专利名称：红树甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法
技术领域：
本发明涉及红树甜菜碱醛脱氢酶基因的DNA序列以及包含所说的DNA序列的表达载体，尤指将外源基因引入宿主植物，使之得到表达，从而提高植物耐盐性。
背景技术：
干旱、低温、高盐等环境因素限制了植物的生长和农作物产量，为应答非生物胁迫，细胞内往往积累一些小分子有机化合物，甜菜碱就是其中之一。甜菜碱是重要的渗透调节剂之一，在自然条件下生物体内合成的甜菜碱主要有两个方面的功能(1)调节在高盐环境和干旱而直接导致细胞内水分随蒸腾作用而丧失。(2)保护细胞膜和酶类，高浓度的甜菜碱可以保护细胞膜和稳定细胞中的生物大分子，如蛋白酶的正常生理功能。植物的甜菜碱醛脱氢酶主要存在于叶绿体基质中，另外，细胞质中也有少量的同功酶。天然状态下的酶是由两个相联的亚基组成，它们分别由核内的两个等位基因编码，甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)最初是从菠菜(Spinaciavleracea)cDNA文库中克隆得到，相继又从山菠菜(Afriplex horfensis)，大麦和甜菜中被克隆；它们之间大多数核苷酸序列都有60％左右的同源性，与大肠杆菌BADH编码序列也有35％左右的同源。
把目的基因导入细胞而进行的高等植物遗传转化是一个高度复杂的过程，它涉及到外源DNA的摄入和体细胞异种环境中的整合、复制、表达和传代。我们在离体条件下把与耐盐相关DNA片段与作为分子载体的质粒DNA进行新的重组，构建了新的植物表达载体，通过农杆菌中介基因感染寄主细胞，诱导植物愈伤组织生瘤并在那里表达。经过在卡那霉素培养基上分化出幼苗，再通过NaCl梯度浓度进行筛选，得到一批耐盐性很高的转基因植株，基因检测证明了外源基因已导入烟草中。
在中国发明专利(申请号97125830.9；申请日1997年12月25日)公开了新的山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因，提供了将该基因转化到宿主植物并使之在其中表达的载体。
发明内容
本发明的目的是提供了红树甜菜碱醛脱氢酶的DAN序列，而所提供的红树BADH基因的序列与前述的基因序列无任何同源关系。
本发明的第二个目的是提供了红树甜菜碱醛脱氢酶基因植物表达载体，以及含有这种载体的宿主细胞，这种宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
本发明的第三个目的是公开一种将红树甜菜碱醛脱氢酶基因转化为植物并在其中表达，从而提高植物耐盐性的方法。
本发明的第四个目的是提供了转红树甜菜碱醛脱氢酶基因的植物，该转基因植物具有高耐盐性。其中所述基因由植物表达载体携带转化植物组织或细胞。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No1所示的DNA碱基序列。
红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No2所示的DNA碱基序列。
红树甜菜碱醛脱氢酶，其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No1所示的碱基序列编码的352个氨基酸。
红树甜菜碱醛脱氢酶，其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No2所示的碱基序列编码的178个氨基酸序列。
一种适于植物细胞中表达的PBI 121载体，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ IDNo2序列。
所述的表达载体，CaMV，35S启动子序列具有SeQ ID No1或SeQ ID No2的核苷酸序列。
一对与红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物的序列上游5′AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC 3′下游3′TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA 5′一种提高植物耐盐性的方法，该方法包括1)构建植物表达载体PBI 121，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ ID No2序列；2)将含RA-BADH基因的植物表达载体PBI 121导入植物细胞；获得抗盐能力提高的转基因后代，包括植物各部分组织。
本发明采用的提高植物耐盐性的方法是把基因转化到植物细胞，转化的植物细胞再生成小植株。
其中的植物为双子叶及单子叶植物，更具体地说，其中的植物为烟草类植物。其中转化过程是农杆菌介导。
并且，其中所述的转化过程包括以下步骤i)提取、纯化红树总DNA；ii)设计出一对与甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物，用红树叶片DNA为模板，扩增得到两特异片段，并克隆所述DNA片段；其中所述与甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物的序列为上游5′AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC 3′
