专利名称：高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体、细胞系、方法及其组成的生产系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体、细胞系、方法及其组成的生产系统，属于病毒基因工程领域。
背景技术：
在基因治疗研究中，rAAV载体由于其宿主范围广、副作用小、可介导目的基因长时间稳定表达等特点而获得广泛应用。但是rAAV大规模制备是限制其在基因治疗中广泛应用的主要因素，这可以从提高单个细胞产生病毒颗粒数目和培养大量生产病毒的细胞来大规模制备rAAV。
目前的生产技术中，利用哺乳动物细胞，病毒的产量一般仅100病毒颗粒/细胞。经过大量优化后，病毒产量可达104病毒颗粒/细胞，但是生产用的细胞系主要是人胚肾293细胞等贴壁细胞，这些细胞大规模培养比较困难，因此重组病毒仍难以进行大规模生产。近年来有研究者使用杆状病毒表达AAV辅助蛋白，在昆虫细胞中生产rAAV病毒，据报道可达105/细胞。昆虫细胞系(如Sf9细胞)适合悬浮培养，可以在细胞培养罐中大量培养，有利于rAAV病毒的大规模生产。目前使用的昆虫系统中，需要使用三个重组杆状病毒载体，分别表达rAAV的Rep、Cap及ITR，其感染过程仍较繁杂。
发明内容
本发明的第一个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体。
本发明的另一个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞。
本发明的第三个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒方法。
本发明的第四个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒的生产系统。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，该病毒载体为重组杆状病毒载体，在该载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列这三者中的一个或几个，其中ITR序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。
杆状病毒目前常用的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV和家蚕杆状病毒BmPV，本发明所使用的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。使用杆状病毒，可以在昆虫细胞中高效、按比例的表达腺相关病毒的有关蛋白；ITR序列提供了腺病毒相关病毒的包装信号、整合启动子、以及可克隆外源基因的多克隆位点；Rep提供了腺病毒相关病毒复制所需的酶；Cap基因提供了病毒包装所需的结构蛋白。
所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因。
所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Rep基因和Cap基因。
所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的ITR序列。
所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因和ITR序列。
所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Rep基因、Cap基因和ITR序列。
一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞系，该细胞系为整合昆虫细胞系，在该细胞系的染色体中整合有腺病毒伴随病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列这三者中的一个或几个，其中ITR序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。昆虫细胞系是杆状病毒的主要宿主细胞，容易培养，有利于提高重组腺病毒相关病毒的生产效率和产量；目前常用的有3个细胞株Sf9和Sf21以及High-FiveTM，都是商业化的细胞系。将腺病毒相关病毒的有关序列整合到昆虫细胞的染色体上后可避免反复使用重组杆状病毒感染昆虫细胞。
所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的Rep基因。
所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的ITR序列。
所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的Rep基因和ITR序列。
一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的方法，利用上述重组杆状病毒载体感染昆虫细胞系或利用上述重组杆状病毒载体感染上述整合昆虫细胞系，高效生产重组腺病毒伴随病毒。所述的杆状病毒载体为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。
