专利名称：新型脱氢酶和编码该脱氢酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型脱氢酶、编码该新型脱氢酶的DNA和利用其制备N-烷基氨基酸的方法。已知N-烷基氨基酸中，特别是N-甲基氨基酸以称为ジデムニン(Didemnin)或ドラスタチン(dolastatin)的天然生理活性物质的结构的一部分存在(J.Am.Chem.Soc.1981，103号，p1857-1859；Tetrahedron 1993，49号p9151-9170)，是近年作为医药或农药中间原料备受关注的有用物质。
背景技术：
已知的制备N-取代氨基酸类的方法，包括所谓通过叠氮基进行还原性烷基化的方法(J.Org.Chem.1995，60号，p4986-4987)，通过从噁唑烷衍生物进行还原性开环反应的方法(Tetrahedron Letter 39(1998)1985-1986)等化学反应。
另外，作为利用微生物的方法，虽然已知用脱氢酶或氨基转移酶从2-氧代羧酸衍生物制备氨基酸类的方法，但这些主要只进行单独的氨基化。作为使用取代氨基的方法，仅仅已知用假单胞菌属(Pseudomonas)微生物从丙酮酸制备N-甲基丙氨酸的方法(J.Biol.Chem.，250号，p3746-3751(1975))，和利用红球菌属、节杆菌属微生物的甲基氨基化方法(特开2001-190298号公报)等单纯甲基氨基化。
作为参与上述反应的酶，J.Biol.Chem.，250号，p3746-3751(1975)中报告了假单胞菌MS ATCC25262产生的N-甲基丙氨酸脱氢酶的纯化。
发明内容
然而，如上所述，公知的氨基酸脱氢酶和N-甲基氨基酸脱氢酶的底物特异性受到限定，例如对胺类或含有二羰基的化合物而言，而且它可以适用的应用范围窄。并且，用上述的公知酶进行N-甲基氨基化时，不仅制备了N-甲基-氨基酸，还同时制备了没有氨基取代基的普通氨基酸，因此不能说是工业上有利的方法。因此，期待获得新型脱氢酶。即，本发明的课题是解决提供与公知脱氢酶具有不同性质的新型脱氢酶的问题。
本发明人为了解决上述课题进行悉心研究，结果成功地从恶臭假单胞菌ATCC12633株分离了新型脱氢酶，从而完成了本发明。
即，本发明提供具有以下理化性质的脱氢酶(1)作用以NADPH和/或NADH为辅酶，从丙酮酸和烷基胺或二烷基胺生成N-烷基-L-丙氨酸；(2)底物特异性对烷基胺或二烷基胺显示活性，但对氨不显示活性；(3)以苯丙酮酸与甲胺为底物时的最适pH为10左右；和，(4)在30℃处理30分钟后，酶在pH5～10.5左右稳定。
本发明的另一方面提供下述任一项的多肽(1)包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽；(2)包含在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一个至多个氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有脱氢酶活性的多肽；或(3)包含与序列号1所示的氨基酸序列具有50％或50％以上同源性的氨基酸序列，并且具有脱氢酶活性的多肽；本发明另一方面提供编码上述本发明多肽的DNA。
本发明的另一方面提供下述任一项的DNA(1)包含序列号2所示的碱基序列的DNA；(2)包含在序列号2所示的碱基序列中缺失、取代和/或添加一个至多个碱基所得的碱基序列，并且编码具有脱氢酶活性的多肽的DNA；或(3)与包含序列号2所示的碱基序列的DNA在严紧条件下杂交，并且编码具有脱氢酶活性的多肽的DNA；本发明另一方面提供含有上述本发明的DNA的重组载体。
本发明另一方面提供含有上述本发明的DNA或重组载体的转化体。
本发明另一方面提供N-烷基-氨基酸衍生物的制备方法，该方法包括使下述通式(I)
(式中，R1表示氢原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的含有二羰基的化合物和R3(R4)NH(式中，R3和R4分别独立地表示氢原子或可以被取代的烷基，但R3和R4不同时为氢原子)所示的烷基取代胺类在本发明脱氢酶、多肽或转化体的存在下反应。
优选R1为氢原子。
优选R3为可以被氨基取代的C1～C6直链、支链或环状烷基，R4为氢原子。
优选式(I)所示化合物为丙酮酸、苯丙酮酸、β-氟代丙酮酸、2-氧代丁酸、2-酮基己酸或2-酮基正戊酸。
本发明另一方面提供N-烷基-氨基酸衍生物的制备方法，该方法包括使下述通式(II) (式中，R1表示氢原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的氨基羧酸类与可以将通式(II)所示的氨基羧酸类转化成通式(I) (式中，R1和R2与通式(II)中的定义相同)所示化合物的酶以及R3(R4)NH(式中，R3和R4分别独立地表示氢原子或可以被取代的烷基，但R3和R4不同时为氢原子)所示的烷基取代胺类，在本发明脱氢酶、多肽或转化体的存在下反应。
优选R3为可以被氨基取代的C1～C6直链、支链或环状烷基，R4为氢原子。
优选通式(II)所示的氨基羧酸类为苯丙氨酸或蛋氨酸。
优选可以将式(II)所示的氨基羧酸类转变成式(I)所示的烷基取代胺类的酶为D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸脱氢酶、氨基酸转移酶。
附图简述
图1是表示本发明N-甲基-L-苯丙氨酸脱氢酶最适pH的曲线图。
图2是表示本发明N-甲基-L-苯丙氨酸脱氢酶最适温度的曲线图。
图3是表示本发明N-甲基-L-苯丙氨酸脱氢酶pH稳定性的曲线图。
图4是表示本发明N-甲基-L-苯丙氨酸脱氢酶热稳定性的曲线图。
图5是表示对本发明N-甲基-L-苯丙氨酸脱氢酶的pH影响的曲线图。
图6表示与D-氨基酸氧化酶共反应的产物的HPLC分析结果。
图7表示对图6的峰-1和峰-2进行质谱分析的结果。
发明的最佳实施形态以下详细说明本发明的实施形态。
(I)本发明的脱氢酶和多肽本发明的脱氢酶具有下述理化性质(1)作用以NADPH和/或NADH为辅酶，从丙酮酸和烷基胺或二烷基胺生成N-烷基-L-丙氨酸；(2)底物特异性对烷基胺或二烷基胺显示活性，但对氨不显示活性；(3)以苯丙酮酸与甲胺为底物时的最适pH为10左右；和，(4)在30℃处理30分钟后，酶在pH5～10.5左右稳定。
本发明的脱氢酶可以通过在例如苯丙酮酸等含有二羰基的化合物以及NADPH和/或NADH的存在下，用氨、烷基胺和二烷基胺进行筛选而获得。
筛选时可以使用来自具有脱氢酶活性的微生物的培养物的增殖菌体、该菌体破碎物或通过常规操作从它们分离得到的粗制酶或纯化酶。
另外，酶在pH5～10.5左右稳定，并且最适pH为10左右的特性是本发明脱氢酶的特性。
上述脱氢酶可以从例如属于恶臭假单胞菌的微生物，特别优选从恶臭假单胞菌ATCC12633株分离。
上述脱氢酶的具体例子可以列举序列号1记载的氨基酸序列所示的多肽及其同系物且具有脱氢酶活性的酶。
作为序列号1记载的氨基酸序列所示的脱氢酶的性质，除上述(1)～(4)所示的性质外，还表现以下特性(5)用Superose 12HR10/30(ァマシャムバィォサィェンス公司制)通过凝胶过滤法分析测定的分子量为约80～93千道尔顿，SDS-聚丙烯酰胺电泳中，显示推定为至少约36千道尔顿的多肽的带。