下游3′TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA 5′iii)用双酶切出插入的DNA片段，用双酶切把插入的DNA片段切出；iv)将回收的特异DNA片段与载体进行新的重组，构成植物表达载体，再通过电击法导入农杆菌；其中所述载体为PBI 121载体。
v)活化含有插入的外源基因的农杆菌，并将植物愈伤组织浸泡在含红树甜菜碱醛脱氢酶基因活化的农杆菌菌液中进行培养，直至在培养基上分化了幼苗，然后接种在氯化钠培养基上进行生长。
作为本发明的具体方案，根据甜菜碱醛脱氢酶基因的结构区域，应用生物软件设计一对相应的引物，以红树叶片提取的总DNA为模板，用PCR方法分别扩增得到两条(1.09kb和0.45kb)特异片段，被命名为RA-BADH1和RA-BADH2进一步将RA-BADH DNA片段克隆，并进行了序列分析，全序在GenBank网中查询与曾报道的其它BADH基因的序列存在很大差异，其结果表明，不同物种间的BADH基因的生物活性也存在差异。我们构建了RA-BADH基因的植物表达载体并通过农杆菌介导法对烟草愈伤组织进行遗传转化，获得了四株在2％NaCl培养基上生长良好的转基因植株PCR基因检测均为阳性，而对照在0.5％NaCl培养基上停滞或死亡，排除了烟草本能对环境的相对适应的关系。
1.材料1.1红树叶片，来自深圳红树林自然保护区1.2烟草愈伤组织，深圳创世纪转基因技术有限公司研究中心培育1.3农杆菌由中国科学院微生物所赐，保藏号为LBA44041.4化学试剂购自生工公司具体效果盐生植物在受到外界胁迫的影响细胞中的叶绿体、微粒体和胞质中迅速激活起主效作用的抗逆基因，即甜菜碱醛脱氢酶基因，以合成足够量的甜菜碱调节体内的渗透压并对细胞正常代谢中的一些主要酶类起到有效保护作用。大量的试验充分证明甜菜碱醛脱氢酶基因的活性受盐诱导，在曾经报道过的山菠菜(黎科植物)等，被克隆的BADH基因导入非盐生植物后虽然也有的耐盐性的提高，但是和植物自身对环境耐受力没有明显的区别，我们把红树中的甜菜碱醛脱氢酶基因导入烟草后的试验结果表明，转基因后的植株耐盐性非常明显，这体现了红树与其它盐生植物抗击胁迫能力与BADH活性有关，根据序列分析表明，曾经报道过的不同来源的BADH基因结构序列都有相当大的一部分同源性，而来自红树的BADH基因与上述基因序列无任何同源关系。
本发明的优点是红树BADH基因与其它盐生植物BADH基因编码区的核苷酸序列无任何同源性，其转基因烟草的耐盐性可达到1.5％-2％大大超过其它转基因植物。
图1是Puc-T Vector质粒图。
图2是R1和R2的序列分析图。
图3是R1和R2 DNA片段与PBI 121载体导入农杆菌的序列分析图。
图4是植物表达载体图。
图5是转基因植株在无激素培养基上的生长情况。
图6是转基因植株0.5％NaCl培养基上的生长情况。
图7是在1.5％NaCl培养基上的生长情况。
图8是在2％NaCl培养基上的生长情况。
图9转基因植株的PCR检测。
具体实施例方式
下面结合附图对实施例做进一步的说明材料1.红树叶片，来自深圳红树林自然保护区2.烟草愈伤组织，本研究中心培育。
3.农杆菌由中国科学院微生物所，微生物保藏号为LBA4404。
4.化学试剂购自生工公司实施例1红树总DNA提取、纯化(均按CTAB方法)取红树叶片1g在研磨中磨成粉末状，放在1.5ml微量离心管中；加入500ul的CTAB溶液(100mmol/L Tris-HCl PH8.0，20mmol/L EDTA PH8.0，1.4mol/L NaCl，2％CTAB)和10ul巯基乙醇，振荡混合，65℃温育30min，加等量的三氯甲烷，轻轻摇动5min，12000rpm离心15min然后将液相移到另一新的离心管中；加2倍体积乙醇沉淀DNA，离心1000rpm 10min用500ul 70％乙醇清洗DNA，室温干燥备用。
实施例2设计出一对与BADH基因相关引物上游AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC下游TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA以红树叶片DNA为模板，扩增出两条特异性DNA片段，分别克隆在Pucm-T Vector上并进行序列分析。
实施例3测序R1测序结果AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC TAT GGA GAA TCC ATT GTG GCC ATC TCC ACT GAACAA GAG GAA GAT CCC AAT TCG TTT AAG GAG ACT ATA GAT GAT GTA GAC GCT GAC CATTGG AGG AGT GCA ATG GTT CAG AAA TGA ATT CTA TGT ACA CTA ACT CTA TCT GGG ATC TTGTAG ACA AAC CTG AGG GGG TAA AAC CTA TCG GAT GCA GGT GGG TCT ACA AGA GAA AGAGAG GAA TAG ATG GTA AGG TTG AAA