利用上述方法得到的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，该系统由重组杆状病毒载体和昆虫细胞系组成，或由重组杆状病毒载体和整合昆虫细胞系组成。所述的杆状病毒载体为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。
所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、构建有腺病毒伴随病毒Rep基因和Cap基因的杆状病毒载体和构建有腺病毒伴随病毒ITR序列的杆状病毒载体组成。
所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Rep基因、Cap基因和ITR序列的杆状病毒载体组成。
所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由整合有腺病毒伴随病毒Rep基因的整合昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Cap基因和ITR序列的杆状病毒载体组成。
所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由整合有腺病毒伴随病毒ITR序列的整合昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Rep基因和Cap基因的杆状病毒载体组成。
本发明的优点是所使用的重组杆状病毒在细胞系中能自行繁殖，可大量提供生产rAAV所需蛋白质或基因组；昆虫细胞系适合悬浮大量培养，大大降低了生产成本；使用一个或两个重组杆状病毒感染昆虫细胞系生产rAAV，更简便易行；同时该体系通过调节有关基因、蛋白质的数量或表达时间，可大大提高生产rAAV的效率。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定。
图1为载体pBac-Cap质粒构建图。
图2为载体pBac-RC质粒构建图。
图3为载体pBac-ITR质粒构建图。
图4为载体pBac-Cap-ITR质粒构建图。
图5为载体pBac-Cap-Rep-ITR(pAllinOne)质粒构建图。
图6为载体pIB-Rep质粒构建图。
图7为载体pIB-Cap-Rep质粒构建图。
图8为载体pIB-ITR质粒构建图。
图9为rAAV-LacZ感染人胚肾293细胞后LacZ表达检测图。
具体实施例方式
实施例1、携带和表达AAV cap基因的重组杆状病毒rBac-Cap的构建1、通过DNA合成仪(Applied BioSystem 373A)合成下列引物PCapA5’CGGGATCCTGTTAAGACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC，其中斜体为BamHI位点，下划线为突变点。第一个ATG突变为ACG以降低VP1的表达水平；第二个读框错位的ATG突变为ACG，以消除对下游VP2及VP3表达的影响。
PCapB5’ACAAGCTTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGG，其中斜体为HindIII位点，下划线为终止密码。
2、以质粒pAAV-RC(Stragagene公司产品)为模板，采用Roche高保真PCR体系进行PCR扩增，获得AAV-2的Cap基因。反应条件如下模板1ng，引物P1和P2各100ng，dNTP 0.25mmol/L，反应缓冲液10微升，酶2.5单位，补去离子水至100微升。采用美国PE公司9600型PCR仪进行PCR反应(94℃ 30秒，50℃30秒，72℃ 3分，共扩增30循环。经琼脂糖电泳获得2.3kb DNA片段。
3、上述获得的DNA片段及载体质粒pFastBacDual(invitrogen公司产品)各200ng用BamHI+HindIII(均为Promega公司产品)进行酶切，回收片段用T4 DNA连接酶(Promega公司产品)连接，16℃ 6小时后，按分子克隆所述条件转化大肠杆菌DH5α，涂氨苄抗性平板，筛选正确的质粒，获得可表达AAV Cap蛋白的质粒载体pBac-Cap.质粒的构建见图1。
4、质粒pBac-Cap 1ng与100μl感受态大肠杆菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分后42℃热激活45秒，立即冰浴2分钟，加900μl SOC培养基(见分子克隆)，37℃培养1小时后涂平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司产品)和40μg/ml IPTG)。37℃培养48小时后挑取白色的菌落进行分析。鉴定正确的阳性克隆接种至含有上述抗生素的LB液体培养基中过夜培养，用Invitrogen公司的MidPrep试剂盒进行质粒抽提，获得重组杆状病毒载体DNA。
5、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)，在27℃培养72小时，收集含重组杆状病毒(r Bac-Cap)的上清。
实施例2、携带和表达AAV cap\rep基因的重组杆状病毒rBac-RC的构建本实施例的主要目的是在同一个Bac载体上同时表达AAV的Cap基因和复制相关基因Rep基因。
1、通过ABI 381 DNA合成仪合成下列DNA片段P52ATCCA CCCGGGATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCG，其中斜体为SmaI位点。
