专利名称：一种构建人载脂蛋白ai的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，更具体指采用生物工程技术获得人pApoAIm基因的高表达方法，其中包括合成pApoAImPCR引物核苷酸序列的设计、基因突变序列的改造方法、重组工程菌的构建方法、工程菌的发酵优化表达方法、pApoAIm蛋白的提取方法以及pApoAIm蛋白形成二聚体的方法，及它的医学用途。
背景技术：
动脉粥样硬化心脑血管疾病(如冠心病，中风)是中国和西方国家致死疾病中的主要杀手，其主要原因是高血清总胆固醇(Gprdon et al.1981；Stamler et al.1986；Pooling ProjectResearch Goup 1978；Anderson et al.1987)。流行病学调查揭示，血清总胆固醇每增加1％，冠心病危险因素增加2％(NCEPR 1991)。临床研究发现，降低血清胆固醇水平可以减少冠心病的发病率，阻滞动脉粥样硬化的发展(LPCP 1984；Frick 1987)。胆固醇不溶于水，不能在血液转运。它必需与脂蛋白结合才能在血液里转运。人血液里有四种脂蛋白负责胆固醇的运载，它们是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。LDL携带内源或外源胆固醇，穿过血管壁，进入内皮下(subendothelium)。在内皮下，LDL胆固醇被氧化成氧化型LDL胆固醇，并通过清道夫受体被巨噬细胞以胆固醇酯的形式在细胞内积聚。大量胆固醇积聚在巨噬细胞内形成了泡沫细胞。积聚了大量胆固醇酯的泡沫细胞沉积在血管内皮下，形成了动脉粥样硬化斑块核心。资料表明，由LDL运载的胆固醇是导致动脉粥样硬化斑块的主要根源(Goldstein 1989；Vega1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL胆固醇被称为坏胆固醇。胆固醇引起的动脉粥样硬化不但是冠心病的主要原因，同时也是脑血管疾病，如脑血栓形成，中风的重要原因。此外人脑细胞内积聚的高胆固醇酯还可能和老年性痴呆症的形成有关。体内胆固醇来源有内源和外源两种，外源胆固醇来自于饮食，内源胆固醇是自体合成的结果。内源胆固醇合成亢进和家族性高胆固醇血症在西方国家较为普遍。这种疾病必须通过药物治疗控制。在美国，40％以上的成年人的LDL胆固醇(坏胆固醇)含量超过正常水平。由于胆固醇在形成心脑血管病中的重要作用，近十年来，美国及欧洲药厂都把其抗动脉粥样硬化药的研究和开发放到降低血清总胆固醇及LDL胆固醇上。这些药中疗效最显著的有Merck药厂的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市Lipitor。这些药的作用机理都是抑制人体胆固醇合成的关键酶HMG-COA-还原酶。虽然HMG-COA-还原酶抑制药能显著的降低血清总胆固醇，防止及降低动脉粥样硬化和冠心病发生，发展和死亡，但它只能减少内源性胆固醇合成及降低家族性高胆固醇血症引起的冠心病的发展或恶化。用于治疗外源性胆固醇增多引起的动脉粥样硬化，对于消除已进入巨噬细胞内的胆固醇和抑制由此导致的动脉粥样硬化形成，对于去除动脉粥样斑块中积聚的胆固醇，使动脉粥样硬化血管回复正常，则作用不大或无能为力。换句话说，目前欧美市场流行的抑制动脉内源性胆固醇生成药物不能从根本上治疗广义的动脉粥样硬化心脑血管疾病。
医学研究证明，巨噬细胞吞噬和积聚胆固醇，转换成泡沫细胞，在血管壁内皮下沉积是动脉粥样硬化斑块形成的基础。清除积聚在血管壁巨噬细胞和泡沫细胞内的胆固醇，将其转运到肝脏分解，是治疗单纯降低血清胆固醇所不能达到的，根治动脉粥样硬化心脑血管疾病的最新有效手段，清除巨噬细胞或泡沫细胞及动脉粥样硬化板块内胆固醇的唯一有效武器是。近年来，西方心血管疾病研究人员及制药公司开始把研究方向转到新一类抗动脉粥样硬化的药物，即升高高密度脂蛋白(HDL)的药物。高密度脂蛋白(HDL)是一种重要的胆固醇载体，它在运载胆固醇方面与LDL截然相反。HDL可以刺激血管内皮巨噬细胞内胆固醇酯的水解，并将水解的非酯化胆固醇从巨噬细胞内转运至肝脏内分解。更为重要的是，HDL能刺激沉积于血管壁和血管壁动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞/泡沫细胞内胆固醇酯水解。非酯化胆固醇被HDL从泡沫细胞转运至肝脏分解(Alan et al.1996)。从而去除了动脉粥样硬化赖以形成的基础。所以HDL的重要功能被称为胆固醇逆向转运(ReverseCholesterol Transportation)。胆固醇逆向转运的结果是(1)抑制胆固醇酯在局势细胞内积累，阻止其转化为泡沫细胞，从而防止了动脉粥样硬化的形成；(2)因为HDL具有独特的转运动脉粥样硬化斑块内泡沫细胞里胆固醇至肝脏分解的作用，从而使动脉粥样硬化血管壁逐步回复正常。HDL的此二项功能一直是西方医学界在治疗动脉粥样硬化病中梦寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬细胞吞噬，产生泡沫细胞。HDL还可以刺激内皮细胞释放前列环素(PI)增加胆固醇酯水解和胆固醇转运出细胞。HDL的作用对象不分内源和外源胆固醇。基础及临床研究证实，每增加1mg/dl HDL胆固醇，冠心病死亡危险即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血浆是比高血浆胆固醇更重要的致动脉粥样硬化及冠心病的危险因子(Alan et al.1996)。
