专利名称：异基因骨髓间充质干细胞移植嵌合模型的建立、鉴定及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及异基因骨髓源间充质多能干细胞的制备及鉴定方法，具体涉及一种建立以异基因骨髓源间充质多能干细胞诱导稳定嵌合体及免疫耐受形成进而使异基因皮肤移植物长期存活的模型的方法。本发明还涉及一种在异基因组织器官移植受体体内诱导稳定嵌合，形成免疫耐受，进而使异基因移植物长期存活的方法。本发明还涉及一种可诱导异基因组织器官移植免疫耐受形成的骨髓源间充质多能干细胞的制备方法。
背景技术：
异体器官移植是目前治疗难治性终末器官性疾病的有效手段之一。而移植排斥反应仍然是影响器官移植成功的主要原因。目前普遍认为，解决异体移植排斥反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官产生持久的免疫耐受，即受体免疫系统对移植物抗原产生特异性免疫无反应性。为此，人们进行了长期不懈的努力。迄今为止，众多研究者已探索了多种诱导免疫耐受的途径，如利用MHC肽段的封闭作用(see Benichou G et al.Indirect T-cell allorecognition perspectivesfor peptide-based therapy in transplantation.Immunol Today，1997，1867-71)、阻断共刺激通路、调节Th细胞转换等手段阻断抗移植物特异性免疫应答诱导免疫耐受(see Im SH，Barchan D，Souroujon MC，et al.Role of tolerogen conformation ininduction of oral tolerance in experimental autoimmune myasthenia gravis.JImmunol，2000m，1653599-3605.；Shimizu K，Schonbeck U，Mach F，et al.HostCD40 ligand deficiency induces long-term allograft survival and donor-specifictolerance in mouse cardiac transplantation but does not prevent graft arteriosclerosis.JImmunol，2000，1653506-3518.；Blancho G，Gianello PR，Lorf T，et al.Molecularand cellular events implicated in local tolerance to kidney allografts in miniatureswine.Transplantation，1997，6326-33.)；清除杀伤性淋巴细胞诱导免疫耐受(seeSasaki H，Xu XC，Smith D，et al.HLA-G expression protects poreine endothelialcells from xenogeneic cytotoxicity mediated by human natural killer cells.TranslantProc，1999，31953-954.；Carosella ED.HLA-Gfetomaternal tolerance.C R Acad SciIII，2000，323675-680.；Horuzsko A，Lenfant F，Munn DH，et al.Maturation ofantigen-presenting cells is compromised in HLA-G transgenic mice.IntImmunol，2001，13385-394.8 Borghans JA，De Boer RJ.Crossreactivity of the T-cellreceptor.Immunol Today，1998，19428-429.；Borghans JA，Boer RJ，Sercarz E，er al.Tcell vaccination in experimental autoimmune encephalomyelitisa mathe-maticalmodel.J Immunol，1998，1611087-1093.)