(6)通过以苯丙酮酸和甲胺为底物时的活性测定得到的最适温度为35℃左右。
(7)在最适pH(以苯丙酮酸和甲胺为底物时为pH10)处理30分钟后，在低于约30℃的温度显示热稳定性。
(8)不仅对丙酮酸，还至少对2-酮基己酸、苯丙酮酸、2-氧代丁酸、β-氟代丙酮酸、2-酮基正戊酸也显示活性。
(9)被0.01mM氯化汞(HgCl2)和0.01mM氯化铜(CuCl2)之类的二价重金属抑制活性。
本发明脱氢酶的同系物可以列举含有在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一个至多个(优选1～20个，更优选1～15个，进一步优选1～10个，进一步优选1～7个，特别优选1～5个左右)氨基酸所得的氨基酸序列，并具有脱氢酶活性的多肽；或与序列号1所示的氨基酸序列具有50％或50％以上，优选60％或60％以上，更优选70％或70％以上，更优选80％或80％以上，进一步优选90％或90％以上，进一步优选95％或95％以上，特别优选97％或97％以上的同源性，并且具有脱氢酶活性的多肽。
另外，上述多肽的同源性检索可以在例如日本DNA数据库(DDBJ)中，使用FASTA程序或BLAST程序等进行。
脱氢酶活性一般是催化脱氢反应的活性的总称，在本发明中，是指通过参与氧化还原反应的辅酶如NADH或NADPH等和烷基胺类使羰基化合物烷基氨基化的活性。
获得本发明脱氢酶的方法除了如上所述从具有脱氢酶活性的微生物的培养物进行分离·纯化的方法外，如后所述，可以用以编码本发明氨基酸序列的一部分或全部的碱基序列为基础制备的探针，从具有脱氢酶活性的任意微生物分离编码该还原酶的DNA，然后进行基因工程方法获得。
或者，本发明的脱氢酶也可以通过Fmoc法(芴基甲基氧基(ォキシ)羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成方法制备。另外，也可以利用桑和贸易(美国Advanced Chem Tech公司制)、パ一キンェルマ一ジャバン(美国Perkin Elmer公司制)、ァマシャムファルマシァバィォテク(AmershamPharmacia Biotech公司制)、ァロカ(美国Protein Technology Instrument公司制)、クラボゥ(美国Synthecell-Vega公司制)、日本パ一セプティブ·リミテッド(美国PerSeptive公司制)、岛津制作所等的肽合成仪进行化学合成。
(II)本发明的DNA本发明提供编码上述脱氢酶的DNA或其同系物。
编码上述脱氢酶的DNA可以列举例如包含序列号2所示的碱基序列的DNA。
编码本发明脱氢酶的DNA的同系物可以列举具有在序列号2所示的碱基序列中缺失、取代和/或添加一个至多个(优选1～60个，更优选1～30个，进一步优选1～20个，进一步优选1～10个，特别优选1～5个左右)碱基所得的碱基序列，并编码具有脱氢酶活性的多肽的DNA；或与具有序列号2所示的碱基序列的DNA在严紧条件下杂交，并编码具有脱氢酶活性的多肽的DNA。
本领域技术人员可以通过用定点诱变法(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)，Methodsin Enzymol.100，pp.448(1983)，Molecular Cloning 2ndEdt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(以下简称为″モレキュラ一クロ一ニング第2版″)，PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991))等，在序列号2记载的DNA中适当导入取代、缺失、插入和/或添加变异，由此获得所需的同系物。
本说明书中“在严紧条件下杂交的DNA”是指用DNA作为探针，通过使用集落杂交法、蚀斑杂交法或Southern印迹杂交法等获得的DNA碱基序列，例如，可以列举能通过下述方法鉴定的DNA等用固定了来自集落或蚀斑的DNA或该DNA的片断的滤膜，在0.7～1.0M的NACl的存在下于65℃进行杂交后，用0.1～2×SSC溶液(1×SSC的组成为150mM氯化钠，15mM枸橼酸钠)在65℃的条件下洗涤滤膜。
杂交可以根据モレキュラ一クロ一ニング第2版等中记载的方法进行。
作为上述DNA的同系物，可以列举与具有序列号2记载的碱基序列的DNA有60％或60％以上，优选70％或70％以上，更优选80％或80％以上，特别优选90％或90％以上同源性的DNA。
编码本发明脱氢酶的DNA可以通过例如下述方法分离。
首先，可以将本发明的脱氢酶纯化，然后分析N末端氨基酸序列，然后用PCR克隆等常规基因工程学分析方法，从染色体DNA分离编码目的脱氢酶的基因，分析其碱基序列。另外，根据本发明，由于碱基序列已经明确，因此可以以该碱基序列为基础设定引物来克隆目的基因，也可以通过DNA合成仪来合成目的基因。
(III)本发明的重组载体和转化体上述(II)中获得的编码本发明脱氢酶的DNA通过插入到公知的表达载体，可以提供脱氢酶表达载体。另外，通过培养用该表达载体进行转化得到的转化体，可以从该转化体获得脱氢酶。
作为使本发明脱氢酶表达的转化对象的微生物没有特别限制，只要宿主本身对此反应没有不良影响，具体可以列举以下所示的微生物。
埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)属等开发出了宿主载体系统的细菌；红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等开发出了宿主载体系统的放线菌；糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、Yarrowia属、丝孢酵母属(Trichosporon)、红冬孢属(Rhodosporidium)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、毕赤氏酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)属等开发出了宿主载体系统的酵母；链孢霉属(Neurospora)、曲霉属(Aspergillus)、头孢属(Cephalosporium)、木霉属(Trichoderma)等开发出了宿主载体系统的霉菌。
上述微生物中，作为宿主优选埃希氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属，特别优选埃希氏菌属、棒杆菌属。
制备转化体的程序以及适合于宿主的重组载体的构建可以根据分子生物学、生物工程学、基因工程学领域中惯用的技术进行(例如，参照モレキュラ一クロ一ニング第2版等)。
具体地，往微生物中稳定存在的质粒载体或噬菌体载体中导入本发明的DNA，或者，直接往宿主基因组中导入本发明的DNA，必须转录、翻译其遗传信息。