提高血浆HDL含量的机理是什么呢？简单的说是提高HDL合成过程中关键酶或蛋白的含量，这些酶或蛋白中起最重要作用的是ApoAI。
流行病和转基因动物实验研究结果证实，血浆ApoAI可以抑制动脉粥样硬化的形成和发展(Castelli et al.1977；Rutin et al.1991)。ApoAI含量降低，动脉粥样硬化发病率升高(Castelli et al.1986；Rutin et al.1991)。
ApoA-IMilano是ApoA-I的突变体(Arg173→Cys)，首次发现在意大利米兰地区。ApoA-IMilano易形成二聚体形式，ApoA-IMilano/ApoA-IMilano与ApoA-I相比，无脂的ApoA-IMilano/ApoA-IMilano含有更多的α-螺旋和折叠度更高的三级结构。与磷脂结合形成两种rHDL即7.8nm和12.5nm，分别含有1个和2个ApoA-IMilano/ApoA-IMilano分子。在相同条件下，ApoA-I主要形成9.6nm的rHDL，也可得到7.8nm和12.7nm的rHDL。两者相比之下，ApoA-IMilano/ApoA-IMilano激发胆固醇逆转运的效率要比ApoA-I要高的多。
人ApoAIMilano可以二聚体肽的形式存在，这种结构形式的变化使得两者在理化性质及生物学活性上都发生了很大的改变。人ApoAI在未与脂结合时其α—螺旋结构为43％，与脂结合后为73％，而人ApoAIMilano在未与脂结合时的α—螺旋结构为65％，与脂结合后则上升为78％。α—螺旋结构是载脂蛋白生物学功能的表现结构，α—螺旋结构含量的升高，体现了与脂结合的能力增加和形成HDL的能力增加，也就是生物学功能的增加。人ApoAIMilano的α—螺旋结构明显地多于人ApoAI，其生物学功能也极大较之人ApoAI强。在理化性质方面，人ApoAI的酸碱耐受性范围为pH3.5-10，而人ApoAIMilano则是pH1.7-12.8。说明人ApoAIMilano结构的稳定性比人ApoAI好。近来的临床研究表明，人ApoAIMilano在体内的半衰期也比人ApoAI长。
pro-ApoAImilano是人体内载脂蛋白ApoAImilano的蛋白原形式，整个蛋白由249个氨基酸组成，其基因全序列为747bp(见图3)，该蛋白质的等电点在5.16-5.60。
发明内容
本发明的目的是采用天然的人pro-ApoAImilano基因，通过构建工程菌来生产蛋白pApoAIm的制备方法。
相比以前的研究，采用天然基因ApoAI构建工程菌生产重组蛋白rApoAI，蛋自在菌体表达的半衰期较短，不超过10min。采用天然pro-ApoAImilano基因进行原核和真核表达的例子还没有。
本发明方法包括目的基因pro-ApoAImilano的制备、表达质粒的构建、工程菌的构建、工程菌的发酵、目的蛋白pro-ApoAImilano的纯化及蛋白二聚体pro-ApoAImilano/pro-ApoAImilano的制备工艺等等。
目的基因pro-ApoAImilano的制备首先是从人源细胞HepG2中提取总RNA(TakaraCompany Kit)，应用RT-PCR技术制备出人pro-Apo AI的基因的cDNA片段，再通过cDNA PCR制备出人pro-Apo AI的基因，然后应用直接定点突变的方法制备成pApoAIm基因。
在得到pApoAIm基因之后，可以将该基因用于原核系统表达，也可用于真核系统表达以获得所需要的目的蛋白，原核表达系统用的最为广泛和最为成熟的是大肠杆菌表达系统，用于该系统的表达质粒的构建首先是将PCR制备的目的基因经琼脂糖凝胶电泳分离，QIAGEN公司的胶回收片段柱纯化后，取100ng与50ng pGEM-T进行连接，于4℃连接过夜。取5μL连接液转化100μLBL21感受态细胞，转化细胞经42℃热脉冲，37℃培养1h后涂于氨苄青霉素平板，37℃培养过夜。挑取单菌落提取质粒，进行酶切鉴定和基因的DNA序列测定，测定结果完全正确后再将基因从pGEM-T载体上切下，克隆到表达载体pET12a上，构建成表达重组质粒pET12a/pApoAIm(图2)。再将表达质粒pET12a/pApoAIm转化进入大肠杆菌宿主细胞E.coli BL21，组建成表达工程菌BL21/pET12a-pApoAIm。