；建立受体体内嵌合体诱导免疫耐受(see Reinsmoen NL，Jackson A，McSherry C，et al.Organ-specific patterns ofdonor antigen specific hyporeactivity and peripheral blood allogeneic microchimerismin lung，kidney，and liver transplant recipients.Transplantation，1995，601546-1554.；Pham SM，Mitruka SN，Youm W，et al.Mixed hematopoietic chimerism inducesdonor-specific tolerance for lung allografts in rodents.Am J Respir Crit Care Med，1999，159199-205.；Levy AE，Alexander JW，Babcock GF.A strategy for generatingconsistent long-term donor-specific tolerance to solid organ a1lografts.TranspImmunol，1997，583-88.；梁晓燕，陈宗佑，钱诗光，等，术前输注供者CD80low/CD86low树突状细胞延长小鼠同种异体移植心脏存活。中国病理生理杂志，2000，161249-1254.；Thomas Wekerle.Transplantation tolerance induced bymixed chimerism.The J Heart and Lung Transp，2001，20，8817-823.)。
其中，关于嵌合体的建立，人们已尝试于术前移植供体骨髓或输注供体血液的方法(see Reinsmoen NL，Jackson A，McSherry C，et al.Organ-specific patternsof donor antigen specific hyporeactivity and peripheral blood allogeneicmicrochimerism in lung，kidney，and liver transplant recipients.Transplantation，1995，601546-1554.；Pham SM，Mitruka SN，Youm W，et al.Mixed hematopoieticchimerism induces donor-specific tolerance for lung allografts in rodents.Am J RespirCrit Care Med，1999，159199-205.)。他们认为骨髓和血液中含大量造血干细胞，具有很强的增殖与分化潜能，容易形成嵌合体进而诱导免疫耐受。但要使骨髓移植成为诱导器官移植耐受的主流，目前来说还不太可能，因为骨髓移植前的免疫抑制处理就是一个很大的障碍；此外，致死剂量照射后的机会感染，骨髓移植后可能出现的排斥反应，移植物抗宿主反应等等目前都还无法解决。胚胎干细胞虽然可以诱导免疫耐受，但存在着众所周知的伦理学方面的问题。因此，寻找一个更好的能诱导嵌合体形成的细胞群体，是当务之急。
近年来有文献报道骨髓源间充质多能干细胞可以在体外非特异性的抑制混合淋巴细胞培养和有丝分裂原诱导的T细胞增殖；在体内实验中，观察到间充质多能干细胞可延长皮肤移植物存活时间，还能促进异基因骨髓、骨及其它组织的移植物存活(see Kevin M，Amelia B.Stromal cell modulation of the immunesystem.Graft，2000，3324-328.；Bartholomew A，Sturgeon C，Siatskas M，Ferrer K，etal.Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolongskin graft survival in vivo.Exp Hematol.2002；342-48.)。我们研究室建立了比较稳定的骨髓源间充质多能干细胞的培养体系。对此类细胞进行了体内和体外诱导分化试验，表明培养的骨髓源间充质多能干细胞可在体内和体外重建造血(参见呼莹，马丽，马冠杰，等。具骨髓间充质多能干细胞表型的成体干细胞移植造血。中国医学科学院学报，2002，2420-24.)。但关于间充质多能干细胞能否诱导稳定嵌合体的形成、能否诱导针对供者源组织器官的特异性免疫耐受的发生以及其是否可以使再次异基因器官移植长期存活目前均未见报道。
