表达雄激素受体复合物相关蛋白的转基因动物的制作方法

专利名称：表达雄激素受体复合物相关蛋白的转基因动物的制作方法
相关申请本申请是2001年2月12日提交的美国专利申请09/781,693的专利申请和2001年1月17日提交的美国临时申请60/262,312的部分继续申请，因此该申请要求上述两项的优先权，它们的内容也一并纳入本文作参考。
背景技术：
目前已鉴定出相对于健康细胞而言在肿瘤细胞中过表达的多种基因。人们期望这些基因的鉴定可为抗癌药物的开发和癌症的诊断提供药物标靶。在肝脏肿瘤细胞中，类固醇受体(例如雄激素受体)的数量显示高于它们邻近的健康的肝细胞。
类固醇激素通常通过与它们的特异性核受体结合形成复合物，并由该复合物作为转录因子而发挥生理作用。所述复合物结合类固醇应答基因启动子中的特定核苷酸序列(类固醇反应元件)，从而促进这些基因的转录。
发明简述本发明的是基于编码雄激素受体复合物相关蛋白(ARCAP)的小鼠基因的发现，该基因有85％与人ARCAP相同。已发现人ARCAP在肝细胞癌细胞中过表达(与邻近的正常细胞相比)，并与雄激素受体结合，从而增强该受体反式激活(transactivate)雄激素应答基因的能力。作为人ARCAP基因的同系物，小鼠ARCAP基因能用来产生可用作开发癌症(例如肝癌)治疗药物的动物模型的转基因小鼠。
小鼠ARCAP的全长cDNA(称为SEQ ID NO1)如下所示，其中的起始和终止密码子用下划线标示GAGAGTATGAGGCGAGCCGTGGCCCGGGTGCCTCTCCGCTCCCGGGGAGAAGGCGCGGCCGTGGCTGCCGCCCTCTGAGTCGCGGCGCCGGCGAGGCCCCGGGGCGCGCGCATGGTGCTGGTGCCGCTCGGGTGTTGATCGGCCTGTCCCCTCCCTCTCTTCCCCTCCCCACCCCCCGCGGTGGTCTCCCCTTTCCCACCCCAGCCCTTGCGGAGCCATGGCTCGGAGTGGCTCCTGCCCGCACCTGTTGTGGGACGTGAGGAAAAGGTCCCTTGGGCTGGAGGACCCGTCCCGGCTGAGGAGCCGCTACCTGGGAAGAAGAGAATTTATCCAAAGATTAAAACTTGAAG
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本发明的特征还在于转基因动物(例如，啮齿类动物，如小鼠)，其基因组包括含有本发明核酸的转基因，这种动物与野生型动物相比对雄激素的应答增强。该转基因动物可这样产生，即将本发明的核酸导入细胞，使得从该核酸产生转录物，并将该转录物翻译成蛋白。这些转基因动物可用作开发癌症(例如肝癌)治疗药物的模型。
此外，本发明的特征还在于制备本发明多肽的方法，即培养上述细胞，在该细胞中表达所述多肽，并从培养物中分离出这种多肽。
本发明的特征也在于检测动物样品(例如血样品)中是否包含癌细胞的方法。该方法涉及提供来自动物(例如，啮齿类动物，如小鼠)的样品，检测该样品中ARCAP基因的表达水平。如果该样品中ARCAP基因的表达水平高于正常样品中的水平，便表明该动物样品中含有癌细胞(例如肝癌细胞)。这种方法可用于诊断癌症或监控动物模型中癌症的治疗。
治疗动物(例如，啮齿类动物，如小鼠)的癌症(例如肝癌)的方法也包括在本发明的范围之内。所述方法涉及鉴定具有表达ARCAP基因的癌细胞的动物，并用可阻断ARCAP与雄激素受体的结合或降低雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力的组合物治疗所述动物。该组合物可包含本发明的抗体或本发明的反义核酸。这种方法也可用于筛选药物(包括用于基因治疗的药物)和测试它们在动物模型中的效力。
本文针对给定多肽所用的术语“基本纯的”是指该多肽基本不含有其他生物大分子。基本纯的多肽是干重为至少75％(例如至少80，85，95或99％)纯。纯度可通过任何适当的标准方法来检测，例如柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
“保守氨基酸取代”是指一种氨基酸残基被另一种具有化学相似侧链的氨基酸残基所取代。本领域已确定了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
在“严谨条件下”杂交是指在65℃，0.5×SSC杂交，然后在45℃，0.1×SSC洗涤。