此时，优选将启动子整合到本发明DNA链的5’-侧上游，更优选将终止子整合到3’-侧下游。可以用于本发明的启动子和终止子没有特殊限制，只要是在用作宿主的微生物中功能已知的启动子和终止子。有关上述各种微生物中可以利用的载体、启动子和终止子等，在例如《微生物学基础讲座8基因工学·共立出版》，特に酵母に関しては，Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)，Yeast 8，423-488(1992)等中进行了详细描述。
具体地，例如埃希氏菌属，特别是大肠埃希氏菌中，作为质粒载体，可以列举pBR、pUC系列的质粒，可以列举来自lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体PL、PR等的启动子等。另外，作为终止子，可以列举来自trpA、来自噬菌体、来自rrnB核糖体RNA的终止子等。
芽孢杆菌属中，作为载体，可以列举pUB110质粒、pC194质粒等。另外，还可以整合到染色体中。作为启动子和终止子，可以利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的启动子或终止子等。
假单胞菌属中，作为载体，可以列举开发用于恶臭假单胞菌、葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等的普通宿主载体系统，或以参与甲苯化合物分解的质粒TOL为基础的广宿主域载体pKT240(包括来自RSF1010等的自主复制所必需的基因)。
短杆菌属，特别是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中，作为载体，可以列举pAJ43(Gene 39，281(1985))等质粒载体。作为启动子和终止子，可以使用大肠埃希氏菌中使用的各种启动子和终止子。
棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，作为载体，可以列举pCS11(特开昭57-183799号公报)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984)等质粒载体。
糖酵母属，特别是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为载体，可以列举YRp系列、YEp系列、YCp系列、YIp系列质粒。另外，可以利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等各种酶基因的启动子、终止子。
裂殖糖酵母属中，作为载体，可以列举来自Mol.Cell.Biol.6，80(1986)记载的粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的质粒载体，特别是可以容易地利用宝酒造市售的pAUR224。
曲霉属中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等是真菌中研究最深的曲霉，可以利用向质粒或染色体中的整合，可以利用来自胞外蛋白酶或淀粉酶的启动子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
另外，除上述以外，开发了适应于各种微生物的其它宿主载体系统，可以适当地使用这些。
另外，除微生物以外，开发了植物、动物中的各种宿主·载体系统，特别是开发了在使用蚕的昆虫(Nature 315，592-594(1985))或在油菜籽、玉米、马铃薯等植物中大量表达异种蛋白的体系，以及采用大肠埃希氏菌无细胞提取液或小麦胚芽等的无细胞蛋白质合成体系的系统，可以适当地利用它们。
可以通过公知的方法培养含有本发明DNA的转化体，并从培养物分离和纯化本发明的脱氢酶。
培养含有本发明DNA的转化体的方法可以按照宿主培养所用的常规方法进行。
本发明的转化体为大肠菌等原核生物、酵母菌等真核生物时，培养这些微生物的培养基可以是天然培养基、合成培养基中的任意一种，只要是含有该微生物能利用的碳源、氮源、无机盐类等，能有效进行转化体培养的培养基，培养优选在振荡培养或深部通气搅拌培养等好气条件下进行，培养温度通常为15～40℃，培养时间通常为16小时～7天。培养过程中pH保持在3.0～9.0。pH调整用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨水等进行。另外，根据需要，可以在培养中添加氨苄西林或四环素等抗生素。
作为培养以动物细胞为宿主细胞获得的转化体的培养基，使用常用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association，199，519(1967)]、Eagle MEM培养基[Science，122，501(1952)]、DMEM培养基[Virology，8，396(1959)]、199培养基[Proceeding of the Society for theBiological Medicine，73，1(1950)]或往这些培养基中加入胎牛血清等获得的培养基等。培养通常在pH＝6～8、30～40℃、5％CO2存在下等条件下进行1～7天。另外，根据需要，可在培养中添加卡那霉素，青霉素等抗生素。
从转化体培养物分离并纯化本发明的脱氢酶时，可以使用常规的蛋白质分离、纯化法。
例如，本发明的脱氢酶在细胞内以溶解状态表达时，培养结束后，通过离心分离回收细胞并悬浮于水系缓冲液中，然后用超声破碎机、弗式压碎机(フレンチプレス)、Manton-Gaulin匀浆机(マントンガゥリンホモゲナイザ一)、ダィノミル等使细胞破碎，得到无细胞提取液。将该无细胞提取液离心分离，从所得的上清通过常规的蛋白质分离纯化法，即，溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、利用二乙基氨基乙基(DEAE)Sepharose、DIAION HPA-75(三菱化学社制)等树脂的阴离子交换色谱法、利用S-Sepharose FF(ファルマシァ公司制)等树脂的阳离子交换色谱法、利用丁基Sepharose、苯基Sepharose等树脂的疏水色谱法、利用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦法(クロマトフォ一カシング法)、等电聚焦等电泳法等，这些方法可以单独或组合使用，从而可以得到纯化的样品。
另外，本发明的脱氢酶在细胞内以不溶物形成表达时，同样回收细胞后进行破碎，通过离心分离得到沉淀级分，从该沉淀级分通过常规方法回收所述脱氢酶后，用蛋白质变性剂使该脱氢酶的不溶物溶解。将该可溶性液体稀释到不含蛋白质变性剂或蛋白质变性剂的浓度低到不使脱氢酶变性的程度的稀溶液，或进行透析，使该脱氢酶形成正常的立体结构后，通过与上述相同的分离及纯化法可以获得纯化的样品。
