专利名称：用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种医疗设备，特别是一种主要作为体外生物人工肝支持系统的核心装置，也可作为一种实验装置或生物制剂装置，兼用于培养肝细胞的实验研究和提取细胞产品的小型生产装置。
(二)、技术背景现阶段，市场上尚无体外生物人工肝支持系统的专用生物反应器。目前临床使用较多的反应器为普通中空纤维型反应器，其结构与血液透析器完全相同，只是所用半透膜的材料、孔径及分子截留量不同。系将一束(500～1000根左右)中空纤维，密封于透明有机材料外壳内，由中空纤维将其分为内、外两腔，分别用于放置肝细胞和流动患者血液，借助该中空纤维半透膜，进行双向物质传输和生物作用，从而实现生物人工肝支持与治疗。
这种模式的反应器在应用中存在诸多缺陷。首先在结构上，传统普通反应器的中空纤维平行密集排列，呈束状柱形，难以放大，容量和有效交换面积小，作用效率有限；其次在细胞培养方面，不易进行高活性培养，当加入细胞后往往沉积于反应器底部，无法均匀分布于中空纤维之间，既使细胞可以到达纤维束中间也会因氧供不足而失活；再则，在临床肝支持中，该传统反应器因细胞量少(一般仅有1％～5％的成人肝细胞量)、活力低、功能差而难以发挥应有的生物学功能和作用。此外，肝细胞无辅助保护与维持活性的措施。上述缺陷是目前生物人工肝治疗肝衰竭疗效难以进一步提高的重要因素之一。
(三)、发明内容本实用新型的目的就是提供一种结构简单和使用方便的用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置，它可以克服传统中空纤维生物反应器存在的缺陷，为肝细胞提供更符合生理环境的生长与培养条件，有利于获得具有高活性、高密度培养肝细胞，最大限度地发挥生物学作用，实现肝特异性解毒功能、生物合成与转换代谢功能，保障以此为核心的生物人工肝的肝支持与治疗作用。
本实用新型的目的是通过这样的技术方案实现的，它是与培养液容器内的培养液连通的培养液输出管经培养液输出泵、氧气弥散管与反应器输入端连通，反应器输出端通过培养液输入管与培养液容器连通，以形成一个闭合的循环通路。
将本实用新型放置在普通孵箱内，予以95％的O2、5％的CO2和100％湿度条件，其工作原理描述如下首先，采用体外消化技术获得肝细胞，进行肝细胞球形体培养。球形体的原理是借助肝细胞的粘附特性，采用特殊培养技术，使其不能沉积于培养容器的底部贴壁生长，而是相互粘附、聚集、像滚雪球一样形成浮悬于培养液的多细胞球形体。特殊培养技术包括被覆细胞贴壁阻止剂、定时振荡旋转、激素限定强化条件培养液等。多细胞球形体培养2～3天后，移入反应器的外腔中，即反应器内的中空纤维之间，每个球形体中的数量多在100～200以上，使其在中空纤维的不同层面附着生长，这与正常肝内细胞立体排列相似，符合生理条件。
然后，启动培养液输出泵，在培养液输出泵的作用下，将培养液容器内的培养液经培养液输出管、氧气弥散管从反应器的输入端送至反应器的中空纤维内，又经反应器输出端通过培养液输入管送回培养液容器中，以形成培养液的循环流动。在培养液反复循环流动的过程中，反应器内的培养液通过中空纤维上的微孔形成的半透膜不断向反应器外腔弥散氧气、营养物质，为反应器外腔中的肝细胞提供丰富氧气及营养物质，同时肝细胞代谢产物由外腔经中空纤维的半透膜弥散至中空纤维内，由循环流动的培养液带出。培养液每24小时更换一次。这一过程十分符合正常肝脏的肝细胞生理环境和血液循环，因此，可以制备出含大量、高活性、高密度的肝细胞的生物反应器，肝细胞具备优良的生物功能。
上述制备过程3～6天即可完成。由于采用了循环氧合培养液培养模式，随时间延长肝细胞还会进一步增殖生长，细胞数量进一步增多，生物反应器的功能更佳，尤其在以肝细胞株为材料时，效果更优。本实用新型具有如下的三大用途1、用于体外生物人工肝，能发挥更好的人工肝支持与治疗作用。
2、用于实验研究时，可满足肝细胞的生理要求。
3、用于制备生物制剂时，可提取更多的细胞产物。
由于采用了上述技术方案，本实用新型具有如下的优点1.结构合理，符合肝细胞的生理环境，操作简便、制备周期短、条件和其他设备要求不高。
2.在本实用新型中，中空纤维数量多、面积大，肝细胞附着广。外腔体积大，肝细胞量可达300g，相当于20％的成人肝细胞量，而且可根据临床使用情况进一步放大。因此，能够满足生物反应器研制中易于放大的要求，也满足了生物人工肝以及肝细胞实验研究与提取细胞产物的要求。