CCT TTA AAG CTA GAT TGG TTG CCA AGG GTT ACACCC AGC GAG AGG GCA TCG ATT ACG AAG AAA CCT TTT TGC CGG TAG CCA TGC TAA AGTCTA TTC GGA TTC TCT TAT CCA TTG CAG CAC ATT TCG ATT ACG AGA TAT GGC AAA TGGATG TCA AGA CCG CTT TCC TTA ATG GAA ATC TTG ACG AAT GCA TCT ATA TGA TGC AACCAG ATG GTT TTA TCC AAA AGG GTC AAG AGC ATA AAG TAT GCA AAC TGA ATA GGT CTATTT ATG GAC TTA AAC AGG CGT CTA GGT CCT GGA ACA TCA GGT TTG ATC AAG CTG TAAGAG ATT ATG GTT TTG ATC AAA ACC CAG ATG AGC CTT GCG TCT ATT AGA AGA TAA AAGGAA AAA GTG TAG TTT TCC TCG TGC TAT ATG TGG ATG ACA TCC TAC TGA TTG GAA ATGATG TGG GGG GTG TTA ACA TTA GCG AAG AAC TGG TTG GCT CAG CAA TTT GAT ATG AGGTCT TGG GAG AAG CAA ATT ATG TTT TGG GAA CAC AAA TCT TGC GAG ATA GGG AAA ACAGGA TGA TTG CTT TAT CCC AAG CCT CAT ACA TTG ACG GAA TAC TGG TGA GGT TTG CTATGC AGA ATT CCA AGA AAG GTC AAA CAC CTT TCA GAC ATG GAA TCC ACT TGT CAC GGGAGC AGT CTC CAA AAA CTC CTA ATG AAG TGG AGT ACA TGA AAC GGG TTC CTT ATA GCTCTG CTC TAG GAA GTC TCA TGT ATG CTA TGC TAT GTA CTC GAC CAG ATA TTT GTT ATGCTG TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAAR2测序结果AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC CTG TCT ACT TTG TTA TTC GGT ACG GAT GCA TCAATG TCT GAT AAA CAA GGA GAT CGC CCT ACA CGA TCA ATT TAA TTA GGA AAA GTA ATTAGT ACA AGT TCC TTG AAA GAG AGG CTC TAC AAT GAA AAT GTC ATT TGA CAC TGA GTTTTT GCA ACG ACA ATA TCG TAC CTA AAA ATT AAG TTT ATA AGA CTA CAT ATC ATC TCAAAA GAC ATG ACA TAT CCT CAC AAT CAA AAA ATG ATT ACA TCT TAC AAT TTC ATA CTAAAA AAT TAT AAC ATA ATA TCA TAA TTA TAA ATA ATA ATA AAA GAA ACG ACA AAG CTTATT TGT AAT GAG GTT GTT TAA ACT ACT AAT TAG CGA TGA CAT TTA TCT CTA ATA CTATAT TTG TAA TTA CTT GTT GCC ATT TGT TAT CCT TTG AGG CGC TTA TTT GAT GTC TCAAGA AAT TAA TTT CAT TAT GGA GAG ATT TAA ATG AGA ACA ACC TCC ATT TTG TGG GGATGG TAC AAG TCT GAA TTC GAAR1，蛋白质一级结构Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Tyr Gly Glu Ser Ile Val Ala Ile GlnIle Glu Aln Glu Glu Asp Tyr Asn Gln Phe Lys Glu Arg Ile Asp Asp AspAsp Ala Asp Ile Trp Gln Ser Ile Met Val Gln Asn Glu Ile His Trp Thr His TyrHis Trp Gly Gln Leu Tyr Thr Asn Leu Gln Gly Asn Asn His Ala Asp Ile Gly GlyTrp Ser Thr Glu Arg Glu Glu Ile Met Val Gln Leu Asn Pro Phe Lys His Asp TrpLeu Pro Arg Val Thr Pro Lys Glu Arg Glu Ile Asp Leu Glu Glu Ser Phe Leu ProVal Ala Met His