(IV)利用本发明的脱氢酶制备N-烷基-氨基酸衍生物进一步地，本发明涉及N-烷基-氨基酸衍生物的制备方法，该方法包括下述通式(I) 使(式中，R1表示氢原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的含有二羰基的化合物与R3(R4)NH(式中，R3和R4分别独立地表示氢原子或可以被取代的烷基，但R3与R4不同时为氢原子。)所示的烷基取代胺类在上述本发明的脱氢酶或转化体的存在下反应；和，N-烷基-氨基酸衍生物的制备方法，该方法包括使下述通式(II) (式中，R1表示氢原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的氨基羧酸类与可以将通式(II)所示的氨基羧酸类变成通式(I) (式中，R1和R2与通式(II)中的定义相同)所示的化合物的酶，以及R3(R4U)NH(式中，R3和R4分别独立地表示氢原子或可以被取代的烷基，但R3与R4不同时为氢原子。)所示的烷基取代胺类在本发明的脱氢酶、多肽或转化体的存在下反应。
上述通式(I)中R1的烷基是可以被卤原子、芳基等对反应惰性的基团取代的直链、支链或环状烷基，具体例子可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、三氟甲基、苄基等。其中，优选碳原子数为1～10的烷基，更优选碳原子数为1～4烷基。
上述R1优选氢原子或直链烷基，特别优选氢原子。
上述R2的烷基是可以被卤原子、羟基、芳基等对反应惰性的基团取代的直链、支链或环状烷基，具体例子可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟代甲基、三氟甲基、羟甲基和苄基等。
上述R2的芳基是可以被卤原子、羟基、烷基、芳基等对反应惰性的基团取代的芳基，具体例子可以列举苯基、甲苯基、氟代苯基和羟苯基等。
上述可取代的烷基和芳基优选碳原子数为1～10的基团。
上述R2优选烷基、卤代烷基、芳烷基，其中，特别优选直链状的基团。
通式(I)所示化合物的优选具体例子可以列举丙酮酸、羟基丙酮酸，苯丙酮酸、β-氟代丙酮酸、2-酮基己酸、2-酮基异己酸、2-氧代丁酸、2-酮基辛酸或2-酮基正戊酸，特别优选丙酮酸、苯丙酮酸，β-氟代丙酮酸、2-氧代丁酸、2-酮基己酸或2-酮基正戊酸。
通式(II)所示化合物的优选具体例子为苯丙氨酸、蛋氨酸。
本反应所用的胺类为R3(R4)NH所示的胺类。
此处，上述R3和R4分别独立地为氢原子或可以被取代的烷基，这里可以被取代的烷基是可以被卤原子、羟基、氨基、芳基等对反应惰性的基团取代的直链、支链或环状烷基。
上述可以被取代的烷基的具体例子可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟代甲基、三氟甲基、羟甲基、氨基甲基、苄基等，其中优选直链状的烷基或氨基烷基。
另外，上述可以被取代的烷基优选碳原子数为1～6的烷基，更优选碳原子数为1～4的烷基。
上述胺类的优选具体例子可以列举甲胺、乙胺、正丙胺、异丙胺、二氨基甲烷、二甲胺和环己胺等，更优选伯胺类，特别优选甲胺。
本反应中，作为反应底物的含二羰基的化合物通常以底物浓度为0.01～90％w/v，优选0.1～30％w/v的范围使用。这些可以在反应开始时一并添加，但从减少酶的任何底物抑制效应或提高产物的蓄积浓度的方面考虑，优选连续或间歇性地添加。
本反应中，作为反应底物的氨基羧酸类通常在底物浓度为0.01～90％w/v，优选0.1～30％w/v的范围使用。
另外，胺类的用量为含二羰基的化合物和氨基羧酸类的等摩尔量或等摩尔量以上，优选1.5摩尔倍或1.5摩尔倍以上。只要是上述范围，通常可以在考虑系统内的pH和成本等因素后任意使用，但通常为50摩尔倍或50摩尔倍以下，优选20摩尔倍或20摩尔倍以下。
本反应中，使上述转化体作用于含有二羰基的化合物和氨基羧酸类时，可以直接使用该转化体、或将该转化体用丙酮、DMSO、甲苯等有机溶剂或表面活性剂处理后再用、或使用经冻干处理的物质、进行物理性破碎或酶破碎所得到的物质等菌体处理物，将该转化体中的本发明的酶级分以粗制物或纯化物的形式取出所得的物质，以及将这些固定到诸如聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜胶凝胶(カラギ一ナンゲル)等载体上所得的物质。
另外，本反应中，优选添加辅酶NAD+或NADP+(以下简称为NAD(P))或NADH或NADPH(以下简称为NAD(P)H)，并且通常添加0.001mM～100mM，优选0.01～10mM。
添加上述辅酶时，使由NAD(P)H生成的NAD(P)+再生成NAD(P)H对于提高生产效率是优选的，作为再生方法，可以列举1)利用宿主微生物自身的NAD(P)+还原能力的方法，2)往反应体系中添加微生物或酶的方法，所述微生物是具有由NAD(P)+生成NAD(P)H的能力的微生物或其处理物，所述酶如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等可用于NAD(P)H的再生的酶(再生酶)，3)制备转化体时，将作为可以用于NAD(P)H再生的上述再生酶类的基因与本发明DNA同时导入宿主的方法。
其中，上述1)的方法中，优选往反应体系中添加葡萄糖或乙醇、甲酸等。
另外，上述2)的方法中，可以使用包含上述再生酶类的微生物、将该微生物菌体进行丙酮处理所得的物质、冷冻干燥处理所得的物质、物理性破碎或酶性破碎所得的物质等、将该酶级分以粗制物或纯化物形式取出的物质，以及将这些物质固定到诸如聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜胶凝胶等载体上所得的物质等，也可以使用市售的酶。
此时，上述再生酶的用量具体例如是本发明脱氢酶的酶活性的0.01～100倍，优选0.5～20倍左右。
另外还需要添加化合物作为上述再生酶的底物，例如，利用葡萄糖脱氢酶时的底物葡萄糖、利用甲酸脱氢酶时的底物甲酸、利用醇脱氢酶时的底物乙醇或异丙醇等，其添加量是作为反应原料的含二羰基化合物的0.1～20摩尔倍量，优选添加1～5摩尔倍量。
上述3)的方法中，可以使用将本发明的DNA与上述再生酶类的DNA整合到染色体中的方法，往单一载体中导入两种DNA并用其转化宿主的方法，和将两种DNA分别导入其不同载体然后转化宿主的方法，但使用将两种DNA分别导入不同载体然后转化宿主的方法时，必须在考虑两种载体彼此不相容性的基础上选择载体。
往单一载体中导入多个基因时，可以使用将启动子和终止子等参与表达控制的区域连结到各自的基因的方法，也可以以包含多个顺反子的操纵子如乳糖操纵子的形式表达。
本反应在包含反应底物和本发明转化体以及根据需要添加的各种辅酶及其再生系统的水性介质中或该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。
上述水性介质可以列举水或缓冲液，另外，有机溶剂可以使用乙醇、丙醇、四氢呋喃、二甲亚砜等水溶性有机溶剂或乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等非水溶性有机溶剂等反应底物溶解度高的适当溶剂。
本反应通常在4～50℃，优选10～40℃的反应温度，pH通常为6～11、优选pH为7～11的条件下进行。
另外，也可以利用膜反应器等进行。
并且，本反应中，用通式(I)所示化合物中的羧酸酯类作为反应原料时，可以使市售的水解酶在系统内共存，在系统内继续转变成R1为氢原子的羧酸类，并进行N-烷基氨基化。