真核表达系统用的较为广泛的有酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳细胞表达系统，其中酵母表达系统又包括酿酒酵母和毕赤酵母两大类。用于酵母表达系统时，可将pApoAIm基因分别克隆到载体pYES和pPIC9K上，经线性化后，将pYES整合到酿酒酵母Scerevisiae的染色体上，将pPIC9K整合到毕赤酵母P.pastoris的染色体上，得到应用于酵母表达的工程菌。用于昆虫和哺乳细胞表达系统可将pApoAIm基因分别克隆到载体pBlueBacIII和pHSI上，再将pBlueBacIII转染昆虫细胞Sf-9，将pHSI转染哺乳动物细胞CHO，以分别用于目的pApoAIm的表达。
进一步可将pApoAIm基因亚克隆质粒范围延伸到能用于表达pApoAIm蛋白的各种表达质粒及其相对应的大肠杆菌菌株、酵母菌菌株、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
在完成上游构建之后，细胞培养成为关键，其中包括培养基的选择和培养条件的优化，培养基的选择应考虑到细胞所需的一切营养成分，其中有碳源、氮源、微量元素和一些生长因子。培养条件是细胞生长和表达目的产物的前提条件，培养条件的优化重点在于对于营养物质的合理利用，优化的目的在于维持细胞良好的生理状态，其影响因素包括温度、pH、溶氧及营养物质的流加控制等等。
在应用大肠杆菌表达系统生产pApoAIm时，当培养基中营养物质消耗殆尽时，细菌的有氧代谢迅速减缓，导致培养液中溶解氧迅速升高，加入营养物质后溶解氧又会迅速下降的道理，通过溶氧反馈控制搅拌转速和营养成分的限制性补料，使培养基中营养物质保持在相对较低的浓度，控制合适的比生长速率和工程菌良好的生理状态，减少有害副产物的生成和积累。目前控制菌体生长的方式一般都采用限制碳源的方法以获得菌体高密度培养，因此在调控上同时辅助pH进行观察，当流加碳源过量时，pH下降得较快，低于设定值，这时减缓补料；反之则加快补料。基于上述原理进行BL21/pET12a-proApoAIm工程菌的溶氧反馈调节-限制性补料高密度发酵，发酵过程中在菌体生长阶段将PH值控制在6.9～7.0之间，温度控制在30℃，诱导时添加IPTG至终浓度100μM，并将温度升至37℃，溶氧控制≥40％。补料流加从第5h开始，当菌密度OD600＝30左右开始升温诱导，诱导时间为8-12h，至发酵结束，菌体浓度OD600达到40左右，收获菌体。
由于得到的目的蛋白是包涵体形式，所以将收集的菌体与配好的溶菌酶溶液按1∶10(w/v)的比例混匀，冰浴0.5h，在冰浴中进行超声破碎20～40次(每次30s，间隔30s)，破菌结束后，12000r/min 4℃离心20min，弃上清。以1∶10(w/v)缓冲液搅拌悬浮沉淀部分30min，12000r/min 4℃离心20min，弃上清，连续2-5次，这样得到粗制的蛋白质。
然后将包涵体同5～10(w/v)变性液进行混合以溶解包涵体，将所得的包涵体变性溶液以12000g离心25min，收取上清，加入硫酸铵至终浓度为1mol/L，上疏水柱(Resource_1mL_HIC_ISO)进行复性。其中控制上柱和洗脱流速为1ml/min；将疏水柱上之蛋白洗脱峰，上离子交换柱(Q Sepharose_HP-60/100)进一步纯化，洗脱5倍床体积，收集蛋白峰。然后将纯化得到的proApo AIm蛋白相对于25mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0进行透析4h以上，然后制备成浓度为3-5mg/mL的溶液，加入氧化型的谷胱甘肽(GSSG)至终浓度为3-5mM，再相对于25mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0(含有30-50mM的氧化型谷胱甘肽(GSH))进行透析，48h后取样检测二聚体的形成。纯化得到的pApoAIm蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测、体外生物活性检测和单克隆抗体检测，以确证所获蛋白的正确。
图1是proApoAIm基因的PCR引物。
图2是proApoAIm表达质粒pET12a/proApoAIm质粒结构图。
图3是由PCR合成的proApoAIm基因的测序结果。
图4.是工程菌BL21/pET12a-pApoAIm在5L发酵罐中发酵过程曲线。
图5是proApoAIm表达后的SDS-PAGE电泳结果(考马斯亮兰染色)。箭头所指为proApoAIm表达产物电泳条带。
图6是proApoAIm单克隆抗体(Elisa)检测结果。上图为标准曲线，下图为样品测试曲线。
图7是proApoAIm表达产物的体外生物学活性脂结合实验结果。红线代表诱导前细胞提取物的测试结果；黑线代表诱导后细胞提取物的测试结果。
图8是包涵体确认实验，其中1为未破碎菌体；2～5分别为超声破碎10s，20s，40，60s后离心的沉淀部分；1`～4`为超声破碎10s，20s，40，60s后离心的上清部分，A为ApoAI标准蛋白。
图9a是表达产物proApoAIm疏水柱复性过程洗脱图谱。
