>非典型肺炎冠状病毒的基因检测方法及试剂盒<130>033384<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>1atgaattacc aagtcaatgg ttac 24<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>2ctgtagaaaa tcctagctgg ag 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)
<223>引物<400>3gaagctattc gtcacgttcg 20<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>引物<400>4ctgtagaaaa tcctagctgg ag 22<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>探针<400>5tcgtgcgtgg attggctttg atgt 24<210>6<211>157<212>DNA<213>非典型肺炎病毒(SARS virus)<400>6atgaattacc aagtcaatgg ttaccctaat atgtttatca cccgcgaaga agctattcgt 60cacgttcgtg cgtggattgg ctttgatgta gagggctgtc atgcaactag agatgctgtg 120ggtactaacc tacctctcca gctaggattt tctacag 15权利要求
1.一种检测样品中是否存在非典型肺炎冠状病毒的方法，其特征在于，包括步骤(a)应用PEG沉淀法对标本进行浓缩；(b)抽提样品中的病毒RNA，用特异性引物在特定的扩增条件下进行荧光RT-PCR扩增；(c)对扩增产物进行荧光定量检测，对部分荧光定量检测结果为阴性的可疑标本，用特异性巢式引物进行第二次PCR扩增；(d)对步骤(c)的PCR产物进行电泳，存在特异性扩增产物就表示样品中存在非典型肺炎冠状病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光RT-PCR的引物具有SEQID NO1和2所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的巢式引物具有SEQ ID NO3和4所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PEG沉淀法中使用分子量为5000-25000的PEG。
5.一种检测非典型肺炎冠状病毒的试剂盒，其特征在于，它含有SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有SEQ ID NO3和4所示核苷酸序列的巢式引物。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有制备模板所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有SEQ ID NO5所示核苷酸序列的Taqman探针。
9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有浓缩标本病毒的PEG试剂。
10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PEG的分子量为5000-25000。
全文摘要
本发明提供了用于非典型肺炎冠状病毒基因检测的标本浓缩、RT－PCR扩增、产物检测的方法及试剂盒。该方法包括(a)应用PEG沉淀法浓缩标本；(b)抽提样品中的病毒RNA，用特异性引物进行荧光RT－PCR扩增；(c)对扩增产物进行荧光定量检测，部分荧光定量检测结果为阴性的可疑标本，用特异性巢式引物进行第二次PCR扩增；(d)对步骤(c)的PCR产物进行电泳，存在特异性扩增产物就表示样品中存在SARS冠状病毒。本发明方法和试剂盒可快速、准确地检测SARS病毒。
文档编号C12Q1/68GK1570139SQ03141839
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者袁正宏, 胡芸文 申请人:上海复旦悦达生物技术有限公司, 复旦大学