发明内容
本发明旨在填补现有技术的空白，提供一种建立异基因骨髓源间充质多能干细胞诱导稳定嵌合体及免疫耐受形成进而使异基因皮肤移植物长期存活的模型的方法。本发明还提供了一种在异基因组织器官移植受体体内诱导稳定嵌合，形成免疫耐受，进而使异基因移植物长期存活的方法。本发明还提供了一种制备可诱导异基因组织器官移植免疫耐受形成的骨髓源间充质多能干细胞的方法。
本发明的建立模型的方法的技术方案可通过以下步骤实现(一)实验模型构建的技术方案自成年BALB/C小鼠的骨髓中分离获得并体外培养扩增原始多能间充质多能干细胞，对其表型进行鉴定；并将适量的供体BALB/C小鼠骨髓源多能间充质多能干细胞和一定量的C57BL/6小鼠骨髓细胞共同植入经致死量照射的成年C57BL/6小鼠体内。150天后检测受者骨髓及脾脏的T细胞嵌合状态；然后进行异基因皮肤移植实验并进行MLR和ConA诱导增殖实验以检测受者体内产生的针对供者源组织的特异的免疫耐受，得小鼠原始骨髓源间充质多能干细胞诱导稳定嵌合体及免疫耐受形成模型。
(二)实验模型构建的具体步骤1供体小鼠骨髓源间充质多能干细胞的制备将6-8周龄的雄性BALB/C小鼠(购于北京大学医学部实验动物中心)脱脊处死，无菌取其后肢的胫骨和股骨，以预冷的D-Hank’s液D-Hanks液配方(g/L)0.4g KCl、0.06g KH2PO4、8.00g NaCl、0.35g NaHCO3、0.12g Na2HPO4.12H2O、0.01g酚红，加超纯水至1000ml冲出骨髓细胞，经反复吹打分散细胞后，使之成单细胞悬液。用D-Hank’s液和不完全RPMI1640培养液(购于LIFETECHNOLOGIES公司)各洗涤细胞一次(离心条件均为1000rpm、10min)，经Ficoll(购于中国医学科学院血液学研究所)密度梯度离心获得单个核细胞，经磁珠法(购于MACS公司)去除CD45+Ter119+细胞，然后加入特制的培养基(此培养基含DMEM、F12、MCDB-201、2％FBS、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-bb和10ng/ml LIF等成分，均购于sigma公司)，按3×105/cm2接种至培养瓶中，置于37℃5％CO2培养箱中培养。24-48小时后，弃除悬浮细胞，加入新鲜培养基继续培养，2-3天换液一次，至细胞80-90％汇合后，以含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化3分钟，传代培养。表型鉴定和后续实验所用细胞均为第二代细胞。而且，在移植前细胞经MACS去除Sca-1+细胞。
2供体小鼠骨髓细胞的制备将7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(购于中国军事医学科学院动物部)脱脊处死，无菌取其后肢的胫骨和股骨，以预冷的D-Hank’s液冲出骨髓细胞，经反复吹打分散细胞后，使之成单细胞悬液。以EDTA-NH4Cl配方(g/L)8.29g NH4Cl、1.0012g KHCO3、29.225mg EDTA，加超纯水至1000ml去除红细胞，再以D-Hank’s液洗涤二次(离心条件均为1000rpm、10min)。用0.2％台盼兰染色按常规方法计算活细胞率，并以PBS调整细胞至所需浓度备用。
3受体小鼠的准备将7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠进行致死量照射(Gammacell 40、CES IUM137、Atomic Energy of Canada Limited Radiochemical公司)，照射剂量为850Rad。4骨髓移植将1×107的雌性C57BL/6小鼠的骨髓细胞和5×105的雄性BALB/C骨髓源间充质多能干细胞共同经尾静脉植入经上述处理的受体小鼠体内。
5统计学分析数据分析采用SPSS 11.0软件配对T检验。