两个氨基酸序列或核苷酸序列的“同一性百分比”利用Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990)，经Karlin和Altschul修改后的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)确定。这种算法被纳入到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST核苷酸检索用NBLAST程序进行，分值(score)＝100，字段长(wordlength)＝12。用XBLAST程序进行BLAST蛋白的检索，分值＝50，字段长＝3。两序列间存在缺口时，使用Altschul等所述的GappedBLAST(Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，采用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数，参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
“分离的核酸”是这样一种核酸，其结构与任何天然核酸的结构不同，或与跨越3个以上被分隔的基因(separate gene)的天然基因组核酸的任何片段不同。因此，该术语包括，例如，(a)一种核酸，其具有天然基因组DNA分子的部分序列，但其侧翼并非天然生物基因组中该分子所述部分的侧翼编码序列；(b)掺入到载体或原核或真核生物基因组DNA中的核酸，其掺入方式致使所得分子与任何天然载体或基因组DNA都不同；(c)分离的分子如cDNA，基因组片段，由聚合酶链反应(PCR)制备的片段，或限制性片段；以及(d)重组核苷酸序列，其是杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分。特别排除在此定义之外的是存在于不同的(i)DNA分子，(ii)经转染的细胞或(iii)细胞克隆组成的混合物中的核酸，例如，DNA文库，如cDNA或基因组DNA文库中的核酸。
本发明的其他特征或优点可从以下详细说明以及权利要求中明显看出。
发明详述本发明涉及表达ARCAP基因的非人转基因动物，以及利用所述动物开发治疗或预防肝癌的药物的方法。
本文所用的“非人转基因动物”包括起始的(founder)非人转基因动物，其后代以及来源于所述动物的细胞和组织。非人转基因动物可以是农场动物(farm animals)，如猪，山羊，绵羊，牛，马和兔，啮齿类动物如大鼠，豚鼠和小鼠，以及非人灵长类动物如狒狒(baboon)，猴子(monkey)和黑猩猩(chimpanzee)。转基因的猪和小鼠尤其有用。
本发明的非人转基因动物包含整合到其基因组中的编码ARCAP蛋白的核酸。本文所用的“ARCAP蛋白”是指野生型ARCAP蛋白或功能等价的变体，例如全长蛋白的片段。
本发明认为鉴定基因组中的内含子序列(如果有)，并把它们包括在编码ARCAP蛋白的核酸中是有利的。
在本发明的非人转基因动物中，所述核酸可操作连接于促进ARCAP基因在，例如，肝脏中表达的调控元件。本文所用术语“可操作连接”是指调控元件和核酸所处的位置关系，它能使所述核酸被转录。所述调控元件可以是肝特异的启动子，如PEPCK和清蛋白启动子。
本发明的特征还在于适于产生本发明非人转基因动物的表达载体。所述表达载体包括能介导肝脏表达并与上述编码ARCAP蛋白的核酸可操作连接的启动子。
可用本领域已知的各种技术将表达载体导入到非人动物中，以产生非人转基因动物的起始动物。所述技术包括但不限于，原核显微注射(美国专利4,873,191)，反转录病毒介导的基因向生殖系(germ line)中转移(Van derPutten et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，826148，1985)，基因靶向进入胚胎干细胞(Thompson et al.，Cell，56313，1989)，胚胎电穿孔(Lo，Mol.Cell.Biol.，31803，1983)，和体外体细胞转化及后续的核移植(Wilmut et al.，Nature，385(6619)810-813，1997；and Wakayama et al.，Nature，394369-374，1998)。在一个实施例中，表达载体被显微注射到非人动物的卵或胚胎中，或显微注射到非人动物的胚胎干细胞中。
一旦制备出非人转基因动物，(例如依照Current Protocol(Wiley，USA)和Manuplate the Mouse Embryo(Hogan Beddington and Costantini Lacy，CSHL Press)所述制备出转基因小鼠)，就可采用标准技术评估ARCAP基因的表达。用Southern印迹分析或PCR技术进行最初的筛选以确定转基因是否已发生了整合。参见，例如，Sambrook等1989年所著的＂Molecular Cloning，A Laboratory Manual＂第二版，Cold Spring Harbor Press Plainview；NY，9.37-9.52章节中对Southern分析的描述。编码ARCAP蛋白的核酸在非人转基因动物组织中的表达可利用多种技术来评估，所述技术包括但不限于，对获自所述动物的组织样品进行Northern印迹分析，原位杂交分析和逆转录酶的PCR(RT-PCR)。