Lys Trp Ile Gln Ile His Tyr Pro Ile Gln His Trp Glu Trp LysThr Tyr Gly Asn Trp Met Ser Thr Pro Leu Gln Phe Met Glu Gln Leu Lys Asn IleThr Ile Trp Cys Asn Gln Met Val Phe Gln Asn Gln Vol Asn Ser Asn Tyr Ile AsnTrp Ile Gly His Phe Met Asp Phe Asn Gln Arg His Gly Pro Gly Thr Ser Gly LeuIle Lys Leu Tyr Glu Trp Met Val Ile Asn Ser Gln Met Ser Leu Ala Trp Ile PhrThr Leu Asn Glu Asn Val Tyr Phe Ser Trp Cys Tyr Met Trp Met Ser Ser Tyr CysLeu Glu Met Met Trp Gly Val Phe Ser Phe Ala Lys Asn Trp Leu Ala Gln Arg PheAsp Met Arg Trp Trp Glu Lys Arg Trp Met Phe Trp Glu His Asn Trp Cys Glu GlnGly Asn Thr Gly Cys Leu Leu Trp Pro Asn Leu His Ser Leu Lys Glu Leu Trp CysGly Leu His Cys Thr Trp Pro Arg Lys Asp Asn His Leu Ser Asp Met Glu Gln TyrTrp His Gly Ser Ser His Gln Asn His His Met Asn Trp Ser Thr Cys Asn Gly Pheleu Ile Ala Leu His Tyr Glu Val Ser Cys Met His Cys Tyr Val His Asp Gln IlePhe Val Met Leu Trp Gly Trp Leu Lys Leu Trp Glu Phe GluR2，蛋白质一级结构Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Leu Thr Thr Leu Phe Phe Gly Lys AspAla Ser Met Trp Asp Asn Gln Gly Asp Arg Pro Thr Arg Ser Ile Tyr Phe Gly AsnVal Ile Trp Ser Thr Gln Leu Asn Glu Arg His Leu Asn Glu Asn Val Trp Cys HisTrp Val Phe Ile Ser Thr Met Pro Tyr His Asn Trp Lys Phe Met Thr His Gln GlnGln Ser Asn Asp Met Thr Tyr Pro His Asn Arg Asn Met Trp Ser Thr Tyr Asn PheArg His Asn Asn Tyr Asn Gln Glu Ser Arg Phe Arg Gln Gln Gln Asn Glu Lys ThrLys Leu Trp Arg Asn Glu Val Val Tyr Tyr Tyr Asn Leu Arg Cys Gln Phe Thr HisMet His Tyr Leu Asn Phe Leu Val Ala Trp Cys Tyr Pro Leu Gln Arg Phe Phe AspVal Trp Arg Asn Tyr Phe His Tyr Gly Glu Ile Tyr Met Arg Ser Ser Ile Leu TrpGly Gly Trp Tyr Asn Trp Glu Phe Glu实施例4构建植物表达载体，导入宿主细胞用xbaI和sacI双酶切把插入的DNA片段切出，用玻璃奶回收R1和R2 DNA片段与PBI121载体进行新的重组，构建植物表达载体，如图4所示。
取重组植物表达载体2ul(30ng/ul)DNA与枯草芽孢杆菌LBA4404的菌液10ul混合，用加样皿注射到电击杆中，通过高压电击把DNA导入枯草芽孢杆菌细胞中，完成外源DNA直接导入受体细胞。图3是R1和R2 DNA片段与PBI 121载体导入农杆菌的序列分析图。
实施例5农杆菌的活化挑取含外源基因插入的农杆菌单菌落于3ml YEP培养基中27℃培养到OD600≈0.9，500rpm离心5min，收集沉淀重悬在新鲜YEP中，继续培养到OD600≈0.5，然后进行植物转化和转基因植株筛选。
将烟草愈伤组织浸泡在含RA-BADH基因活化的农杆菌菌液中，十五分钟后转移到无激素组培培养基上，在暗室中连续培养三天。其中的无激素培养基包括10％大量元素、1％微量元素、1％有机物质、1％铁盐、0.8％琼脂粉。
再移到室温光照培养，直到在卡那培养基上分化出幼芽，分离幼芽接种在含0.5％NaCl培养基上生长数天。图5是转基因植株在无激素培养基上的生长情况。而图6是在0.5％NaCl培养基上的生长情况。
幼苗生长稳定后，分别接到1.5％和2％NaCl培养基上训化。图7是在1.5％NaCl培养基上的生长情况，图8是在2％NaCl培养基上的生长情况。