(三)构建的实验模型的检测1培养的原始骨髓源间充质多能干细胞的表型测定①CD34、MHC I、MHC II、CD45和CD44、CD13、CD29表型检测将贴壁细胞消化，调整细胞浓度为5×105/管，各管细胞分别以适当浓度的FITC标记的单克隆抗体(mAb)进行染色，染色体系终体积为50μl，所用mAb包括FITC标记的CD13、CD34、CD44、CD29、MHCI和MHCII类抗原；以FITC标记的大鼠IgG为同型对照(所有单抗均购于BD公司)。染色条件为4℃ 45分钟。用流式细胞仪(FACS Calibur型)检测。结果显示CD34、MHC I、MHC II、CD45均为阴性；低表达CD13；高表达CD44和CD29，见图1。
②Flk-1表型检测将贴壁细胞消化，调整细胞浓度为5×105/管，共两管，一为对照管，另一为实验管。以0.1％皂素1ml室温破膜1小时，以PBA洗液洗涤2次，离心后，弃上清；实验管中加入Flk-1mAb(购于BD公司)，对照管中加入无关单抗(购于BD公司)，4℃过夜。以PBA洗液洗涤两次，两管中各加入FITC标记的二抗(购于BD公司)，4℃45分钟，以PBA(含1％BSA和0.01％叠氮钠的PBS)洗液洗涤两次，以染色缓冲液定容至0.5ml。用流式细胞仪检测。结果可见Flk-1表达率为91.57％，见图1。
2流式细胞仪测定嵌合H-2Kd和CD3双阳性细胞的检测分别制备骨髓源间充质多能干细胞移植小鼠的脾脏和骨髓的单个核细胞悬液，溶红细胞后进行抗体染色。参考厂家提供的说明书。取适量的上述两种细胞，加入生物素化的抗H-2Kd单抗孵育过夜，以洗液(含1％BSA和0.01％叠氮钠的PBS)洗涤两次，然后加入适当稀释后的FITC-链霉亲和素和PE-CD3单抗，以PE-大鼠IgG同型对照为对照，4℃孵育45分钟。用上述洗液洗涤细胞两次。流式细胞仪测定。结果如图2所示，脾脏中H-2Kd和CD3双阳性的细胞占5.97％，骨髓中阳性细胞为0.87％，提示骨髓源间充质多能干细胞移植后150天，外周血中仍存在供者来源的细胞，形成了稳定的T细胞嵌合体。一般认为供体来源T细胞比例＞5％，稳定存在100天以上为稳定嵌合(Fandrich F，Lin X，Chai GX，et al.Preimplantation-stage stem cells inducelong-term allogeneic graft acceptance without supplementary host conditioning.Nature Med 2002；8171-178.)。
3异基因供者来源皮肤移植实验将供体BALB/C小鼠用0.5％戊巴比妥钠(70mg/kg体重)麻醉后，10％硫化钠脱毛处理，酒精消毒，取胸背部皮肤，放入预冷的D-Hank’s液中备用。然后以同样方法将骨髓源间充质多能干细胞移植C57BL/6小鼠和未处理C57BL/6小鼠麻醉、脱毛、消毒，在胸背部做移植床，将供体BALB/C小鼠皮肤移植到移植床上，缝合，包扎。置于无菌条件下饲养，7天后，拆除敷料，连续观察移植物存活情况。90天后皮肤移植物仍存活，未出现移植物抗宿主病(GVHD)现象，也没有观察到慢性排斥反应，见图3。未处理组C57BL/6小鼠的皮肤移植物在移植后8-9天出现排斥现象。
4混合淋巴细胞培养实验分别制备刺激细胞(BALB/C小鼠脾细胞)和效应细胞(骨髓源间充质多能干细胞移植组C57Bl/6小鼠脾细胞和未处理组C57BL/6小鼠脾细胞)，溶红细胞后调整细胞浓度为5×106。在96孔U型底培养板中加入刺激细胞，100μl/孔，照射30Gy后，再加入效应细胞，100μl/孔，对照孔不加效应细胞。共培养5天。培养结束前18小时，加H3-TdR，1μCi/孔，培养结束后，用Liquid scintillation &luminescence counter仪测定。结果计算刺激指数(stimulating index，SI)＝刺激管cmp/对照管cmp均值。结果显示骨髓源间充质多能干细胞移植组小鼠MLR的SI(刺激指数)均值为1.793，未处理组C57BL/6小鼠MLR的SI均值为7.278，将骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠MLR的SI值和未处理组C57BL/6小鼠MLR的SI值进行配对T检验，P＝0.022(P＜0.05)，有显著性差异，见图4。提示骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠只对供者源组织(BALB/C)具有低反应性。