本发明的非人转基因动物可用作肝癌模型。这些动物尤其可用于鉴定对肝癌的治疗或预防有效的化合物或组合物。所述化合物或组合物可如下鉴定，即对本发明的非人转基因动物给药待测化合物或组合物，或使待测化合物或组合物与来源于所述非人转基因动物的器官，组织(例如肝脏)或细胞(例如肝细胞)接触。然后评价待测化合物或组合物对非人转基因动物，器官，组织或细胞的肝癌的影响。例如，可评估非人转基因动物中通过临床病理学鉴定的肿瘤的大小。能缓解癌症症状的待测化合物或组合物可有效治疗或预防肝癌。
可将待测化合物配制成药物组合物，方法是将所述化合物与药学上可接受的无毒性赋形剂或载体混合，然后通过任何给药途径将其给药于本发明的非人转基因动物。例如，可采用肠胃外给药途径，如皮下给药，肌肉内给药，血管内给药，皮内给药，鼻内给药，吸入给药，鞘内给药或腹膜内给药，以及肠道途径给药如舌下，口腔或直肠给药。
即使不作进一步的详述，相信本领域技术人员也能够在本文描述的基础上最完整地利用本发明。本文中所引用的出版物在此都以其全部内容纳入本文作参考。
其它实施方案该说明书中公开的所有特征都可以以任何形式组合。本说明书所公开的每一特征都可以由达到相同，等价或类似目的的另一特征代替。因此，除非另有说明，本文所公开的每一特征仅仅是这类等价或类似特征中的一个实例。
从以上说明中，本领域技术人员能非常容易地发现本发明的特征，且能在不脱离本发明精神和范围的情况下，对本发明进行各种变动和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，其它的实施方案也包括在以下权利要求的范围内。
序列表<110>行政院退除役官兵辅导委员会台北荣民总医院创盛基因科技股份有限公司<120>表达雄激素受体复合物相关蛋白的转基因动物<130>14321-003001<140>US 10/206,566<141>2002-07-2 5<150>US 09/781,693<151>2001-02-12<150>US 60/262,312<151>2001-01-17<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>3340<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(218)...(2905)<400>1gagagtatga ggcgagccgt ggcccgggtg cctctccgct cccggggaga aggcgcggcc 60gtggctgccg ccctctgagt cgcggcgccg gcgaggcccc ggggcgcgcg catggtgctg 120gtgccgctcg ggtgttgatc ggcctgtccc ctccctctct tcccctcccc accccccgcg 180gtggtctccc ctttcccacc ccagcccttg cggagcc atg gct cgg agt ggc tcc 235Met Ala Arg Ser Gly Ser1 5tgc ccg cac ctg ttg tgg gac gtg agg aaa agg tcc ctt ggg ctg gag283Cys Pro His Leu Leu Trp Asp Val Arg Lys Arg Ser Leu Gly Leu Glu
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1.一种基本纯的多肽，其包含与SEQ ID NO3至少70％相同的氨基酸序列，其中所述多肽与雄激素受体结合并增强雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力。
2.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO3至少80％相同。
3.权利要求2的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO3至少90％相同。
4.权利要求3的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO3至少95％相同。
5.权利要求4的多肽，其中所述氨基酸序列是SEQ ID NO3。
6.一种基本纯的多肽，其包含具有多至30个保守氨基酸取代的SEQ ID NO3的氨基酸序列，该多肽能与雄激素受体结合，并增强雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力。