P52BTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGATCAGAGAGAGTGTCCTCGAGCCAAT斜体为与BGH polyA信号5’引物互补序列。
BGHACTCTCTGA TCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCA，斜体为与Rep52互补序列。
BGHBGGCGTTATCGTTTATTGCCATAGAGCCCACCGCATCC斜体为与IEPromoter互补序列。
IE promoterIE1GGATGCGGTGGGCTCTATGGCAATAAACGATAACGCCGTTGGTGGCGTGAGGCATGTAAAAGGTTACATCATTATCTTGTTCATCCGGTTGIE2CAAAAACCAACATGAACGTCTATTTATACCAACCGGATGAACAAGATAATGATGTAACIE3GTATAAATAGACGTTCATGTTGGTTTTTGTTTCAGTTGCAAGTTGGCTGCGGCGCGCG CAG CACCTTTAGCCATGGCGGGGTTTTACG4GATTG，斜体为与Rep78互补序列。
P78AAGCCATGGCGGGGTTTTACGAGATTGP78BCGGAATTCCGCTAGCCACCACTGTCTTATTCCTTC，斜体为NheI位点2、以质粒pAAV-RC 1ng为模板，分别以引物P52A+P52B，P78A+P78B进行PCR扩增(条件同实施例1)，扩增出AAV 2的Rep52基因和Rep78基因；以质粒pCDNA3.1/Myc-His(Invitrogen公司产品)1ng为模板，用引物PBHGH1和PBGH2进行PCR扩增，获得BGH的Poly A信号序列；将上述序列进行琼脂糖电泳，切割含DNA片段的条带，使用QIAGEN的Gel Extraction Kit回收DNA片段，上述片段各5ng，，加入合成的IE启动之片段(IE1，IE2，IE3)各5ng，以上述混合片段为模板，使用P52A和P78B为引物进行PCR扩增，获得含有Rep52及其BGHpolyA信号、带缺失突变的IE启动子及Rep78基因的DNA片段。
上述片段及由例一所构建的质粒pBac-Cap均用SmaI+NheI酶切，并如例1用T4 DNA连接酶连接，构建可表达AAV Cap蛋白和Rep蛋白的杆状病毒载体。质粒的构建过程见图2。
3、质粒pBac-RC 1ng与100μl感受态大肠杆菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分后42℃热激活45秒，立即冰浴2分钟，加900μl SOC培养基(见分子克隆)，37℃培养1小时后涂平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司产品)和40μg/ml IPTG)。37℃培养48小时后挑取白色的菌落进行分析。鉴定正确的阳性克隆接种至含有上述抗生素的LB液体培养基中过夜培养，用Invitrogen公司的MidPrep试剂盒进行质粒抽提，获得重组杆状病毒载体DNA。
4、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)，在27℃培养72小时，收集含重组杆状病毒(r Bac-RC)的上清。
实施例3、携带AAV ITR序列的重组杆状病毒rBac-ITR的构建1、载体质粒pFastBacDual(invitrogen公司产品)各200ng用Sma I+Stu I(均为Promega公司产品)进行酶切，回收大片段；用Pci I和Sfo I酶切pAAV-MCS(Stratagene)，Klenow酶补平，电泳回收携带ITR的片段，将两个回收片段用T4 DNA连接酶(Promega公司产品)连接，构建携带腺相关病毒ITR序列的杆状病毒载体。质粒的构建过程见图3。
2、16℃ 6小时后，按分子克隆所述条件转化大肠杆菌DH5α，涂氨苄抗性平板，筛选正确的质粒，获得质粒载体pBac-ITR。
3、质粒pBac-ITR1ng与100μl感受态大肠杆菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分后42℃热激活45秒，立即冰浴2分钟，加900μl SOC培养基(见分子克隆)，37℃培养1小时后涂平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司产品)和40μg/ml IPTG)。37℃培养48小时后挑取白色的菌落进行分析。接种至含有上述抗生素的LB液体培养基中培养24小时，用Invitrogen公司的MidPrep试剂盒进行质粒抽提，获得重组杆状病毒载体DNA。
4、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)，在27℃培养72小时，收集含重组杆状病毒(r Bac-ITR)的上清。实施例4、携带和表达AAV基因的重组杆状病毒rBac-Cap-ITR的构建1、质粒pBac-Cap用Avr II酶切，Klenow酶补平；Pci I和Sfo I酶切pAAV-MCS，Klenow酶补平，电泳回收携带ITR的片段，将两个回收片段用T4 DNA连接酶(Promega公司产品)连接，构建携带ITR序列并表达Cap蛋白的杆状病毒载体。质粒的构建过程见图4。