另外，本反应中，使用上述通式(I)对应的氨基羧酸类，即通式(II)所示化合物(R2CH(NH2)COOR1)作为反应原料，通过使可以作用于通式(II)所示化合物并使其转变成通式(I)所示化合物的酶共存，由此也可以在系统中生成上述通式(I)所示的化合物，并继续通过本脱氢酶进行N-烷基氨基化。
只要是可以作用于通式(II)所示的化合物并使其转变成通式(I)所示的化合物的酶，则没有特别限制，具体可以列举氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶或氨基酸转移酶。优选底物特异性广的酶。具体可以列举Enzyme and MicrobialTechnology vol.31(2002)p77-87中记载的L-氨基酸氧化酶、シグマ公司的D-氨基酸氧化酶等。所用的氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶或氨基酸转移酶优选仅与氨基酸反应并且对应于本反应所用的辅酶，以便代替辅酶再生系统。即，本反应的N-烷基氨基化中，用NAD(P)H作为辅酶时，NAD(P)H通过本反应的N-烷基氨基化变成NADP+，而由氨基羧酸类制备上述通式(I)所示的化合物时，该NADP+被利用并被转变成NAD(P)H。另外，当能作用于通式(II)所示的化合物并使其转变成通式(I)所示化合物的酶仅对羧基上没有取代基的氨基酸起作用时，也可以允许另一种将该氨基羧酸水解成氨基酸的酶共存，在生成该氨基酸后进行反应。
本反应生成的N-烷基-氨基酸衍生物可以在反应结束后通过将反应液中的细胞或蛋白质离心分离和膜处理等进行分离，再用乙酸乙酯、甲苯等有机溶剂进行提取、蒸馏、柱层析法和结晶等操作，或将这些适当组合进行。
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本分明不受这些实施例的限制。
实施例本实施例的酶活性通过下述方法测定。
往作为测定对象的粗制酶液中加入苯丙酮酸钠(最终浓度15mM)、甲胺-硫酸缓冲液(pH＝10)(最终浓度400mM)和NADPH(最终浓度10mM)，使其总量为50μL。在37℃反应1小时。反应结束后，加入5μL的10％三氯乙酸溶液，以13000rpM离心5分钟。将离心上清10μL用40μL高效液相色谱(以下简称为HPLC)洗脱液稀释，用0.45μm的过滤器过滤后通过高效液相色谱(以下简称为HPLC)进行分析。
HPLC条件如下柱Ultron ESPh-CD(信和化工株式会社)温度40℃洗脱液20％乙腈，80％20mM KH2PO4、H3PO40.4ml/L(pH＝3)流速0.85ml/min检测器UV检测器(210nm)用Sigma公司的试剂作为标准样品。
将酶的活性单位1个单位规定为每分钟能生成1μ摩尔N-甲基苯丙氨酸的酶量。
实施例1酶的纯化(1-1)往无菌液体培养基100ml(包含甲胺盐酸盐5g/L、葡萄糖1g/L、酵母提取物5g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁七水合物0.1g/L)×2瓶(500ml坡口烧瓶(Sakaguchi flask))中接种恶臭假单胞菌ATCC12633株，在28℃好气性振荡培养18小时(更前培养)。然后，在相同组成的无菌液体培养基500ml×4瓶(2L坡口烧瓶)中接种更前培养所得的培养液，各2L坡口烧瓶每瓶接种50ml。在28℃、好气条件下振荡培养8小时(前培养)。将添加了1％聚胨(ナカラィテスク公司制)、0.5％酵母提取物(ナカラィテスク公司制)、1％氯化钠(ナカラィテスク公司制)的培养基(以下简称为LB培养基)200L进行灭菌，然后将前培养所得的培养液2200ml全部接种，在28℃下好气性培养16小时(主培养)。培养后将所得的培养液离心分离，得到2.5kg湿菌体。将该菌体悬浮于5L的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH＝7.0)中，通过超声破碎得到5.9L粗制酶液。
对粗制酶进行硫酸铵分级分离，结果表明硫酸铵浓度为20～60％的级分有活性。收集该级分，并用15L的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH＝7.0)透析5次。酶液的量为3100ml。
(1-2)用SuperQ-TOYOPEARL(TOSOH公司制)进行纯化往用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH＝7.0)平衡过的SuperQ-TOYOPEARL(TOSOH公司制)700mL中，加入硫酸铵20～60％饱和的级分3100mL。然后用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH＝7.0)4900mL进行洗涤。洗涤级分中未检测出活性。
进行上述洗涤后，用含有0.2M氯化钠的20mM Tris-盐酸缓冲液3500mL洗脱。在该条件下，具有活性的蛋白质被洗脱。然后用含有0.5M氯化钠的20mM Tris-盐酸缓冲液3500mL洗脱，该级分中未检测出活性。
回收用上述含有0.2M氯化钠的20mM Tris-盐酸缓冲液洗脱的级分，测定蛋白量和酶活性。将显示活性的溶液3900mL用含有20％饱和硫酸铵的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH＝7.0)透析3次，每次12L。透析后的酶液为3000mL。
(1-3)通过Butyl-TOYOPEARL(TOSOH公司制)进行纯化将上述(1-2)中得到的酶液3000mL倒入用含有20％饱和硫酸铵的20mMTris-盐酸缓冲液(pH＝7.0)平衡过的Butyl-TOYOPEARL(TOSOH社制)500mL中。然后用该含有20％饱和硫酸铵的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH＝7.0)2800mL洗涤。测定洗涤级分的蛋白量和酶活性，结果在该级分中检测出活性。往洗涤所得的酶液中直接加入硫酸铵，得到浓度为5～20％的饱和硫酸铵级分，并再次倒入Butyl-TOYOPEARL中。
(1-4)通过Butyl-TOYOPEARL(TOSOH社制)的第二轮纯化将从硫酸铵级分所得的酶液5700mL倒入用含有30％饱和硫酸铵的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡过的Butyl-TOYOPEARL(TOSOH社制)500mL中。然后，用含有30％饱和硫酸铵的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)2300mL洗涤。测定洗涤级分的蛋白量和酶活性，结果在该级分中检测出活性。然后，将该柱用含有15％饱和硫酸铵的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)洗脱。结果，洗脱液中也检测出活性。回收显示活性的上述两个级分，加入3070g硫酸铵使达到60％饱和浓度，搅拌、浓缩。结果酶液变成600mL。将其用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)14L透析3次，所得的酶液变成1000mL。
