专利名称：同位素标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种15N-L-天冬氨酸和15N-L-丙氨酸的制备方法，具体涉及利用微生物酶反应法制备同位素标记15N-L-天冬氨酸和15N-L-丙氨酸的方法。
背景技术：
氮-15(简称15N，下同)是氮元素的稳定同位素，作为示踪剂，它广泛应用于有机化学、生物化学、医学、药物学、农科等领域，尤其对生命科学的研究有极为重要的意义。特别是随着人类基因组序列图谱的测定和绘制完成，蛋白质的人工合成对推动世界上生命科学研究越来越重要，而15N-氨基酸在此过程中起到不可替代的独特示踪作用，其应用越来越广泛，市场前景良好。
由于这类产品产量小，纯度及丰度要求高，通常用化学合成法生产。通常，化学合成法生产的氨基酸是DL型氨基酸，再经酶法拆分得到L型氨基酸。往往生物领域需要的是L型氨基酸，D型氨基酸大都废弃，导致15N-无机原料的利用率极低，生产成本极高，销售价格极高。
常规L-天冬氨酸和L-丙氨酸，由于酶法反应步骤简单，副产氨基酸少，是目前常用的生产方法。但目前尚未看到由酶法生产同位素标记15N-L-天冬氨酸和15N-L-丙氨酸的方法。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是公开一种利用含有天冬氨酸酶的游历细胞将含有同位素标记氮15(15N)的无机原料和碳源经酶法合成15N-L-天冬氨酸的方法；本发明需要解决的技术问题之二是公开一种利用含有天冬氨酸β-脱羧酶的游历细胞将含有15N-L-天冬氨酸经酶法转化为15N-L-丙氨酸的方法。
本发明制备同位素标记15N-L-天冬氨酸的方法包括如下步骤将碳源、氮源(氨水、硫酸铵、氯化铵等)、微量元素配置成发酵培养基，经高温灭菌，接入大肠杆菌菌种(E.coli)A.S.1881，摇瓶(或发酵罐)发酵生产含有天冬氨酸酶的游历细胞，将得到的游历细胞加入到含有底物、同位素标记的氮源和微量元素的反应液中，调pH至7-10，更适宜在8.2-8.8，于30-50℃，更适宜在40-43℃的恒温培养箱中反应24-48小时；所说的碳源为反丁烯二酸、葡萄糖、果糖或蔗糖中的一种或多种；所说的氮源为氨水、硫酸铵或氯化铵等中的一种或多种；所说的底物为反丁烯二酸；所说的同位素标记的氮源包括15N-硫酸铵、15N-氯化铵、15N-尿素、15N-氨水等中的一种或多种；所说的微量元素包括NaCl、MgSO4、KH2PO4、玉米浆或蛋白胨中的一种或多种；酶反应结束后，将反应液加热到85-95℃，加入0.5-2.0％活性炭，经搅拌、保温，真空抽滤，洗涤滤饼，合并滤液并将滤液真空浓缩至20-30％，加热至70-90℃，边搅拌边缓慢加入硫酸调节至pH＝2.5～3.0，在20-200r/m恒速搅拌器中搅拌冷却结晶，过滤，洗涤， 60-80℃干燥，即获得同位素标记的15N-L-天冬氨酸。
本发明制备同位素标记15N-L-丙氨酸的方法包括如下步骤将一定比例的碳源、氮源、营养物质配置成发酵培养基，经高温灭菌，接入假单孢杆菌(Pseudomonas)B186，摇瓶或发酵罐发酵生产含有天冬氨酸β-脱羧酶的游历细胞，在酶反应液中逐渐加入15N-L-天冬氨酸，pH为2-3，于30～40℃恒温振荡培养箱中反应，使pH达到6.0～7.0以上，过滤，得同位素标记的15N粗品丙氨酸。