从图片对比中可以看出，转基因植株在1％或2％NaCl培养基上表现稳定，训化后的转基因植株具有表现极强耐盐特性，最高耐受2％接近海水灌浇水平，明显区别于对照。
提取转基因植株叶片中的DNA进行PCR分子检测，结果见图9所示，其结果与预期界定的DNA片段大小相吻合，此结果证明了外源基因被整合到烟草基因组中。
盐生植物在受到外界胁迫的影响，细胞中的叶绿体，微粒体和胞质中迅速激活起主效作用的抗逆基因，即甜菜碱醛脱氢酶基因，以合成足够量的甜菜碱调节体内的渗透压并对细胞正常代谢中的一些主要酶类起到有效保护作用。大量的试验充分证明甜菜碱醛脱氢酶基因的活性受盐诱导，在曾经报道过的山菠菜(黎科植物)等，被克隆的BADH基因导入盐生植物后虽然也有的耐盐性的提高，但是和植物自身对环境耐受力没有明显的区别，我们把红树中的甜菜碱醛脱氢酶基因导入烟草后的试验结果表明，转基因后的植株耐盐性非常明显，这体现了红树与其它盐生植物抗击胁迫能力与BADH活性有关，根据序列分析表明，曾经报道过的不同来源的BADH基因结构序列都有相当大的一部分同源性，而来自红树的BADH基因与上述基因序列无任何同源关系。
尽管本发明已作了详细的说明并引证了具体的实例，但对于本领域的普通技术人员，显然可以按照上述说明作出种种替代方案、修改和改动。因此，所有这些替代方案、修正和改动，都应该包括在权利要求的精神和范围之内。
序列表<110>刘，凤华<120>红树甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法<130><160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1061<212>DNA<213>红树属(Rhizophora L.)<400>1agaggatctt cccaattcct gctctatgga gaatccattg tggccatctc cactgaacaa 60gaggaagatc ccaattcgtt taaggagact atagatgatg tagacgctga ccattggagg 120agtgcaatgg ttcagaaaga aattctatgt acactaactc tatctgggat cttgtagaca 180aacctgaggg ggtaaaacct atcggatgca ggtgggtcta caagagaaag agaggaatag 240atggtaaggt tgaaaccttt aaagctagat tggttgccaa gggttacacc cagagagagg 300gagatcgatt acgaagaaac ctttttgccg gtagccatgc taaagtctat tcggattctc 360ttatccattg cagcacattc tgattacgag atatgacaaa tggatgtcaa gaccgctttc 420cttaatggaa atcttgacga atgcatctat atgatgcaac cagatggttt tatccaaaag 480gatcaagaga gtaaagtatg caaactgaat aggtctattt atggacttaa acaggcgtct 540aggtcctgga acatcaggtt tgatcagtct gtaagagatt atggttttga tcaaaaccca 600gatgagcctt gcgtctatta gaagataaaa ggaaaaagtg tagttttcct cgtgctatat 660gtggatgaca tcctactgat tggaaatgat gtggggggtg ttaacattag cgaagaactg 720gttggctcag caatttgata tgaggtcttg ggagaagcaa attatgtttt gggaacacaa 780atcttgcgag atagggaaaa caggatgatt gctttatccc aagcctcata cattgacgga 840atactggtga ggtttgctat ctagaacttc caagaaaggt caaacacctt tcagacatgg 900aatccacttg tcaggtgagc agtctccaaa aactcctaat gaagtggagt acatgaaacg 960ggttccttat agctctgctc taggaagtct catgtatgct atcttatgta ctcgaccaga 1020tatttcttat gctgtgggga tggtacaagt ctgaattcga a 1061<210>2<211>534<212>DNA<213>红树属(Rhizophora L.)