图9b是疏水柱复性过程电泳(1包涵体溶解液；2，3，4，6，7，8穿峰；9，10洗脱峰；5 Marker(116.0，66.2，45.0，35.0，25.018.4，14.4kDa))。
图10a是离子柱纯化过程洗脱图谱。
图10b是离子柱纯化电泳检测(1原液；2Q柱上纯化后蛋白；3穿峰；4，5洗脱峰；6Marker(116.0，66.2，45.0，35.0，25.018.4，14.4kDa))。
图11a是最终纯化的proApoAIm蛋白SDS-PAGE电泳银染图谱，1为标准marker，2为柱纯化收峰样品。
图11b是最终纯化的proApoAIm蛋白Western-Blotting图谱，1为标准marker，2为最终纯品。
图12是纯化的proApoAIm的体外生物学活性脂结合实验(随着游离脂的逐渐被结合、减少，OD值随之下降)。
图13是中4为标准分子量蛋白，3是柱纯化后proApoAIm蛋白的单体和少量二聚体的混合物；2是自然条件下空气氧化部分形成proApoAIm蛋白的二聚体肽；3是加入GSH-GSSG系统后单体完全形成proApoAIm蛋白的二聚体肽，56KD。
图14是绘制的t-PA标准曲线。
本发明有益效果1、proApoAIm比Apo AIm性质稳定。在大肠杆菌表达体系中我们采用的T7启动子表达载体pET12a，用IPTG诱导目的蛋白的生产，产生的蛋白是包涵体，蛋白的包涵体形式能有效防止蛋白水解酶对异源蛋白的水解，且对细菌的毒性较小，因此在细菌体内能大量积累。
2、本发明所采用的的工程菌的构建方法、工程菌发酵的优化方法及蛋白纯化方法等都对提高proApoAIm蛋白的产量提供了科学的指导和实践，在类似的生物制品的研发中都有重要的指导作用。
具体实施例方式
实施例一.材料1.PCR-Kit购于TaKaRa公司，限制性内切酶、Taq酶、T4DNA连接酶、T4多聚核苷酸激酶及DNA分子量标准分别购自TaKaRa公司、Promega公司和晶美公司。
2.菌种与质粒BL21(已商品化，市场购得)、pET12a(购自Invitrogen公司)为本实验室保存；pGEM-T购自TaKaRa公司；pET12a/proApoAIm为本实验室构建。
3.PCR引物由上海生化细胞研究所合成。
4.试剂抗人Apo Al单克隆抗体购自Chemicon Interational Inc.，Tris和SDS购自AMRESCO，Ni-NTA Agarose购自Invitrogen。
二.方法1.proApoAIm基因DNA片段制备及工程菌构建(1)细胞提取总RNAi.取10mg人肝细胞HepG2用1mL TES洗涤，离心弃除上清。
ii.加1mLTrizol缓冲液剧烈振荡转移至1.5mL的eppendorf管中。
iii.加200μL氯仿剧烈振荡，室温静置5min，4℃ 12500×g离心5min。
iv.取上清(＝400μL)加500μL异丙醇，用手轻摇混匀静置5min然后于4℃12800×g离心15min。
v.弃上清，沉淀用70％在4℃预冷的乙醇(RNase Free H2O)洗3次，敞口凉干1h。VI.沉淀用50μL RNase Free H2O溶解，取5μL提取的RNA，加695μL水稀释至700μL，测A260/A280比值，当比值为1.8时证明提取RNA较纯。稀释RNA至1～1.2μg/μL，待用。
(2)RT-PCR(V＝20μL)2×Bca 1st Buffer 10μL25mM MgSO4 4μL10mM dNTP 1μLRNase Inhibitor(40U/μL)0.5μLOligo dTPrimer 1μLRNA 1μLRNase Free H2O 1.5μLBcaBEST polymerase 1μL反应条件65℃保温1min后在30℃保温5min，再在15min内缓慢升温至65℃(每30s升温1.2℃)，保温15min，随后在98℃保温5min灭活反转录酶，然后在5℃保温5min。
(3)cDNA PCR(V＝100μL)25mM MgSO4 6μL5×Bca 2nd Buffer 16μL引物2H(20μM) 1μL引物6(20μM) 1μLdH2O 55.5μLRT-PCR产物 20μLBca-Optimized Taq 0.5μL反应条件先在94℃反应1min，再按如下温度和时间参数下扩增30个循环94℃ 30s，56℃ 30s，72℃2min。之后于72℃延伸10min。反应结束后，取反应液5～10μL经1.5％琼脂糖电泳，检查有无特异性带。
(4)目的片段回收准备1.5mL eppendorf管去盖，上面套上0.5mL去盖的eppendorf管，敞光下在0.5mL去盖的eppendorf管内塞少量的硅烷化过的玻璃棉。将切下的DNA片段放管内，加入200μL DNA回收液(盖没胶，管底部不可有气泡)，室温避光放置20min，再在-80℃低温冰箱放置20min。