7.一种基本纯的由在严谨条件下与具有SEQ ID NO2所示序列的探针杂交的核酸编码的多肽，其中所述多肽能与雄激素受体结合，并增强雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力。
8.一种分离的核酸，其编码权利要求1的多肽。
9.权利要求8的核酸，其中所述氨基酸序列是SEQ ID NO3。
10.编码权利要求6的多肽的分离的核酸。
11.一种分离的核酸，其包含在严谨条件下能与单链探针杂交的链，该探针的序列为SEQ ID NO2所示序列或SEQ ID NO2序列的互补体。
12.权利要求11的核酸，其中所述核酸编码多肽，该多肽能与雄激素受体结合，并增强雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力。
13.权利要求12的核酸，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO3。
14.权利要求11的核酸，其中所述链的长度至少是15个核苷酸。
15.包含权利要求8的核酸的载体。
16.权利要求15的载体，其中所述氨基酸序列是SEQ ID NO3。
17.包含权利要求10的核酸的载体。
18.包含权利要求11的核酸的载体。
19.权利要求18的载体，其中所述核酸编码多肽，该多肽能与雄激素受体结合，并增强雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力。
20.包含权利要求8的核酸的细胞。
21.权利要求20的细胞，其中所述氨基酸序列是SEQ ID NO3。
22.包含权利要求10的核酸的细胞。
23.包含权利要求11的核酸的细胞。
24.权利要求23的细胞，其中所述核酸编码多肽，该多肽能与雄激素受体结合，并增强雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力。
25.一种在其基因组中包含转基因的转基因动物，所述转基因包含权利要求8的核酸，该转基因动物与野生型动物相比对雄激素的应答增强。
26.权利要求25的转基因动物，其中所述动物是啮齿类动物。
27.权利要求26的转基因动物，其中所述动物是小鼠。
28.权利要求25的转基因动物，其中所述氨基酸序列是SEQ IDNO3。
29.权利要求28的转基因动物，其中所述动物是啮齿类动物。
30.权利要求29的转基因动物，其中所述动物是小鼠。
31.一种在其基因组中包含转基因的转基因动物，所述转基因包含权利要求10的核酸，该转基因动物与野生型动物相比对雄激素的应答增强。
32.权利要求31的转基因动物，其中所述动物是啮齿类动物。
33.权利要求32的转基因动物，其中所述动物是小鼠。
34.一种在其基因组中包含转基因的转基因动物，所述转基因包含权利要求11的核酸，该转基因动物与野生型动物相比对雄激素的应答增强。
35.权利要求34的转基因动物，其中所述动物是啮齿类动物。
36.权利要求35的转基因动物，其中所述动物是小鼠。
37.一种制备多肽的方法，其包括培养权利要求20的细胞，在该细胞中表达所述多肽，和从培养物中分离这种多肽。
38.一种制备转录物的方法，包括将权利要求11的核酸导入到细胞中，从该核酸制备转录物。
39.一种分离的抗体，其能与包含SEQ ID NO3所示氨基酸序列的多肽结合。
40.一种确定动物样品中是否包含癌细胞的方法，该方法包括提供来自动物的样品，和检测样品中雄激素受体复合物相关蛋白的基因的表达水平，样品中雄激素受体复合物相关蛋白基因的表达水平高于正常样品中的水平时，指示该动物样品中包含癌细胞。
41.权利要求40的方法，其中所述样品是血样品。
42.权利要求40的方法，其中所述癌细胞是肝癌细胞。
43.权利要求40的方法，其中所述动物是啮齿类动物。
44.权利要求43的方法，其中所述动物是小鼠。
45.一种治疗动物癌症的方法，其包括鉴定含有癌细胞的动物，所述癌细胞表达雄激素受体复合物相关蛋白基因，以及用能阻断雄激素受体复合物相关蛋白与雄激素受体的结合的组合物或能减弱雄激素受体反式激活雄激素应答基因的能力的组合物治疗所述动物。
46.权利要求45的方法，其中所述组合物包含权利要求39的抗体。
47.权利要求45的方法，其中所述组合物包含权利要求11的核酸。
48.权利要求45的方法，其中所述癌症是肝癌。
49.权利要求45的方法，其中所述动物是啮齿类动物。
50.权利要求49的方法，其中所述动物是小鼠。
全文摘要
本发明涉及表达雄激素受体复合物相关蛋白基因的转基因动物。这些动物可以作为开发治疗癌症，例如肝癌的药物的动物模型。
文档编号C12N15/12GK1495195SQ0314361
公开日2004年5月12日 申请日期2003年7月25日 优先权日2002年7月25日
发明者张泰階, 张泰 申请人:台北荣民总医院, 创盛基因科技股份有限公司