3.采用综合限制贴壁技术，较传统单一被覆贴壁抑制更有效，肝细胞球形体形成快，细胞数量多，活性好。
4.将已形成多细胞聚集球形体的肝细胞移入反应器外腔，较单个肝细胞更容易在不同中空纤维支架层中附壁生长，呈三维立体形，细胞分布均匀，密度高，细胞数量大。
5.采用氧合培养液循环方式培养反应器内的肝细胞，克服了传统反应器直接放置于CO2培养箱内培养效果不佳的缺陷。该培养方式充分考虑为肝细胞提供合适的微循环、氧合作用及不断循环更新的培养液，也完全符合肝细胞的生理环境和条件，培养肝细胞活力好、功能强。
6.本实用新型的横向腔体或纵向腔体中任何一个均可以作为血液循环通道，将其直接与患者血液循环通道相连即可实施生物人工肝治疗，故生物反应器不仅制备方便，而且使用快捷。
本实用新型的
如下图1为本实用新型的结构示意图；图2为反应器的结构示意图；图3为图2中A-A的剖视图。
图中1.培养液容器；2.培养液输出管；3.培养液输出泵；4.氧气弥散管；5.反应器；6.培养液输入管；7.立方形壳体；8.外腔；9.横向中空纤维；10.横向缓冲腔；11.纵向中空纤维；12.纵向缓冲腔；13.进液口；14.出液口；15.肝细胞加入口；16.排气取样口；17.滤网隔膜层；18.监控器。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本实用新型作进一步说明如图1所示，本实用新型是与培养液容器1内的培养液连通的培养液输出管2经培养液输出泵3、氧气弥散管4与反应器5输入端连通，反应器5输出端通过培养液输入管6与培养液容器1连通，以形成一个闭合的循环通路。
将本实用新型放置在普通孵箱内，予以95％的O2、5％的CO2和100％湿度条件，其工作原理描述如下首先，采用体外消化技术获得肝细胞，进行肝细胞球形体培养。球形体的原理是借助肝细胞的粘附特性，采用特殊培养技术，使其不能沉积于培养容器的底部贴壁生长，而是相互粘附、聚集、像滚雪球一样形成浮悬于培养液的多细胞球形体。特殊培养技术包括被覆细胞贴壁阻止剂、定时振荡旋转、激素限定强化条件培养液等。多细胞球形体培养2～3天后，移入反应器5的外腔中，即反应器5内的中空纤维之间，每个球形体中的数量多在100～200以上，使其在中空纤维的不同层面附着生长，这与正常肝内细胞立体排列相似，符合生理条件。
然后，启动培养液输出泵3，在培养液输出泵3的作用下，将培养液容器1内的培养液经培养液输出管2、氧气弥散管4从反应器5的输入端送至反应器5的中空纤维内，又经反应器5输出端通过培养液输入管6送回培养液容器中，以形成培养液的循环流动。在培养液反复循环流动的过程中，反应器5内的培养液通过中空纤维上的微孔形成的半透膜不断向反应器5外腔弥散氧气、营养物质，为反应器5外腔中的肝细胞提供丰富氧气及营养物质，同时肝细胞代谢产物由外腔经中空纤维的半透膜弥散至中空纤维内，由循环流动的培养液带出。培养液每24小时更换一次。这一过程十分符合正常肝脏的肝细胞生理环境和血液循环，因此，可以制备出含大量、高活性、高密度的肝细胞的生物反应器，肝细胞具备优良的生物功能。
如图2、3所示，所述的反应器5可以是由设置在立方形壳体7内的横向腔体、纵向腔体和外腔8构成，其中横向腔体是一个通过多根横向中空纤维9与设置在立方形壳体7左右相对两侧的横向缓冲腔10彼此连通的腔体，纵向腔体是一个通过多根纵向中空纤维11与设置在立方形壳体7前后相对两侧的纵向缓冲腔12彼此连通的腔体，外腔8是由立方形壳体7、横向缓冲腔10侧壁、纵向缓冲腔12侧壁所围成的且包含有横向中空纤维9、纵向中空纤维11的腔体，横向腔体、纵向腔体与外腔8之间通过横向中空纤维9、纵向中空纤维11上的微孔彼此相通，横向腔体和纵向腔体上均设置有进液口13和出液口14，立方形壳体7上设置有与外腔8相通的肝细胞加入口15和排气取样口16。
如图2、3所示，所述的横向中空纤维9与纵向中空纤维11之间的排列可以是彼此相间的，即第一层为纵向中空纤维11，第二层为横向中空纤维9，第三层又为纵向中空纤维11，第四层～最后层依此设置。
按照上述结构制成的生物反应器，横纵交叉排列的中空纤维使其彼此之间分布均匀且有间隙，提供了一个立体支架，使肝细胞均匀分布于中空纤维的各个层上。