取出0.5mL eppendorf管，在底部刺洞，离心10000rpm×10min，将1.5mL eppendorf管内液体转移至另一1.5mL eppendorf管内(＝250μL)，加入500μL冷的无水乙醇，混匀后在-80℃低温冰箱放置20min，离心12800rpm×20min，弃上清后用70％的冷乙醇洗涤3次，真空干燥。
DNA回收液1mM EDTA，pH7.0；0.3M NaAC配制10mL回收液0.5mM EDTA 20μL，3M NaAC 1mL，ddH2O8.8mL。
(5)目的片段加尾(V＝10μL)PCR纯化产物7μL10×Taq Buffer 1μL2.5mM dATP 1μLrTaq DNA聚合酶(5U/μL) 1μL依次混合以上成分，在70℃下反应30min。
(6)制作高效率的感受态菌接菌到3ml LB培养基中，37℃培养过夜↓取0.5ml菌液接种于50ml A液中，37℃培养1-1.5h↓冰浴10min↓5000rpm×10min×4℃↓弃上清，沉淀加0.5mL A液、2.5mLB液混匀↓以100uL为一管分装后冻于-80℃保存。2h之后可以使用。
A液(灭菌使用)LB，0.12g MgSO4/50mL，250μL 40％葡萄糖B液(灭菌使用)LB，36％甘油，12％PEG8000，12mM MgSO4(7)T—载体亚克隆PCR制备的目的基因经琼脂糖凝胶电泳分离，QIAGEN公司的胶回收片段柱纯化后，取100ng与50ng pGEM-T进行连接，于4℃连接过夜。取5μL连接液转化100μLBL21感受态细胞，转化细胞经42℃热脉冲，37℃培养1h后涂于氨苄青霉素平板，37℃培养过夜。挑取单菌落提取质粒，进行酶切鉴定。
(8)pET12a/ proApoAIm表达载体的构建采用PCR技术制备的两段基因片段2H-B，A-6(引物序列见图1)。2H-B片段5’-端设计有BamHI限制性内切酶序列，3’-端设计有SalI限制性内切酶序列；A-6片段5’-端设计有SalI限制性内切酶序列，3’-端设计有BglII限制性内切酶序列。A-6片段中有一个密码子CGC改换成了TGC(Arg→Cys)。在proApoAIMilano基因的上游，PCR制备的两段基因片段首先亚克隆到pGEM-T载体上，然后转化入DH5α宿主细胞，培养后挑取菌落提取质粒进行限制性内切酶酶切鉴定，再将酶切鉴定正确的重组质粒进行DNA序列测定。测定的结果与文献报道完全一致。将正确的proApo AIm两段基因片段以BamH I/SalI、SalI/BglII限制性内切酶分别从pGEM-T载体上切下，再将表达载体pET12a用BamHI、BglII限制性内切酶消化后按下列方式进行拼装连接，构建重组表达质粒pET12a/proApoAIm。重组质粒转化E.coli BL21感受态受体菌中，涂平板培养过夜，然后挑取白色菌落抽质粒鉴定，从而得到BL21/pET12a-proApoAIm表达工程菌。
6.BL21/pET12a-proApoAIm表达工程菌的发酵当培养基中营养物质消耗殆尽时，细菌的有氧代谢迅速减缓，导致培养液中溶解氧迅速升高，加入营养物质后溶解氧又会迅速下降的道理，通过溶氧反馈控制搅拌转速和营养成分的限制性补料，使培养基中营养物质保持在相对较低的浓度，控制合适的比生长速率和工程菌良好的生理状态，减少有害副产物的生成和积累。目前控制菌体生长的方式一般都采用限制碳源的方法以获得菌体高密度培养，因此在调控上同时辅助pH进行观察，当流加碳源过量时，pH下降得较快，低于设定值，这时减缓补料；反之则加快补料。基于上述原理进行BL21/pET12a-proApoAIm工程菌的溶氧反馈调节-限制性补料高密度发酵，发酵过程中在菌体生长阶段将PH值控制在6.9～7.0之间，温度控制在30℃，诱导时添加IPTG至终浓度100μM，并将温度升至37℃，溶氧控制≥40％。补料流加从第5h开始，当菌密度OD600＝30左右开始升温诱导，诱导时间为10h，至发酵结束，菌体浓度OD600达到40左右，收获菌体。
7.蛋白proApoAIm的分离纯化(1)菌体破碎将收集的菌体与配好的溶菌酶溶液(1mg/mL，10mM Tris buffer，pH8.0)按1∶10(w/v)的比例混匀，冰浴0.5h，在冰浴中进行超声破碎20～40次(每次30s，间隔30s)，破菌结束后，12000r/min 4℃离心20min，弃上清。
(2)包涵体洗涤以1∶10(w/v)缓冲液(1％Triton X-100(v/v)，Tris-HCl 50mmol/L，pH7.0，EDTA 1mmol/L，Urea 2mol/L)搅拌悬浮沉淀部分30min，12000r/min4℃离心20min，弃上清，连续三次。
(3)包涵体溶解将包涵体以5～10(w/v)变性液(Urea 8mol/L，Tris-HCl 50mmol/L，(NH4)2SO41mol/L，EDTA 10mmol/L，DDT 10mmol/L，pH8.0)(4)蛋白质复性和纯化i.疏水柱(Resource 1mL HIC ISO)复性将所得的包涵体变性溶液以12000g离心25min，收取上清，加入硫酸铵至终浓度为1mol/L，上柱复性。