所说的碳源为反丁烯二酸、葡萄糖、果糖或蔗糖中的一种或多种；所说的氮源为氨水、硫酸铵或氯化铵等中的一种或多种；所说的营养物质包括硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、磷酸盐、蛋白胨或玉米浆中的一种或多种；将同位素标记的15N粗品丙氨酸按10-15％的浓度溶解于蒸馏水中，加热至85-90℃，加0.5～2％活性炭，保温、抽滤进行搅拌蒸发结晶，自然冷却至室温，冰浴冷却至0～5℃，真空抽滤得同位素标记的15N精制丙氨酸；合并所有母液，用HCl调pH至3.0-3.5，用H型#732强酸性阳离子离交树脂离交分离，上柱速度为50-1000ml/l，经无离子水洗柱，用2-10％氨水洗脱，洗脱速度为50-1000ml/l，收集pH6-8洗脱液。将洗脱液真空浓缩至20％以上，加无水乙醇醇析，结晶，抽滤，干燥，即获得同位素标记的15N精制丙氨酸。
使用的微生物本发明用于生产天冬氨酸酶的微生物是大肠杆菌菌种(E.coli)A.S.1881，由中科院微生物研究所菌种保藏中心保藏并提供并公开销售(微生物学通报第10卷第1期p8-10，1983)。本发明用于生产天冬氨酸β-脱羧酶的微生物是德阿昆哈假单孢杆菌(Pseudomonas)B186，由上海市工业微生物研究所菌中保藏中心保藏并提供并公开销售(工业微生物1983年第6期p1-4)。
上述菌种具有如下的性质1、态生理生化特征形态特征(1)大肠杆菌(E.coli)A.S.1881直杆状，1.1-1.5μm×2.0-6.0μ，革兰氏阴性，发酵液中单个存在。
(2)德阿昆哈假单孢杆菌(Pseudomonas)B186直杆状，0.5-1.0μm×1.5-5.0μ，革兰氏阴性，发酵液中单个存在。
2、采用的培养基斜面培养基(g/l)蛋白胨 10 牛肉膏 5.0 NaCl 5.0 琼脂 20 蒸馏水溶解，调pH到7.2-7.5，加入琼脂并定容1000ml，分装试管斜面，121℃灭菌30分钟。
天冬氨酸酶酶液培养基(g/l)富马酸10 NaCl 1.45 MgSO4.7H2O 0.2 KH2PO4 1.0干粉玉米浆11溶解后用氨水调pH7.0-7.5，定容1000ml，分装50ml/250ml三角瓶，121℃灭菌30分钟。
天冬氨酸β-脱羧酶酶液培养基(g/l)富马酸 15 蛋白胨 5.0 MgSO4.7H2O 0.2 KH2PO4 0.1 干粉玉米浆4.0 NaOH 7.0 氨水 6.0溶解后用4NNaOH调pH7.0-7.5，定容1000ml，分装50ml/250ml三角瓶，121℃灭菌30分钟。
天冬氨酸底物反应液碳源反丁烯二酸；氮源15N-硫酸铵、15N-氯化铵、15N-尿素、15N-氨水等一种或多种；微量元素磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜等无机盐中的一种或多种。
3、培养条件天冬氨酸酶酶液细胞培养条件培养温度30-40℃，更适宜的温度36-38℃。
摇瓶装液量250ml摇瓶装培养基30-100ml，更适宜的装液量45-55ml。
摇床频率旋转摇床(或往复摇床)100-250r/m，更适宜的频率200-220r/m。
天冬氨酸β-脱羧酶酶液细胞培养条件
培养温度25-40℃，更适宜的温度29-33℃。
摇瓶装液量250ml摇瓶装培养基30-100ml，更适宜的装液量45-55ml。
摇床频率旋转摇床(或往复摇床)100-250r/m，更适宜的频率200-220r/m。
15N-L-天冬氨酸酶反应条件在酶反应液中加入酶液菌体0.1-1％，于35-50℃(更适宜温度40-45％)恒温培养箱中反应24-48小时。
15N-L-丙氨酸条件每50ml酶反应液可加入15N-L-天冬氨酸30-50g，于30-40℃(更适宜温度36-38℃)恒温培养箱中反应48-72小时。
本发明所采用的分析方法采用高锰酸钾方法检测反丁烯二酸的量；采用HPLC方法测定天冬氨酸和丙氨酸含量；采用微量样品转化方法制备样品，由气体同位素质谱计检测15N-苏氨酸丰度。
由上述公开的技术方案可见，本发明的方法，能够方便地制备同位素标记15N-L-天冬氨酸和同位素标记的15N精制丙氨酸，产品纯度在99％以上、丰度在98.5％以上，由此可见，本发明具有较大的工业化实施前景。