5有丝分裂原诱导增殖实验分别制备骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠脾细胞和未处理组C57BL/6小鼠脾细胞，溶红细胞后调整细胞浓度为5×106。在96孔U型底培养板中加入上述细胞，100μl/孔，实验孔中加入ConA(购于SIGMA公司)，终浓度为5μg/ml。对照孔不加ConA。共培养3天。培养结束前18小时，加H3-TdR(购于上海原子核研究所)，1μCi/孔，培养结束后测定及计算方法同前。结果显示骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠的SI均值为31.92，未处理组C57BL/6小鼠的SI均值为34.99，同样将骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠ConA诱导的SI值和未处理组C57BL/6小鼠ConA诱导的SI值进行配对T检验，P＝0.417(P＞0.05)，无显著性差异，见图4。提示骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠对其他抗原(如ConA)的反应与未处理组C57BL/6小鼠相比无明显差异。
本发明的一种在异基因细胞、组织或器官移植受体体内诱导稳定嵌合，形成免疫耐受，进而使异基因移植物长期存活的方法的技术方案可通过以下步骤实现自供体(BALB/C小鼠)骨髓中分离获得并体外培养扩增原始多能间充质干细胞，对其表型进行鉴定；并将适量的供体骨髓源多能间充质干细胞和一定量的受体(C57BL/6小鼠)骨髓细胞共同植入免疫系统已被基本破坏的受体体内，遂可在受体体内诱导产生稳定的T细胞嵌合体，形成免疫耐受，进而使异基因移植物长期存活。
术语“基本破坏”是指若不进行骨髓移植，经致死处理后的受体小鼠体内残留的骨髓细胞将不足以对受体小鼠产生免疫保护作用。所述“致死处理”包括通过致死量辐射、施用特异性毒素、施用附着于毒素或放射性同位素上的特异性单克隆抗体，或这些技术的结合等方法以基本上全部除去受体鼠的骨髓干细胞。经上述处理后，受体鼠体内可能仍会残留一些骨髓细胞，但由于其数量很少，因此若不进行骨髓移植，在一般实验室条件下受体鼠将无法存活。
本发明对免疫系统已被基本破坏的受体小鼠(C57BL/6)经尾静脉注射经表型鉴定的供体小鼠BALB/C(H-2Kd)的骨髓源间充质干细胞(5×105/100ul/只)和受体小鼠(C57BL/6)的骨髓细胞(1×107/100ul/只)。在150天后分别制备骨髓源间充质干细胞移植小鼠的脾脏和骨髓的单核细胞悬液，以流式细胞仪检测受体鼠骨髓及脾脏的T细胞嵌合状态，结果显示脾脏中H-2Kd和CD3双阳性的细胞占5.97％，骨髓中阳性细胞为0.87％，提示骨髓源间充质干细胞移植后150天，外周血中仍存在供者来源的细胞，形成了稳定的T细胞嵌合体一般认为供体来源白细胞比例＞5％，稳定存在100天以上为稳定嵌合(19 Fandrich F，LinX，Chai GX，et al.Preimplantation-stage stem cells induce long-term allogeneic graftacceptance without supplementary host conditioning.Nature Med 2002；8171-178.)。然后进行异基因皮肤移植实验；并进行MLR和ConA诱导增殖实验以检测受体小鼠体内产生的针对供者源组织的特异的免疫耐受状态，证实骨髓源间充质干细胞移植组C57BL/6小鼠只对供者源组织(BALB/C)具有低反应性。
本发明填补了现有技术的空白，首次提供了一种建立以异基因骨髓源间充质多能干细胞诱导稳定嵌合体及免疫耐受形成进而使异基因皮肤移植物长期存活的模型的方法。本发明还提供了一种在异基因组织器官移植受体体内诱导稳定嵌合，形成免疫耐受，进而使异基因移植物长期存活的方法以及一种制备可诱导异基因组织器官移植免疫耐受形成的骨髓源间充质多能干细胞的方法。
由于在本方法中同时移植了受者源的骨髓细胞，可使受者在经致死量照射后免疫能力有一定程度的恢复，出现机会感染的可能性大大下降；同时已公认的骨髓源间充质多能干细胞有较低的免疫原性，故移植后出现排斥反应的机率也较骨髓移植低得多。移植过程中未涉及供者来源的成熟的淋巴细胞，因此，间充质多能干细胞移植发生移植物抗宿主病的可能性不大，较骨髓移植可能更合理。本结果为免疫耐受的诱导提供了一个新的途径，也为异基因细胞、组织、器官移植(包括骨髓移植)的进一步发展开辟了一个新途径。
图1为培养的原始骨髓源间充质多能干细胞的表型FACS检测结果。