流速1ml/min上柱缓冲液50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，8mol/L尿素，1mol/L硫酸铵，pH8.0洗柱缓冲液50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，1mol/L硫酸铵，pHg.0，洗涤10倍床体积洗脱缓冲液50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，pH8.0，洗脱，收集蛋白峰ii.离子交换柱(Q Sepharose HP-60/100)纯化将疏水柱上之蛋白洗脱峰上离子交换柱进一步纯化流速1mL/min上柱缓冲液50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，pH8.0洗柱缓冲液50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，pH8.0，洗涤5倍床体积洗脱缓冲液50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，1mol/L NaCl，pH8.0，洗脱5倍床体积，收集蛋白峰8.二聚体肽的形成上一步纯化得到的proApo AIm蛋白相对于25mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0进行透析4h以上，然后制备成浓度为3-5mg/mL的溶液，加入氧化型的谷胱甘肽(GSSG)至终浓度为3-5mM，再相对于25mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0(含有30-50mM的氧化型谷胱甘肽(GSH))进行透析，48h后取样检测二聚体的形成。
9.proApoAIm蛋白的检测(1)单克隆抗体测定单克隆抗体检测发酵液中和纯化后的proApoAIm蛋白质含量。单克隆抗体反应采用ELISA方法进行，抗体购自Chemicon International Inc.，抗体首先用包被液按1∶500稀释，加于96孔板上，每孔加入50μL，置于37℃培育2h，然后用去离子水洗涤，再加入200μL/孔封闭液，于37℃放置30min，用去离子水洗涤，加入测定抗原50μL/孔，37℃反应1h，用去离子水洗涤，加入1∶500稀释的酶标抗体(二抗)，每孔加50μL，于37℃反应1h，用去离子水洗涤，加入底物显色液邻苯二胺试剂100μL到每孔，37℃反应30min，加显色终止液到每孔，最后在分光光度仪上于OD492nm进行检测。
(2)Western Blot检测纯化后的人proApoAIm蛋白质走SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上进行Western Blotting检测，检测方法如下
i.SDS-PAGE凝胶电泳结束后，把凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下。
ii.切4张Whatman 3MM滤纸盒一张硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶的大小吻合，以免造成电流短路而使蛋白质不能从凝胶向滤膜转移。用铅笔在滤膜左下角作好标记。
iii.将硝酸纤维素滤膜漂浮于一篇去离子水的水面上，借毛细作用使之从下往上湿润后，将之浸没于水中，浸泡5min以上以驱除留于滤膜上的气泡。
iv.在一浅托盘中加入少量转移缓冲液(见附录)，把4张3MM滤纸浸泡于其中。
v.戴上手套按如下方法安装转移装置a.平放底部电极(阳极)，在这一电极上放置依次3块海绵和3张用转移缓冲液浸泡过的3MM滤纸。
b.把硝酸纤维素滤膜放在3MM滤纸上(光滑一面朝下)，3MM滤纸与硝酸纤维素滤膜之间不能留有气泡。
c.将漂洗过的凝胶准确平放于硝酸纤维素滤膜上。
d.把最后3张3MM滤纸和3块海绵依次放在凝胶上方，并排除气泡。
vi.25V，300A转移1h。
vii.将转移后的硝酸纤维素滤膜在去离子水中略为漂洗一下，放入1％BSA(用PBST配制，封闭液)中，37℃封闭1h。
viii.用1％BSA(含10％小牛血清)1∶1000稀释一抗，4℃过夜(37℃，1h)。
ix.0.9％NaCl(或PBST)洗硝酸纤维素滤膜3次，每次5min。
x.用1％BSA(含10％小牛血清)1∶2000稀释二抗，4℃过夜，(37℃，30min)。
xi.0.9％NaCl(或PBST)洗硝酸纤维素滤膜3次，每次5min。
xii.将膜浸没在上述溶液中于暗处显色，当出现肉眼可见的一条带后，用去离子水漂洗终止反应，拍照保存。