本发明将通过以下非限制性的实例具体说明技术的实施方式。
具体实施例方式
实施例1菌种大肠杆菌Asp-4在斜面培养基中37℃培养24成熟，接入天冬氨酸酶酶液培养基，于250ml摇瓶装培养基50ml，于37℃旋转摇床上220rpm培养24小时。培养完成后将培养液置于无菌离心管中4000rpm离心15分钟，将离心后的湿菌体细胞0.5g加入含有5％反丁烯二酸、8％15N-硫酸铵、0.0125％硫酸镁的酶反应液200ml中，用NaOH调pH8.2-8.8，于42℃恒温培养箱中反应24小时。反应结束后结果如表1所示表1项目 No.1 No.2 No.3 平均15N-(NH4)2SO4添加量(g) 404040富马酸底物添加量(g) 101010反应液体积(脱色后)(ml) 625 630 618天冬氨酸浓度(％)7.93 8.14 8.25 8.11天冬氨酸生成量(g) 49.56 51.28 50.99富马酸残留浓度(％) 0.28 0.36 0.35富马酸转化率(％)96.55 95.45 95.68氮源摩尔转化率(％) 61.45 63.59 63.2362.76实施例2将实例1方法中培养成熟的湿菌体细胞0.5g加入含有5％反丁烯二酸、0.0125％硫酸镁和3％15N-硫酸铵、3％15N-氯化铵的混合氮源反应液200ml中，用15N-氨水调pH8.2-8.8，于42℃恒温培养箱中反应24小时。结果天冬氨酸生成量为52.0g，富马酸转化率为96.8％，氮源摩尔转化率为62.4％。
实施例3将实例1反应完成的反应液加热到85-90℃，加入0.5％活性炭，搅拌、保温45分钟，真空抽滤，蒸馏水洗涤滤饼。合并滤液并将滤液在65℃、680mmHg下真空浓缩至20％，加热至80℃，边搅拌边缓慢加入浓硫酸，pH3.0时有细晶析出，在100rpm恒速搅拌器中搅拌冷却结晶。冷却至室温时，5℃冰箱过夜。结晶液经真空抽滤、洗晶得成品湿晶，60℃干燥过夜。结果如表2所示
表2项 目 No.1 No.2No.3 平均反应液体积(ml) 625 630 618天冬氨酸含量(％) 7.93 8.148.25 8.11得到产品(g) 42.5 43.143.9总收率(％) 85.8 84.086.1 85.3原料丰度(atom％) 98.9098.90 98.90产品丰度(atom％) 98.2398.44 98.32 98.33产品纯度(％) 98.8998.99 99.11 99.00实施例4菌种假单孢杆菌在斜面培养基中37℃培养24成熟，接入天冬氨酸β-脱羧酶酶液培养基，于250ml摇瓶装培养基50ml，于37℃旋转摇床上220rpm培养24小时。培养完成后加入15N-L-天冬氨酸40g，于37℃恒温培养箱中反应72小时。结果如表3所示表3项 目 No.1No.2 No.3 平均酶液体积(ml)50 50 50天冬氨酸添加量(g) 40 40 40反应结束后底物含量(％) 0.2 0.30.11转化率(％) 99.75 99.63 99.86 99.75实施例5将实例3转化液真空抽滤，得粗品15N-L-丙氨酸。抽滤结束后，将粗品15N-L-丙氨酸按15wt％的浓度溶解于蒸馏水中，加热至85-90℃，加2％活性炭，保温60分钟，抽滤后除去活性炭，进行搅拌蒸发结晶，自然冷却至室温，冰浴冷却至5℃，真空抽滤得精制丙氨酸。合并所有母液，用1NHCl调pH至3.5，待用。
取φ4×50cm离交柱，内装500ml#732强酸性阳离子离交树脂，转H型、水洗至中性后将合并母液上柱，上柱速度为500ml/h，上柱结束后用2倍柱体积无离子水洗柱，在用2.2％氨水洗脱，洗脱速度为500ml/h，收集pH7洗脱段。将洗脱液真空浓缩至20％以上，加5倍体积无水乙醇醇析，结晶经真空抽滤后于65℃干燥箱干燥。结果如表4所示表4项 目 No.1 No.2 No.3 平均天冬氨酸添加量(g)40 4040得到产品(g) 23.10 22.70 23.05总收率(％) 86.3 84.8 86.1 85.3原料丰度(atom％)98.32 98.32 98.32产品丰度(atom％)98.23 98.14 98.22 98.20产品纯度(％)99.11 99.20 99.18 99.1权利要求