2、16℃ 6小时后，按分子克隆所述条件转化大肠杆菌DH5α，涂氨苄抗性平板，筛选正确的质粒，获得质粒载体pBac-Cap-ITR。
3、质粒pBac-Cap-ITR 1ng与100μl感受态大肠杆菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分后42℃热激活45秒，立即冰浴2分钟，加900μl SOC培养基(见分子克隆)，37℃培养1小时后涂平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司产品)和40μg/ml IPTG)。37℃培养48小时后挑取白色的菌落进行分析。接种至含有上述抗生素的LB液体培养基中培养24小时，用Invitrogen公司的MidPrep试剂盒进行质粒抽提，获得重组杆状病毒载体DNA。
4、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)，在27℃培养72小时，收集含重组杆状病毒(r Bac-Cap-ITR)的上清。
实施例5、重组杆状病毒rBac-Cap-Rep-ITR(rBac-AllinOneAAV)的构建1、质粒pBac-RC用Avr II酶切，Klenow酶补平；pAAV-MCS(LacZ或目的基因插入)用Pci I和Sfo I酶切，Klenow酶补平，回收带ITR的基因片段，与质粒pBac-RC酶处理的片段连接酶连接。用连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性重组克隆，命名为pAllinOneAAV，提取其质粒DNA备用。质粒构建如图5。
2、质粒pAllinOneAAV 1ng与100μl感受态大肠杆菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分后42℃热激活45秒，立即冰浴2分钟，加900μl SOC培养基(见分子克隆)，37℃培养1小时后涂平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司产品)和40μg/ml IPTG)。37℃培养48小时后挑取白色的菌落进行分析。接种至含有上述抗生素的LB液体培养基中培养24小时，用Invitrogen公司的MidPrep试剂盒进行质粒抽提，获得重组杆状病毒载体DNA。
3、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)，在27℃培养72小时，收集含重组杆状病毒(r Bac-AllinOneAAV)的上清。
实施例6，稳定表达Rep蛋白的Sf9细胞系构建1、pIB/V5-his载体(Invitrogen公司)用Hind III酶切，Klenow酶补平后，再用Xba I酶切，回收大片段；pBac-RC用Sma I和Nhe I酶切回收Rep基因，与上述处理的载体用DNA连接酶。用连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性重组克隆，命名为pIB-Rep，提取其质粒DNA备用。质粒构建如图6。
2、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)。在27℃培养48小时后，收集细胞并稀释到1×104细胞/毫升；然后用无抗性的培养基倍比稀释接种到96孔培养板上，过夜培养后用含适当浓度的抗性培养基筛选抗性克隆(具体操作按照Invitrogen公司的说明书)。最后获得稳定表达AAV-Rep蛋白的Sf9细胞系，命名为Sf9-Rep。
实施例7、稳定表达AAV-Cap-Rep蛋白的Sf9细胞系构建1、pIB/V5-his载体用BspH I，Klenow酶补平，回收大片段；pBac-Cap质粒用Avr II+Bst1107I酶切，Klenow酶补平后，回收Cap基因，与上述处理的载体用DNA连接酶。用连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性重组克隆，命名为pIB-Cap，提取其质粒DNA备用。
2、pIB-Cap-K质粒用Hind III酶切，Klenow酶补平后，XbaI酶切，回收大片段；Rep52-Rep78 PCR扩增产物用Sma I+Nhe I酶切回收大片段，与前面处理的pIB-Cap-K质粒载体用DNA连接酶连接。用连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性重组克隆，命名为pIB-Cap-Rep，提取其质粒DNA备用。质粒构建如图7。
3、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)。在27℃培养48小时后，收集细胞并稀释到1×104细胞/毫升；然后用无抗性的培养基倍比稀释接种到96孔培养板上，过夜培养后用含适当浓度的抗性培养基(筛选抗性克隆(具体操作按照Invitrogen公司的说明书)。最后获得稳定表达AAV-Cap-Rep蛋白的Sf9细胞系，命名为Sf9-Cap-Rep。
实施例8、稳定携带AAV-ITR的Sf9细胞系构建1、pIB/V5-his载体用EcoR V酶切；Pci I和Sfo I酶切pAAV-MCS，Klenow酶补平，电泳回收携带ITR的片段，将回收片段与载体用T4 DNA连接酶(Promega公司产品)连接，16℃ 6小时后，按分子克隆所述条件转化大肠杆菌DH5α，涂氨苄抗性平板，筛选正确的质粒，获得质粒载体pIB-ITR。提取其质粒DNA备用。质粒构建如图8。