(3)体外磷脂结合试验纯化后的产物体外脂结合试验是采用磷脂结合试验DMPC(Dimyristoylphosphatidylcholine，二豆蔻酰卵磷脂)溶解于缓冲缓冲液(8.5％KBr，0.01％azide，0.01％EDTA，0.01Mtris，pH7.4)中，放置24h，在3.9℃时剧烈振荡，取终浓度为0.5mg/ml的DMPC和2.65mg/ml标准ApoA I，于24℃分别放置10min，然后以PC/ApoA I＝5∶1(w/w)的比例混合，制作标准反应；再取一定量的proApoAIm按上述比例加到DMPC液中，在23℃或26℃每间隔2min于325nm读取一次OD值，直至1h，然后以log OD相对时间作图，获取读数。
(4)t-PA生物活性检测纯化后的蛋白制成二聚体形式proApoAIm/proApoAIm，按如下方法进行t-PA生物活性试验i.脂质体制备取150μL proApoAIm(200μg/mL)，加50μLEPC(1.48mg/mL)，按EPCproApoAIm＝2.47∶1(w/w)比例配制混合液，超声3min混匀，24℃静置1h。按同样方法用人血清ApoAI标准品做好对照，同时用EPC做空白对照。
ii.活性测试首先制t-PA活性标准曲线，再将样品100μL加入酶标板孔内，另用1ml缓冲液将发色底物、共价物、纤溶酶原混合在一起，吸取100μL加入到样品中，37℃湿盒中保温约3h，加30μL终止液终止反应。以标准品中的1号孔(不含t-PA)调零点，在酶标仪上测定各孔A405值。
三、实验结果1.PCR产物鉴定将pApoAIm基因亚克隆到pGEM-T载体上，以T7启动子作序列分析引物，交上海生工(Sangon)公司作PCR产物鉴定测定。实验结果显示两端序列均与预期序列一致，测定结果见图3。
2.工程菌BL21/pET12a-proApoAIm的高密度发酵通过在5L和50L发酵罐的发酵培养，从图4中可见0-4h是细菌潜伏期，4-22h是对数生长期，此阶段细菌的比生长速率μ控制在0.3-0.6h-1之间；第14h开始升温诱导目的蛋白的表达。10h后细菌生长明显减慢。22-26h细菌进入生长稳定期，此时比生长速率μ降至0.05h-1。但此时发酵液中碳氮源的消耗却增加，说明诱导过程中营养和能量主要用于外源基因的表达上。到培养结束后菌体密度OD600达到42。
3.发酵菌体中表达产物的检测(1)SDS-PAGE电泳检测表达产物的分子量诱导表达后的菌体取1mL离心去上清，沉淀加入100μL的SDS-PAGE电泳上样缓冲液，100℃煮沸3min，室温静置15min，取10μL上样进行SDS-PAGE电泳。结果在分子量靠近30kd(28kd)处产生了明显的表达条带，并且由图中可以看到诱导1h开始proApoAIm开始表达量就由诱导前的0.16％急剧升高至15.5％，到诱导结束，proApoAIm的表达量达到45.3％(见图5)。
(2)单克隆抗体检测表达产物诱导表达后的菌体取1mL离心去上清，沉淀加入6M的盐酸胍(pH8.0)处理后体积较原体积放大一倍相对磷酸缓冲液透析过夜，然后用ELISA方法进行单克隆抗体测定。测定结果证明表达产物能被抗人ApoAI单克隆抗体所结合，表明表达产物是正确的(见图6)。
(3)表达产物的磷脂结合试验按上述方法处理的样品进行磷脂结合试验，测定其体外生物活性。测定的结果证明表达产物能与磷脂结合形成复合物，该表达产物生物学活性正是Apo AI生物学活性的特征，同样说明我们的表达产物是正确的(见图7)。
4.蛋白质纯化(1)包涵体确认试验取不同超声破碎时间的样品，将上清和沉淀部分进行电泳对照可以发现，随着菌体破碎程度的增加，离心后在沉淀部分proApoAIm蛋白的含量越来越多，因此可证明proApoAIm蛋白在大肠杆菌的表达形式是包涵体(见图8)。
(2)疏水柱复性通过疏水柱(Resource 1mL HIC ISO)进行复性，洗脱后得到单一洗脱峰(见图9a)，电泳结果见图9b。
(3)离子交换柱纯化离子交换柱(Q Sepharose_HP-60/100)过柱纯化，获得提纯的蛋白。详细见图10a，蛋白电泳后用考马斯亮兰染色，结果见图10b。
5.纯化样品的性质实验(1)SDS-PAGE电泳检测纯化产物表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳检测，经银染(银染试剂盒，Sigma)检测，结果为分子量28KD的单一样品电泳条带(见图11a)。
(2)Westem Blotting检测纯化产物表达产物经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜上进行抗体结合检测，鼠抗人ApoAI蛋白的单克隆抗体检测结果证实，在分子量28KD处出现了一条深的单抗显色条带(见图11b)，证明了获得的纯化产物是proApoAIm蛋白。
(3)二聚体肽形成测定纯化后的单链蛋白质经复性处理后，SDS-PAGE电泳检测结果证明已形成了分子量为56KD的双肽链聚合分子，并证明第143位上精氨酸(Arg)已变为半胱氨酸(Cys)。因为二硫键只发生在含硫Cys之间。经复性处理后两条蛋白链的Cys残基之间形成了二硫键，使两条蛋白链聚合在一起，变成了二聚体(见图12)。
(4)纯化产物的脂结合检测纯化后的proApoAIm蛋白进行体外脂结合生物学活性检测，其结果完全与Apo AIMilano的生物学功能一致(见图13)。