图2为BALB/C小鼠骨髓源间充质多能干细胞移植150天后C57BL/6受体小鼠脾脏及骨髓嵌合状态流式细胞仪检测结果。
图3为皮肤移植实验结果。
A为皮肤移植实验后14天移植的皮肤存活良好；B为皮肤移植后30天移植的皮肤存活良好，已长出毛发。
图4为MLR和ConA诱导增殖实验结果。
具体实施例方式
实施例1制备供体(BALB/C)小鼠骨髓源间充质多能干细胞，以FACS对培养扩增的bMSC进行表型检测。
将6-8周龄的雄性BALB/C小鼠(购于北京大学医学部实验动物中心)脱脊处死，无菌取其后肢的胫骨和股骨，以预冷的D-Hank’s液(D-Hanks液配方(g/L)0.4g KCl、0.06g KH2PO48.00g、NaCl、0.35g NaHCO3、0.12g Na2HPO4.12H2O、0.01g酚红，加超纯水至1000ml)冲出骨髓细胞，经反复吹打分散细胞后，使之成单细胞悬液。D-Hank’s液和不完全RPMI1640培养液(购于LIFETECHNOLOGIES公司)各洗涤细胞一次(离心条件均为1000rpm，10min)，经Ficoll(购于中国医学科学院血液学研究所)密度梯度离心获得单个核细胞，经磁珠法(购于MACS公司)去除CD45+Ter119+细胞，然后加入特制的培养基(此培养基含DMEM，F12、MCDB-201、2％FBS、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-bb和10ng/ml LIF等成分，均购于sigma公司)，按8×105/cm2接种至培养瓶中，置于37℃ 5％CO2培养箱中培养。24-48小时后，弃除悬浮细胞，加入新鲜培养基继续培养，2-3天换液一次，至细胞80-90％汇合后，以含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化3分钟，传代培养。表型鉴定和后续实验所用细胞均为第二代细胞。而且，在移植前细胞经磁珠法去除Sca-1+细胞。
骨髓源间充质多能干细胞的CD34、MHC I、MHC II、CD45和CD13、CD44、CD29表型检测将贴壁细胞消化，调整细胞浓度为5×105/管，各管细胞分别以适当浓度的FITC标记的单克隆抗体(mAb)进行染色，染色体系终体积为50μl，所用mAb包括FITC标记的CD13，CD34，CD44，CD29，MHCI和MHCII类抗原；以FITC标记的大鼠IgG为同型对照(所有单抗均购于BD公司)。染色条件为4℃45分钟。用流式细胞仪(FACS Calibur型)检测。结果显示CD34、MHC I、MHC II、CD45均为阴性；低表达CD13；高表达CD44和CD29，见图1。
骨髓源间充质多能干细胞的Flk-1表型检测将贴壁细胞消化，调整细胞浓度为5×105/管，共两管，一为对照管，另一为实验管。以0.1％皂素1ml室温破膜1小时，以PBA洗液洗涤2次，离心后，弃上清；实验管中加入Flk-1mAb(购于BD公司)，对照管中加入无关单抗(购于BD公司)，4℃过夜。以PBA洗液洗涤两次，两管中各加入FITC标记的二抗(购于BD公司)，4℃ 45分钟，以PBA(含1％BSA和0.01％叠氮钠的PBS)洗液洗涤两次，以染色缓冲液定容至0.5ml。用流式细胞仪检测。结果可见Flk-1表达率为91.57％，见图1。实施例2供体小鼠骨髓细胞的制备将7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(购于中国军事医学科学院动物部)脱脊处死，无菌取其后肢的胫骨和股骨，以预冷的D-Hank’s液冲出骨髓细胞，经反复吹打分散细胞后，使之成单细胞悬液，以EDTA-NH4Cl(配方(g/L)8.29g NH4Cl、1.0012g KHCO3、29.225mg EDTA，加超纯水至1000ml)去除红细胞，再以D-Hank’s洗涤二次(离心条件均为1000rpm，10min)。用0.2％台盼兰染色按常规方法计算活细胞率，并以PBS调整细胞至所需浓度备用。
实施例3骨髓移植将20只7-8周龄的C57BL/6小鼠随机分成两组，10只/组。两组小鼠均进行致死量照射(Gammacell 40，CES IUM 137，Atomic Energy of Canada LimitedRadiochemical公司)，照射剂量为850Rad。然后根据表1将的雌性C57BL/6小鼠的骨髓细胞(1×107/100ul/只)和雄性BALB/C小鼠的骨髓源间充质多能干细胞(5×105/100ul/只)共同经尾静脉植入经上述处理的受体小鼠体内。40天后，在10只处理组受体小鼠中，除有1只小鼠不明原因死亡外，其余9只小鼠的背部黑毛中出现了白毛，范围逐渐扩展到颈部和腹部；而对照组受体小鼠则未出现上述现象。