2、上述质粒DNA用Cellfectin试剂(Invitrogen公司)转染Sf9细胞(按试剂盒说明书进行)，转染后细胞培养于Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen公司)。在27℃培养48小时后，收集细胞并稀释到1×104细胞/毫升；然后用无抗性的培养基倍比稀释接种到96孔培养板上，过夜培养后用含适当浓度的抗性培养基筛选抗性克隆(具体操作按照Invitrogen公司的说明书)。最后获得稳携带AAV-ITR的Sf9细胞系，命名为Sf9-ITR。
实施例9、重组AAV病毒颗粒的生产1、材料r Bac-RC、r Bac-ITR、和High-FiveTM细胞2、方法用Grace’s培养基，10％胎牛血清，在27-28℃条件下培养High-FiveTM(Invitrogen公司)昆虫细胞，在生长至80％单层时，用构建的重组杆状病毒(rBac-RC与r Bac-ITR)以2 M.O.I共感染昆虫细胞，在27℃培养72小时后，收集细胞及上清。通过冻融破碎，12000g离心去除细胞碎片，上清加入PEG8000至终浓度为10％，12000g离心获得病毒颗粒沉淀，经氯化铯密度梯度离心，发现在密度为1.37g/ml分离的病毒颗粒是重组AAV颗粒。按照Stratagene公司AAV效价测定步骤测定重组AAV的效价，结果表明每细胞可达2×104病毒颗粒。
实施例10、重组AAV病毒颗粒的生产1、材料r Bac-AllinOneAAV和Sf21细胞2、方法培养Sf21昆虫细胞，在合适的生长密度条件下，用构建的重组杆状病毒(rBac-AllinOneAAV)感染昆虫细胞，在27℃培养72小时后，收集细胞及上清。通过冻融破碎，12000g离心去除细胞碎片，上清加入PEG8000至终浓度为10％，12000g离心获得病毒颗粒沉淀，经氯化铯密度梯度离心，发现在密度为1.37-1.4g/ml分离的病毒颗粒是重组AAV颗粒。按照Stratagene公司AAV效价测定步骤测定重组AAV的效价，结果表明每细胞可达4×104病毒颗粒。
实施例11、重组AAV病毒颗粒的生产1、材料r Bac-Cap-ITR和Sf9-Rep细胞2、方法r Bac-Cap和r Bac-ITR共感染Sf9-Rep昆虫细胞系生产rAAV病毒载体，具体操作同实施例10。结果表明每细胞可达105病毒颗粒。
实施例12、重组AAV病毒颗粒的生产1、材料rBac-RC，r Bac-Cap，r Bac-Rep和Sf9-ITR细胞2、方法r Bac-Rep和r Bac-Cap共感染Sf9-ITR昆虫细胞系生产rAAV病毒载体，具体操作同实施例10。
r Bac-RC感染Sf9-ITR昆虫细胞系生产rAAV病毒载体，具体操作同实施例10。结果表明每细胞可达4×104病毒颗粒。
实施例13、昆虫细胞生产的携带β-半乳糖苷酶基因的AAV感染人胚肾293细胞在上述实施例中ITR之间的多克隆位点上均插入LacZ基因作为报告基因，因为产生的rAAV均携带LacZ基因。检测LacZ基因的表达情况可以反应我们生产的rAAV滴度和生产系统的效率。
用在昆虫细胞中生产的rAAV-LacZ颗粒，感染培养的293细胞，用X-gal染色24小时后，照相，结果见图9。
结果显示，杆状病毒生产的rAAV-LacZ感染人胚肾293细胞可以检测到LacZ的表达。
权利要求
1.一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于该病毒载体为重组杆状病毒载体，在该载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列这三者中的一个或几个，其中ITR序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。
2.一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞系，其特征在于该细胞系为整合昆虫细胞系，在该细胞系的染色体中整合有腺病毒伴随病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列这三者中的一个或几个，其中ITR序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。
3.一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的方法，利用权利要求1所述的重组杆状病毒载体感染昆虫细胞系或利用权利要求1所述的重组杆状病毒载体感染权利要求2所述的整合昆虫细胞系，高效生产重组腺病毒伴随病毒。
4.根据权利要求3所述的方法得到的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，其特征在于该系统由重组杆状病毒载体和昆虫细胞系组成，或由重组杆状病毒载体和整合昆虫细胞系组成。
5.根据权利要求1所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因。
6.根据权利要求1所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Rep基因和Cap基因。
7.根据权利要求1所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的ITR序列。