(1-5)通过DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)进行纯化将上述(1-4)中透析所得的酶液1000mL加入已用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡过的DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)600mL中。然后用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)4000mL洗涤。洗涤级分中未发现活性。然后用含有0.1M氯化钠的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)2500mL洗脱。结果在该级分中几乎没有检测到活性。然后用浓度为0.1～0.3M的氯化钠梯度洗脱蛋白质。回收具有酶活性的级分，得到1700mL酶液。往该酶液中加入760g硫酸铵并搅拌、浓缩。结果酶液变成60mL。将其用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)8L透析2次。透析后酶液变成100mL。
(1-6)通过Green-Sepharose CL-4B进行纯化将市售的经膨胀的SepharoseCL-4B凝胶150ml置于玻璃过滤器上，用1L蒸馏水进行空吸洗涤。并将其转移到2L坡口烧瓶中。往其中加入ReactiveGreen 19(Sigma公司制)0.75g(7.5mg色素/mL凝胶的比例)的水(150mL)溶液。进一步加入22％的氯化钠水溶液15mL(最终浓度约2％)，以凝胶和色素充分混合的程度振荡搅拌约30分钟。加入1.5g结晶碳酸钠，在50℃振荡搅拌过夜。反应结束后，将凝胶悬浮液转移到玻璃过滤器上，依次用水(约1.5L)、1M氯化钠水溶液(约1.5L)、水(约3L)洗涤色素凝胶至看不见滤液的染色，由此制备Green-sepharose CL-4B。
将通过上述方法制备的Green sepharose CL-4B 450mL用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡后，加入上述(1-5)所得的酶液100mL。
然后，用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)3000mL洗涤。洗涤级分中检测到上述(1-5)所得的酶液总活性的15％左右的活性。然后用浓度为0～3M的氯化钠梯度洗脱蛋白质。回收具有酶活性的级分，得到231mL的酶液。往其中加入硫酸铵109g使达到70％饱和浓度，使蛋白质沉淀。将沉淀悬浮到20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)3mL中，用含有20％饱和硫酸铵的20mMTris-盐酸缓冲液(pH 7.0)9L透析8小时。透析后，试管内发现沉淀物，因此加入与透析相同的缓冲液8.5mL进行悬浮。即使用该操作沉淀物也不溶解，因此离心分离沉淀物和上清。活性基本上在上清中被发现，因此将上清13mL用RESOURCE PHE(ァマシャムバィォサィェンス社制)纯化。用含有20mL的20％饱和硫酸铵的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)和20mL的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)梯度洗脱蛋白质。
将回收的酶液19mL通过超滤浓缩至5mL后，用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)透析，结果酶液变成6.5mL。
(1-7)通过Blue-sepharose 4B(ァマシャムバィォサィェンス公司制)的纯化将Blue-sepharose 4B(ァマシャムバィォサィェンス公司制)5mL用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡后加入上述(1-6)所得的酶液6.5mL。然后用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)50mL洗涤。接着用50mL的1M氯化钠水溶液与50mL的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)以0～1M的氯化钠浓度梯度洗脱活性级分。
上述(1-1)～(1-7)各纯化步骤中的酶级分的比活性等总结示于表1。
表1
实施例2SDS-PAGE和部分氨基酸序列的分析将各酶纯化步骤的样品全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
有一条约35-40KDa的带随着纯化程度的提高其量也增加，通过常规方法切出此带，用蛋白测序仪通过Edman法进行氨基酸序列分析，确定N末端的氨基酸序列。将该序列示于序列表序列号3。
通过BLAST检索结果提示，该蛋白质是与苹果酸脱氢酶同源性高的蛋白质。
实施例3酶基因的克隆由将恶臭假单胞菌ATCC12633株用LB培养基培养所得的菌体用DNeasy Tissue Kit(Qiagen公司制)处理，制备染色体DNA。
以编码实施例2确定的N末端氨基酸序列和BLAST检索中发现的氨基酸序列的碱基序列为基础合成引物。各自的碱基序列示于序列表的序列号4(NMPDHf)和5(NMPDHr1)。
以恶臭假单胞菌ATCC12633株的染色体DNA为模板，用NMPDHf，NMPDHr1作引物，进行PCR(98℃，20秒，68℃，3分钟)30个循环，得到特异性扩增样品。
将上述所得的DNA片断根据常法导入克隆载体pET21a(宝酒造社制))中。(将该质粒定为pENMadh)然后转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)(Novagen公司)。
使转化株在含有氨苄西林(100μg/mL)的LB培养基平皿(LB培养基+2％琼脂)上于37℃繁殖。将出现的数个白色菌落进行培养，在常规条件下进行质粒的提取。获得的质粒用制限酶NdeI和HindIII消化(37℃，3小时)后，通过琼脂糖电泳确认目的DNA片断是否插入到质粒中。
将被认为插入了目的DNA片断的菌落用含有氨苄西林的液体LB培养基培养，在培养的第14小时添加IPTG，使其浓度达到0.1mM，继续培养3小时，收集菌体。将菌体进行超声破碎，得到粗制酶。
测定所得的粗制酶的活性，确认目的蛋白的表达。
经确认，使用由携带目的片断的菌落获得的粗制酶，生成了N-甲基-苯丙氨酸，而仅用质粒转化的菌体破碎物中未发现N-甲基-苯丙氨酸生成。
分析确认了活性的质粒中的插入片断的碱基序列。该基因的碱基序列示于序列表的序列号2，编码该基因的蛋白质的氨基酸序列示于序列表的序列号1。