表1组别 输入的细胞 只数 毛色变化处理组异基因Flk-1+bMSCs+同基因骨 N＝10有白毛出现(9*)髓细胞对照组只输同基因骨髓细胞 N＝10无白毛出现10)*一只于细胞移植后第10天不明原因死亡实施例4用流式细胞仪检测嵌合状态在骨髓移植150天后随机抽取了3只处理组小鼠进行3批次检测。先将小鼠处死，取其脾脏及骨髓，制备成单细胞悬液，用抗H-2Kd单抗和CD3单抗检测双阳性细胞。3次实验结果相似。图2显示了其中一次实验结果。a和b为脾脏细胞，双阳性细胞占5.97％；c和d为骨髓细胞，双阳性细胞占0.87％。提示骨髓源间充质多能干细胞移植小鼠的外周血中形成了稳定的嵌合。
实施例5皮肤移植实验随机抽取了4只处理组小鼠进行了皮肤移植试验。
BALB/C小鼠骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠在细胞移植后5月进行BALB/C小鼠来源皮肤移植实验。将供体BALB/C小鼠用0.5％戊巴比妥钠(70mg/kg体重)麻醉后，10％硫化钠脱毛处理，酒精消毒，取胸背部皮肤，放入预冷的D-Hank’s液中备用。然后以同样方法将骨髓源间充质多能干细胞移植C57BL/6小鼠和未处理C57BL/6小鼠麻醉、脱毛、消毒，在胸背部做移植床，将供体BALB/C小鼠皮肤移植到移植床上，缝合，包扎。置于无菌条件下饲养，7天后，拆除敷料，连续观察移植物存活情况。观察到90天，4只实验小鼠异基因皮肤物仍存活。未出现GVHD现象，也没有观察到慢性排斥反应。图3显示4只皮肤移植实验成功小鼠中的1只的照片。A为皮肤移植实验后14天移植的皮肤存活良好；B为皮肤移植后30天移植的皮肤存活良好，已长出毛发(因在移植实验中未注意移植皮肤的头尾方向，将其横向放置，故移植皮肤的毛发与受者皮肤的毛发生长方向交叉)。未处理组C57BL/6小鼠的皮肤移植物在移植后8-9天出现排斥现象。
实施例6 H3增殖实验取3只皮肤移植实验成功(皮肤移植物存活至少90天)的小鼠进行3批次的H3增殖实验。
混合淋巴细胞培养实验分别制备刺激细胞(BALB/C小鼠脾细胞)和效应细胞(骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠脾细胞和未处理组C57BL/6小鼠脾细胞)，溶红细胞后调整细胞浓度为5×106。在96孔U型底培养板中加入刺激细胞，100μl/孔，照射30Gy后，再加入效应细胞，100μl/孔，对照孔不加效应细胞。共培养5天。培养结束前18小时，加H3-TdR，1μCi/孔，培养结束后，用Liquid scintillation& luminescence counter仪测定。结果计算刺激指数(stimulating index，SI)＝刺激管cmp/对照管cmp均值。结果显示骨髓源间充质多能干细胞移植组小鼠MLR的SI(刺激指数)均值为1.793，未处理组C57BL/6小鼠MLR的SI均值为7.278，将骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠MLR的SI值和未处理组C57BL/6小鼠MLR的SI值进行配对T检验(SPSS 11.0软件)，P＝0.022(P＜0.05)，有显著性差异，3批次实验结果一致，见图4。提示骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠只对供者源组织(BALB/C)具有低反应性。
有丝分裂原诱导增殖实验分别制备骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠脾细胞和未处理组C57BL/6小鼠脾细胞，溶红细胞后调整细胞浓度为5×106。在96孔U型底培养板中加入上述细胞，100μl/孔，实验孔中加入ConA(购于SIGMA公司)，终浓度为5μg/ml。对照孔不加ConA。共培养3天。培养结束前18小时，加H3-TdR(购于上海原子核研究所)，1μCi/孔，培养结束后测定及计算方法同前。结果显示骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠的SI均值为31.92，未处理组C57BL/6小鼠的SI均值为34.99，同样将骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠ConA诱导的SI值和未处理组C57BL/6小鼠ConA诱导的SI值进行配对T检验(SPSS 11.0软件)，P＝0.417(P＞0.05)，无显著性差异，3批次实验结果一致，见图4。提示骨髓源间充质多能干细胞移植组C57BL/6小鼠对其他抗原(如ConA)的反应与未处理组C57BL/6小鼠相比无明显差异。