8.根据权利要求1所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因和ITR序列。
9.根据权利要求1所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Rep基因、Cap基因和ITR序列。
10.根据权利要求2所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞系，其特征在于所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的Rep基因。
11.根据权利要求2所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞系，其特征在于所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的ITR序列。
12.根据权利要求2所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞系，其特征在于所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的Rep基因和ITR序列。
13.根据权利要求4所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，其特征在于所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、构建有腺病毒伴随病毒Rep基因和Cap基因的杆状病毒载体和构建有腺病毒伴随病毒ITR序列的杆状病毒载体组成。
14.根据权利要求4所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，其特征在于所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Rep基因、Cap基因和ITR序列的杆状病毒载体组成。
15.根据权利要求4所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，其特征在于所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由整合有腺病毒伴随病毒Rep基因的整合昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Cap基因和ITR序列的杆状病毒载体组成。
16.根据权利要求4所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，其特征在于所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由整合有腺病毒伴随病毒ITR序列的整合昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Rep基因和Cap基因的杆状病毒载体组成。
17.根据权利要求1、或5、或6、或7、或8、或9所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于所述的杆状病毒载体为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。
18.根据权利要求3所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒的方法，其特征在于所述所述的杆状病毒载体为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。
19.根据权利要求4、或13、或14、或15、或16所述的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，其特征在于所述的杆状病毒载体为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。
全文摘要
本发明公开了一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体、细胞系、方法及其组成的生产系统。病毒载体为重组杆状病毒载体，细胞系为整合昆虫细胞系，在载体和细胞系中构建或整合有腺病毒伴随病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列这三者中的一个或几个，其中ITR序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。用重组杆状病毒感染昆虫细胞系或整合昆虫细胞系，高效生产重组腺病毒伴随病毒。高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，由重组杆状病毒和昆虫细胞系组成，或由重组杆状病毒和整合昆虫细胞系组成。其优点是重组杆状病毒能自行繁殖，大量提供生产rAAV所需蛋白质或基因组；昆虫细胞系适合悬浮大量培养，降低生产成本；方法简便易行，同时提高生产效率。
文档编号C12N15/86GK1570121SQ0315037
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者赵春文, 周志文, 李月娟, 冯宇霞, 魏玲 申请人:北京三诺佳邑生物技术有限责任公司