<400>2agaggatctt cccaattcct gctcctgtct actttgttat tcggtacgga tgcatcaatg 60tctgataaac aaggagatcg ccctacacga tcaatttaat taggaaaagt aattagtaca 120agttccttga aagagaggct ctacaatgaa aatgtcattt gacactgagt ttttgcaacg 180acaatatcgt acctaaaaat taagtttata agactacata tcatctcaaa agacatgaca 240tatcctcaca atcaaaaaat gattacatct tacaatttca tactaaaaaa ttataacata 300atatcataat tataaataat aataaaagaa acgacaaagc ttatttgtaa tgaggttgtt 360taaactacta attagcgatg acatttatct ctaatactat atttgtaatt acttgttgcc 420atttgttatc ctttgaggcg cttatttgat gtctcaagaa attaatttca ttatggagag 480atttaaatga gaacaacctc cattttgtgg ggatggtaca agtctgaatt cgaa 534<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关上游引物<400>3agaggatctt cccaattcct gctc 24<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关下游引物<400>4tggggatggt acaagtctga attcgaa 27<210>5<211>352<212>PRT<213>红树属(Rhizophora L.)<400>5Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Tyr Gly Glu Ser Ile Val Ala Ile1 5 10 15Gln Ile Glu Aln Glu Glu Asp Tyr Asn Gln Phe Lys Glu Arg Ile Asp20 25 30Asp Asp Asp Ala Asp Ile Trp Gln Ser Ile Met Val Gln Asn Glu Ile35 40 45His Trp Thr His Tyr His Trp Gly Gln Leu Tyr Thr Asn Leu Gln Gly50 55 60Asn Asn His Ala Asp Ile Gly Gly Trp Ser Thr Glu Arg Glu Glu Ile65 70 75 80Met Val Gln Leu Asn Pro Phe Lys His Asp Trp Leu Pro Arg Val Thr85 90 95Pro Lys Glu Arg Glu Ile Asp Leu Glu Glu Ser Phe Leu Pro Val Ala100 105 110Met His Lys Trp Ile Gln Ile His Tyr Pro Ile Gln His Trp Glu Trp115 120 125Lys Thr Tyr Gly Asn Trp Met Ser Thr Pro Leu Gln Phe Met Glu Gln130 135 140Leu Lys Asn Ile Thr Ile Trp Cys Asn Gln Met Val Phe Gln Asn Gln145 150 155 160Vol Asn Ser Asn Tyr Ile Asn Trp Ile Gly His Phe Met Asp Phe Asn165 170 175Gln Arg His Gly Pro Gly Thr Ser Gly Leu Ile Lys Leu Tyr Glu Trp180 185 190Met Val Ile Asn Ser Gln Met Ser Leu Ala Trp Ile Phr Thr Leu Asn195 200 205Glu Asn Val Tyr Phe Ser Trp Cys Tyr Met Trp Met Ser Ser Tyr Cys210 215 220Leu Glu Met Met Trp Gly Val Phe Ser Phe Ala Lys Asn Trp Leu Ala225 230 235 240Gln Arg Phe Asp Met Arg Trp Trp Glu Lys Arg Trp Met Phe Trp Glu245 250 255His Asn Trp Cys Glu Gln Gly Asn Thr Gly Cys Leu Leu Trp Pro Asn260 265 270Leu His Ser Leu Lys Glu Leu Trp Cys Gly Leu His Cys Thr Trp Pro