权利要求
1.一种建立异基因骨髓源间充质多能干细胞移植诱导稳定嵌合及特异耐受模型的方法，其特征在于，所述方法包括自供体小鼠体内的骨髓中分离获得并体外培养扩增异基因多能间充质多能干细胞，对其表型进行鉴定；将适量的供体小鼠异基因骨髓源多能间充质多能干细胞和一定量的受体小鼠骨髓细胞一同植入经致死量照射的受体小鼠体内；检测受体小鼠的T细胞嵌合状态，并进行异基因皮肤移植实验和特异性免疫耐受状态的鉴定，得异基因骨髓源间充质多能干细胞移植诱导稳定嵌合及特异耐受模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体异基因骨髓源间充质多能干细胞具有CD34-、CD45-、MHC I-、MHC II-，CD13低表达和Flk-1、CD29、CD44高表达的表型。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体异基因骨髓源间充质多能干细胞中除去了具有Sca-1+表型和CD45+Ter119+表型的细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体特异性免疫耐受状态的鉴定为进行MLR和ConA诱导增殖实验。
5.一种在异基因细胞、组织或器官移植受体体内诱导稳定嵌合，形成免疫耐受，进而使异基因移植物长期存活的方法，其特征在于，所述方法包括在受体免疫系统被基本破坏的情况下，引入供体异基因骨髓源间充质多能干细胞和受体骨髓细胞；待受体体内形成稳定的T细胞嵌合后，将异基因移植物植入受体。
6.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述异基因移植物为皮肤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述供体异基因骨髓源间充质多能干细胞具有CD34-、CD45-、MHC I-、MHC II-，CD13低表达和Flk-1、CD29、CD44高表达的表型。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述供体异基因骨髓源间充质多能干细胞中除去了具有Sca-1+表型和CD45+Ter119+表型的细胞。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述受体免疫系统被基本破坏为给予受体致死量辐射。
10.一种可诱导异基因组织器官移植免疫耐受形成的骨髓源间充质多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括自异基因哺乳动物供体骨髓中分离获得并体外培养扩增多能间充质多能干细胞，除去具有Sca-1+表型和CD45+Ter119+表型的细胞，鉴定分离出具有CD34-、CD45-、MHC I-、MHCII-，CD13低表达和Flk-1、CD29、CD44高表达表型的间充质多能干细胞。
全文摘要
本发明涉及异基因骨髓源间充质多能干细胞的制备及鉴定方法，具体涉及一种建立以异基因骨髓间充质多能干细胞诱导稳定嵌合体及免疫耐受形成进而使异基因皮肤移植物长期存活的模型的方法。本发明还涉及一种在异基因组织、器官移植受体体内诱导稳定嵌合，形成免疫耐受，进而使异基因移植物长期存活的方法，包括在受体免疫系统被基本破坏的情况下，引入供体异基因骨髓源间充质多能干细胞和受体骨髓细胞；待受体体内形成稳定的T细胞嵌合后，将异基因移植物植入受体。本发明还涉及一种可诱导异基因组织器官移植免疫耐受形成的骨髓源间充质多能干细胞的制备方法。本发明可应用于异基因组织器官移植研究中。
文档编号C12N15/09GK1576364SQ0314188
公开日2005年2月9日 申请日期2003年7月29日 优先权日2003年7月29日
发明者赵春华, 邓为民, 韩钦 申请人:赵春华