如图2、3所示，为了进一步防止肝细胞沉积于外腔8的底部，在外腔8内设置有多个滤网隔膜层17，每个滤网隔膜层17上方均有一层纵向中空纤维11和一层横向中空纤维9。滤网隔膜层17为多细胞球形体提供一个各层面的支承架，形成三维立体结构培养，加上肝细胞在体外已预先被培养成多细胞球形体，细胞之间相互聚集，体积大，每个球形体中的数量多在100～200以上，故可以保证肝细胞在中空纤维的各个层面高密度附着生长，这与正常肝内细胞立体排列相似，符合生理条件。
将本实用新型用于体外人工肝时，是将反应器5中的其中一个横向腔体或纵向腔体内循环流动培养液，另一个纵向腔体或横向腔体内以其它的循环形式循环流动患者的带有毒性物质的血浆。外腔内培养的正常肝细胞自行通过中空纤维的微孔对患者的血浆进行解毒，并补充活性物质，培养液为外腔内的肝细胞提供丰富的氧气和营养物质，同时带出外腔中肝细胞代谢解毒的产物，从而发挥更好的人工肝支持与治疗作用。
将本实用新型用于实验研究或制备生物制剂时，只需将所有横向腔体和纵向腔体均循环流动培养液，就可以充分满足肝细胞的生理要求或提取更多的细胞产物。
如图1所示，为了便于随时控制本实用新型的工作情况，在由培养液容器1、培养液输出泵3、氧气弥散管4和反应器5形成的循环通路上设置有监控器18。
权利要求1.一种用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置，其特征在于与培养液容器(1)内的培养液连通的培养液输出管(2)经培养液输出泵(3)、氧气弥散管(4)与反应器(5)输入端连通，反应器(5)输出端通过培养液输入管(6)与培养液容器(1)连通，以形成一个闭合的循环通路。
2.如权利要求1所述的用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置，其特征在于反应器(5)是由设置在立方形壳体(7)内的横向腔体、纵向腔体和外腔(8)构成，其中横向腔体是一个通过多根横向中空纤维(9)与设置在立方形壳体(7)左右相对两侧的横向缓冲腔(10)彼此连通的腔体，纵向腔体是一个通过多根纵向中空纤维(11)与设置在立方形壳体(7)前后相对两侧的纵向缓冲腔(12)彼此连通的腔体，外腔(8)是由立方形壳体(7)、横向缓冲腔(10)侧壁、纵向缓冲腔(12)侧壁所围成的且包含有横向中空纤维(9)、纵向中空纤维(11)的腔体，横向腔体、纵向腔体与外腔(8)之间通过横向中空纤维(9)、纵向中空纤维(11)上的微孔彼此相通，横向腔体和纵向腔体上均设置有进液口(13)和出液口(14)，立方形壳体(7)上设置有与外腔(8)相通的肝细胞加入口(15)和排气取样口(16)。
3.如权利要求2所述的用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置，其特征在于所述的横向中空纤维(9)与纵向中空纤维(11)之间的排列是彼此相间的，即第一层为纵向中空纤维(11)，第二层为横向中空纤维(9)，第三层又为纵向中空纤维(11)，第四层～最后层依此设置。
4.如权利要求3所述的用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置，其特征在于在外腔(8)内设置有多个滤网隔膜层(17)，每个滤网隔膜层(17)上方均有一层纵向中空纤维(11)和一层横向中空纤维(9)。
5.如权利要求1、2、3或4所述的用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置，其特征在于在由培养液容器(1)、培养液输出泵(3)、氧气弥散管(4)和反应器(5)形成的循环通路上设置有监控器(18)。
专利摘要一种用于生物人工肝、肝细胞培养研究的生物反应装置，其特征在于与培养液容器内的培养液连通的培养液输出管经培养液输出泵、氧气弥散管与反应器输入端连通，反应器输出端通过培养液输入管与培养液容器连通，以形成一个闭合的循环通路。本实用新型具有结构合理、操作简便和制备周期短等优点，它可以克服传统中空纤维生物反应器存在的缺陷，为肝细胞提供更符合生理环境的生长与培养条件，有利于获得具有高活性、高密度培养的肝细胞，最大限度地发挥生物学作用，实现肝特异性解毒功能、生物合成与转换代谢功能，保障以此为核心的生物人工肝的肝支持与治疗作用。
文档编号C12M3/00GK2649598SQ0323509
公开日2004年10月20日 申请日期2003年6月24日 优先权日2003年6月24日
发明者王英杰 申请人:中国人民解放军第三军医大学