1.一种同位素标记15N-L-天冬氨酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤先将碳源、氮源和微量元素配制成发酵培养基培养肠杆菌菌种(E.coli)A.S.1881，发酵生产含有天冬氨酸酶的游历细胞，然后将其加入到含有底物、同位素标记的氮源和微量元素的反应液中，调pH至7-10，于30-50℃，恒温培养反应24-48小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的碳源为反丁烯二酸、葡萄糖或蔗糖中的一种或一种以上；所说的氮源为氨水、硫酸铵或氯化铵等中的一种或一种以上；所说的底物为反丁烯二酸；所说的同位素标记的氮源包括15N-硫酸铵、15N-氯化铵、15N-尿素、15N-氨水中的一种或一种以上；所说的微量元素包括NaCl、MgSO4、KH2PO4、玉米浆或蛋白胨中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶反应结束后，将反应液加热到85-95℃，加入活性炭，搅拌、保温，抽滤，洗涤，浓缩至20-30％，加热至70-90℃，加入硫酸调节至pH＝2.5～3.0，冷却结晶，过滤，洗涤，干燥，即获得同位素标记的15N-L-天冬氨酸。
4.一种制备同位素标记15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤先将碳源、氮源、营养物质配制成发酵培养基，接入假单孢杆菌(Pseudomonas)B186，发酵生产含有天冬氨酸β-脱羧酶的游历细胞，然后在酶反应液中逐渐加入15N-L-天冬氨酸，pH为2-3，于30～37℃恒温振荡培养箱中反应，使pH达到6.6～8.0以上，过滤，得同位素标记的15N粗品丙氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的碳源为反丁烯二酸；所说的氮源为氨水、硫酸铵或氯化铵等中的一种；所说的营养物质包括包括硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、磷酸盐、蛋白胨或玉米浆中的一种或多种；
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将同位素标记的15N粗品丙氨酸溶解于蒸馏水中，加热至85-90℃，加0.5～2％活性炭，保温、抽滤，蒸发结晶，自然冷却至室温，冷却至0～5℃，抽滤得同位素标记的15N丙氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，合并所有母液，调pH至3.0-3.5，用强酸性阳离子离交树脂离交分离，收集pH6-8洗脱液，浓缩，加无水乙醇醇析，结晶，抽滤，干燥，即获得同位素标记的15N精制丙氨酸。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，将同位素标记的15N粗品丙氨酸按10-15wt％的浓度溶解于蒸馏水中。
全文摘要
同位素标记
文档编号C12P13/20GK1487087SQ0314199
公开日2004年4月7日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者毛展伟, 劳含章, 钱志良 申请人:上海新立工业微生物科技有限公司