275 280 285Arg Lys Asp Asn His Leu Ser Asp Met Glu Gln Tyr Trp His Gly Ser290 295 300Ser His Gln Asn His His Met Asn Trp Ser Thr Cys Asn Gly Phe leu305 310 315 320Ile Ala Leu His Tyr Glu Val Ser Cys Met His Cys Tyr Val His Asp325 330 335Gln Ile Phe Val Met Leu Trp Gly Trp Leu Lys Leu Trp Glu Phe Glu340 345 350<210>6<211>178<212>PRT<213>红树属(Rhizophora L.)<400>6Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Leu Thr Thr Leu Phe Phe Gly Lys1 5 10 15Asp Ala Ser Met Trp Asp Asn Gln Gly Asp Arg Pro Thr Arg Ser Ile20 25 30Tyr Phe Gly Asn Val Ile Trp Ser Thr Gln Leu Asn Glu Arg His Leu35 40 45Asn Glu Asn Val Trp Cys His Trp Val Phe Ile Ser Thr Met Pro Tyr50 55 60His Asn Trp Lys Phe Met Thr His Gln Gln Gln Ser Asn Asp Met Thr65 70 75 80Tyr Pro His Asn Arg Asn Met Trp Ser Thr Tyr Asn Phe Arg His Asn85 90 95Asn Tyr Asn Gln Glu Ser Arg Phe Arg Gln Gln Gln Asn Glu Lys Thr100 105 110Lys Leu Trp Arg Asn Glu Val Val Tyr Tyr Tyr Asn Leu Arg Cys Gln115 120 125Phe Thr His Met His Tyr Leu Asn Phe Leu Val Ala Trp Cys Tyr Pro130 135 140Leu Gln Arg Phe Phe Asp Val Trp Arg Asn Tyr Phe His Tyr Gly Glu145 150 155 160Ile Tyr Met Arg Ser Ser Ile Leu Trp Gly Gly Trp Tyr Asn Trp Glu165 170 175Phe Glu
权利要求
1.红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No1所示的DNA碱基序列。
2.红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No2所示的DNA碱基序列或与其同源的DNA碱基序列。
3.红树甜菜碱醛脱氢酶，其特征在于其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No1所示的碱基序列编码的352个氨基酸。
4.红树甜菜碱醛脱氢酶，其特征在于其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No2所示的碱基序列编码的178个氨基酸。
5.一种适于植物细胞中表达的PBI 121载体，其特征在于它包含序列表中SeQID No1或SeQ ID No2序列。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于CaMV，35S启动子序列具有SeQID No1或SeQ ID No2的核苷酸序列。
7.一对与红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物的序列上游5′AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC 3′下游3′TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA 5′。
8.一种提高植物耐盐性的方法，该方法包括1)构建植物表达载体PBI 121，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ ID No2序列；2)将构建的植物表达载体PBI 121导入植物细胞；获得抗盐能力提高的转基因后代，包括植物各部分组织。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的植物是烟草。
全文摘要
本发明公开了红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No1和SeQ ID No2所示的DNA碱基序列。红树甜菜碱醛脱氢酶，其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No1所示的碱基序列编码的352个氨基酸序列或SeQ ID No2所示的碱基序列编码的178个氨基酸序列。一种适于植物细胞中表达的PBI 121载体，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ ID No2序列。一种提高植物耐盐性的方法，该方法包括1)构建植物表达载体PBI 121，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ ID No2序列；2)将构建的植物表达载体PBI 121导入植物细胞；获得抗盐能力提高的转基因后代，包括植物各部分组织。
文档编号C12N15/63GK1483735SQ0315338
公开日2004年3月24日 申请日期2003年8月12日 优先权日2003年8月12日
发明者刘凤华 申请人:刘凤华