(5)t-PA生物活性检测将纯化产物进行t-PA生物活性检测，结果与人血清ApoAI的t-PA生物活性相比，前者是后者的10～20倍(见表1)。
表1蛋白proApoAIm体外t-PA生物活性检测结果Blank 标准ApoAI纯化后的proApoAImPC-0 0.010751 0.182763PC+0 0.082423 0.247268-未加EPC混合；+与EPC混合
权利要求
1.一种获得高活性的人载脂蛋白pro-ApoAIm的制备方法由下列步骤组成a、设计pApoAImPCR引物核苷酸序列制成pro-ApoAIm基因；b、构建表达基因PET12a/PApOAIm重组质粒；c、工程菌构建；d、构建的工程发酵；e、pro-ApoAIm蛋白的纯化；f、pro-ApoAIm蛋白二聚体的制备。
2.根据权利要求1所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于制备pApoAIm的PCR引物核苷酸序列为2H’GGATCCATGCGTCATTTCTGGCAACAAGACGAACCGCCGCAGAGCCCCTGGGATCGAGTGAAG3’(BamHI)A5’GTCGACGCGCTGCGTACCCACCTGGCTCCTTACAGCGACGAGCTGCGTCAGTGCTTG3’(SalI)B5’GTCGACGTGAGCACGCGCACGGTCACGCATCTCC 3’(SalI)65’AGATCTTTATCACTGGGTGTTGAGCTTCTTGGTG3’(BglII)制得pro-ApoAIm基因cDNA片段通过PCR得人pro-ApoAIm基因，通过DNA引物设计直接导致蛋白第173位氨基酸点突变制成pro-ApoAIm表达基因。
3.根据权利要求1所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于pro-ApoAIm基因亚克隆到载体上DNA测序再克隆到表达载体PET12a上，构建表达基因PET12a/pro-ApoAIm重组质粒。
4.根据权利要求1所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于PET12a/PAPOAIm重组质粒转入真核系统表达或转入原核系统表达，构建表达工程菌。
5.根据权利要求4所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于pro-ApoAIm基因分别克隆到载体pYES和Ppic9K上，经线性化后，将pYES整合到酿酒酵母S.cerevisiae的染色体上，将pPIC9K整合到毕赤酵母P.pastoris的染色体上，得到应用于酵母表达的工程菌。
6.根据权利要求4所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于pro-ApoAIm基因分别克隆到载体pBlueBacIII和pHSI上，再将pBlueBacIII转染昆虫细胞Sf-9，将pHSI转染哺乳动物细胞CHO，以分别用于目的pro-ApoAIm的表达。
7.根据权利要求4所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于PET12a/pro-ApoAIm重组质粒转入原核细胞时应用大肠杆菌作为宿主细胞E.coli BL 21构建BL 21/PET12a/pro-ApoAIm表达工程菌。
8.根据权利要求4所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于将pApoAIm基因亚克隆质粒范围延伸到能用于表达pApoAIm蛋白的各种表达质粒及其相对应的大肠杆菌菌株、酵母菌菌株、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
9.根据权利要求1所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于上述菌体与溶菌酶溶液混匀破菌，缓冲液搅拌悬浮沉淀部分连续2-5次得粗蛋白，用变性液溶介包涵体离心，上清加入(NH4)2SO4，上疏水柱复性，得疏水柱蛋白冼脱峰，上离子交换柱子，收集蛋白峰得纯pApoAIm蛋白。
10.根据权利要求6所述的pro-ApoAIm的制备方法，其特征在于得到的pro-ApoAIm的纯化蛋白在氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽(GSSG-GSH)缓冲系统中形成pApoAIm/pApoAIm二聚体肽，该二聚体肽与磷脂酰胆碱在24℃条件下形成复合物。
全文摘要
本发明公开了一种构建人载脂蛋白AI
文档编号C12N15/12GK1519321SQ0315070
公开日2004年8月11日 申请日期2003年9月1日 优先权日2003年9月1日
发明者龚邦强, 丁满生, 张梅芳 申请人:上海凯曼生物科技有限公司