实施例4利用转化体的无细胞提取液合成N-甲基-苯丙氨酸往试管中加入LB培养基5mL，在121℃进行20分钟蒸气杀菌，变成室温后加入100mg/ml的氨苄西林水溶液5μL。用接种环往其中无菌接种实施例3所得的大肠埃希氏菌克隆株的菌落，在37℃振荡培养24小时(前培养)。然后将LB培养基50mL加入到500mL坡口烧瓶并杀菌，变成室温后加入100mg/ml氨苄西林水溶液50μL。往其中接种前培养所得的大肠埃希氏菌克隆株的培养液0.5mL，在37℃振荡培养10小时。在这一阶段加入1M的IPTG水溶液50μL，进一步在37℃振荡培养3小时。培养后，通过离心分离收集菌体，用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)洗涤2次。将所得的菌体0.37g悬浮在20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)8.0mL中，用超声波将菌体破碎。通过离心分离除去菌体碎片，得到8.0mL无细胞提取液。
在50mL的烧杯中，往包含苯丙酮酸钠60mg、NADPH 2.3mg、葡萄糖脱氢酶35U、葡萄糖1g的40mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)5.88ml中加入用硫酸调至pH＝8.0的240mM甲胺5.88mL、上述无细胞提取液3.25mL，在30℃进行反应。反应在一边用1当量的氢氧化钠水溶液调至pH＝8.0，一边搅拌中进行。用HPLC定期分析反应液的一部分，底物苯丙酮酸钠枯竭时，进一步补加30mg使反应继续进行。重复该操作8次，反应24小时。反应结束后的N-甲基苯丙氨酸生成量为146mg。
实施例5从转化体纯化酶往试管中加入LB培养基5mL，在121℃进行20分钟蒸气杀菌，变成室温后加入100mg/ml的氨苄西林水溶液5μL。用接种环往其中无菌接种实施例3中所得的大肠埃希氏菌克隆株的菌落，在37℃振荡培养24小时(前培养)。然后将LB培养基500mL加入到2L的坡口烧瓶并杀菌，变成室温后加入100mg/ml的氨苄西林水溶液500μL。往其中接种前培养所得的大肠埃希氏菌克隆株的培养液0.5mL，在37℃振荡培养14小时。在这一阶段加入1M的IPTG水溶液500μL，进一步在37℃振荡培养3小时。培养后，通过离心分离收集菌体，用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)洗涤2次。将所得的菌体3.3g悬浮在20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)28mL中(总量30ml)，用超声波破碎菌体。通过离心分离除去菌体碎片，得到29mL无细胞提取液。然后用实施例1中所用的Green sepharose CL-4B进行纯化。
将Green sepharose CL-4B(树脂100ml量)用Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡后，倒入上述无细胞提取液。
然后用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)800mL洗涤。用浓度为0～1M氯化钠溶液梯度从洗涤级分中洗脱蛋白质。回收具有酶活性的级分，将其用Centriprep(ァマシャムバィォサィェンス公司制)浓缩，并用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)将其透析8小时。透析后，酶液量变成59ml。
然后用DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)进行纯化。
将上述透析所得的酶液供给到用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡过的DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)(树脂60mL)中。然后，用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)500mL洗涤。接着，用浓度为0～0.35M的氯化钠溶液梯度洗脱蛋白质。回收具有酶活性的级分，用Centriprep(ァマシャムバィォサィェンス公司制)浓缩后，用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)进行透析。透析后酶液变成6mL。
上述各纯化步骤中酶级分的比活性比总结示于表2。
表2
实施例6本发明酶的底物特异性用与实施例5相同的方法从大肠埃希氏菌克隆株获得纯化的本发明酶。
往其中加入表3所示的各种酮酸(最终浓度10mM)、NADPH(最终浓度0.2mM)、用硫酸调至pH＝10的甲胺(最终浓度60mM)，测定所得反应液在340nm处的吸光度变化，由此测定酶活性。测定时的反应温度为37℃。以β-苯丙酮酸作为底物时的活性定为100％，相对活性的测定结果如表3所示。
表3
实施例7最适pH的测定用与实施例5相同的方法从大肠埃希氏菌克隆株获得纯化的本发明酶。
往其中加入β-苯丙酮酸(最终浓度10mM)、NADPH(最终浓度0.2mM)、用硫酸调至各pH的甲胺(最终浓度60mM)，测定所得的反应液在340nm处的吸光度变化，由此测定酶活性。测定时的反应温度为37℃。将一分钟内与1微摩尔β-苯丙酮酸反应的酶量定为1个单位，每份蛋白量的单位数(u/mg)与pH的关系结果如图1所示。反应的最适pH为10.0。
实施例8酶作用的最适温度采用与实施例6相同的反应条件并用甲胺-硫酸(pH＝10)测定活性，不同仅在于温度。结果如图2所示。最适温度为30～40℃。
实施例9pH稳定性将实施例5中所得的纯化酶用缓冲液在不同pH值，在30℃保温3分钟，测定残留活性。反应条件与实施例7相同，用甲胺-硫酸(pH＝10)、在37℃进行。将未处理的酶活性作为100，结果以残留活性表示，如图3所示。本发明的酶在pH＝6～9中最稳定。
实施例10酶的温度稳定性将实施例5所得纯化酶在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃的温度放置30分钟后，与实施例7同法测定活性。将未处理(冰中放置)的酶活性作为100，结果以残留活性表示，如图4所示。本发明的酶一直到30℃都显示100％的残留活性。
实施例11用NADH作为辅酶时本发明酶的底物特异性用与实施例5相同的方法从大肠埃希氏菌克隆株获得纯化的本发明酶。
往其中加入表4所示的各种酮酸(最终浓度40mM(但其中β-苯丙酮酸为30mM)、NADH(最终浓度0.3mM)、bis-Tris丙烷缓冲液(pH10.0)(最终浓度100mM)、甲胺(最终浓度180mM)，测定所得反应液在340nm处的吸光度变化，由此测定酶活性。测定时的反应温度为37℃。将以丙酮酸为底物时的活性定为100％，相对活性结果如表4所示。
表4
实施例12以NADH为辅酶时的最适pH的测定用与实施例5相同的方法从大肠埃希氏菌克隆株获得纯化的本发明酶。
往其中加入丙酮酸(最终浓度80mM)、NADH(最终浓度0.3mM)、用硫酸调至不同pH的甲胺(最终浓度180mM)，测定所得反应液在340nm处的吸光度变化，由此测定酶活性。测定时的反应温度为37℃。将一分钟内与1微摩尔丙酮酸反应的酶量定为1个单位，每份蛋白量的单位数(u/mg)与pH的关系结果如图5所示。反应的最适pH为9.5。
实施例13以NAD为辅酶时的逆反应的研究用与实施例5相同的方法从大肠埃希氏菌克隆株获得纯化的本发明酶。
测定加入了N-甲基-L-丙氨酸(最终浓度50mM)、NAD(最终浓度10mM)、bis-Tris丙烷缓冲液(pH10.0)(最终浓度100mM)的反应液在340nm处的吸光度变化，由此测定酶活性。测定时的反应温度为37℃。活性为7.8×10-3(u/mg蛋白)。
实施例14以NADPH为辅酶时本发明酶的底物特异性用与实施例5相同的方法从大肠埃希氏菌克隆株获得纯化的本发明酶。
往其中加入表5所示的各种胺类(最终浓度60mM)、NADPH(最终浓度0.2mM)、β-苯丙酮酸(最终浓度10mM)，测定所得反应液在340nm处的吸光度变化，由此测定酶活性。测定时的反应温度为37℃。将以甲胺作为底物时的活性定为100％，相对活性的结果如表5所示。
表5
实施例15从枯草芽孢杆菌纯化DNA将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis株)在LB培养基上进行培养，制备细胞。由细胞制备染色体DNA时用Qiagen试剂盒(Qiagen公司制)，根据随附的指南中记载的方法进行。
实施例16从枯草芽孢杆菌克隆葡萄糖脱氢酶基因为了进行NADPH的再生，进行文献(J.Bacteriol.166，238-243(1986))记载的来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(以下简称为GDH)基因的克隆。仅对GDH基因的可读框部分进行PCR克隆，为此，以文献记载的碱基序列为基础，根据结构基因的5’-末端、3’-末端序列合成引物BsuG_S(序列号6)、BsuG_A(序列号7)。以实施例17中制备的枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板，进行PCR(94℃，30秒，54℃，30秒，72℃1分钟)30个循环，得到特异性扩增DNA。将所得的DNA片断用EcoRI和HindIII两种限制酶消化。将质粒载体pKK223-3(ァマシャム-ファルマシァ公司制)用EcoRI和HindIII消化，将上述PCR扩增DNA片断用T4 DNA连接酶连结，得到pKK223-3GDH。分析插入片断的碱基序列，结果与数据库(DDBJ登录号M12276)中收录的碱基序列完全一致。所得的GDH基因的碱基序列如序列号8所示。
实施例17可以与pENMadh[往pET21a中插入本发明脱氢酶的DNA片断所得的质粒]共表达的GDH质粒pSTV28-GDH的构建将实施例16中构建的pKK223-3GDH用EcoRI、PstI两种限制酶消化，制备包含枯草芽孢杆菌GDH基因的片断。将质粒载体pSTV28(TAKARA社制)用EcoRI、PstI消化，将包含上述GDH的片断用T4 DNA连接酶连结，得到pSTV28-GDH。
实施例18来自枯草芽孢杆菌的GDH与本发明脱氢酶在大肠埃希氏菌中的共表达将携带pENMadh的大肠埃希氏菌BL21(DE3)克隆株用pSTV28-GDH转化。将重组大肠埃希氏菌接种到包含100ug/mL氨苄西林、25ug/mL氯霉素的液体LB培养基中，培养17小时后，添加1mM IPTG，进一步培养3小时。收集细胞后，悬浮在20mM Tris-HCL(pH7.0)中，测定通过超声破碎所得的细胞粗提取液的酶活性。
(1)本发明脱氢酶活性的测定本发明脱氢酶活性的测定在包含100mM bis-Tris丙烷缓冲液(pH10.0)、0.2mM NADPH、30mM甲胺、10mM丙酮酸钠的反应液中在30℃进行。1U定为在上述反应条件下在1分钟内氧化1μmol NADPH的酶量。结果为6.6U/mg蛋白。
(2)葡萄糖脱氢酶活性的测定往粗制酶10μl中加入葡萄糖(最终浓度100mM)、NADP(最终浓度2mM)、Tris-盐酸缓冲液(pH9.0)(最终浓度100mM)，测定所得反应液1ml在340nm处的吸光度变化，由此测定酶活性。测定时的反应温度为30℃。将一分钟内与1微摩尔葡萄糖反应的酶量定为1个单位，计算每份蛋白量的单位数(u/mg)。结果每1mg蛋白为3.4U。
实施例19用葡萄糖脱氢酶共表达转化体合成N-甲基-苯丙氨酸将实施例18中所得的大肠埃希氏菌与实施例17同法培养，得到培养液100ml。培养后通过离心分离收集菌体，用包含0.85％氯化钠的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)40ml洗涤2次，得到静止期细胞。
往所得的静止期细胞中加入包含苯丙酮酸钠(最终浓度100mM)、NADP(最终浓度0.2mM)、葡萄糖(最终浓度100mM)和甲胺-盐酸(pH9)(最终浓度700mM)的反应液，使细胞浊度变成20(660nm的吸光度)。在30℃搅拌进行反应。反应在一边用10当量的氢氧化钠水溶液调至pH＝8～9，一边搅拌下进行。24小时反应后的N-甲基苯丙氨酸生成量为13.4g/L(反应收率75％)。
实施例20与D-氨基酸氧化酶的共反应(1)用与实施例10相同的方法获得大肠埃希氏菌克隆株的纯化的本发明酶。
往其中加入D-苯丙氨酸(最终浓度50mM)、NADPH(最终浓度10mM)、用硫酸调至pH＝10的甲胺(最终浓度60mM)、Tris-盐酸缓冲液(pH9)(最终浓度100mM)，往所得的反应液100μl中加入D-氨基酸氧化酶(シグマ公司制，来自猪肾)0.052单位。此时反应液中本发明酶的蛋白量变成26.5μg。测定时的反应温度为30℃。
900分钟后往反应液中加入三氯乙酸25μl使其最终浓度为2％，使反应终止。将反应液通过下述条件的HPLC进行分析。
色谱柱ODS柱UK-C18 250×4.6mm(imtakt公司制)洗脱液水100％流速0.5ml/min温度40℃
检测UV210nm测定结果表明生成了N-甲基苯丙氨酸0.46g/L，残留的苯丙氨酸为1.06g/L。
实施例21与D-氨基酸氧化酶的共反应(2)除用D-蛋氨酸代替苯丙氨酸外，其他与实施例20同样进行。HPLC色谱如图6所示。蛋氨酸的HPLC保留时间为10.6分钟，14.1分钟的峰估计是随着反应生成的N-甲基蛋氨酸。于是用相同分析柱进行下述条件的LC-质谱。质谱结果如图7所示。推定为N-甲基蛋氨酸的峰的分子量为163，与N-甲基蛋氨酸的分子量一致。
LC-MASS条件装置Waters2690型セパレ一ションモジュ一ル和micromass ZMD型质谱仪色谱柱ODS柱UK-C18 250×4.6mm(imtakt公司制)洗脱液水100％流速0.5ml/min温度40℃检测UV210nm离子化法ェレクトロスプレ一离子化法(ESI)正离子检测质谱扫描条件m/z60-500 1sec外加电压3.6kV锥体(コ一ン)电压10V实施例22与L-苯丙氨酸脱氢酶的共反应除了用L-苯丙氨酸脱氢酶(シグマ公司制)代替D-氨基酸氧化酶和用L-苯丙氨酸代替D-苯丙氨酸外，其它与实施例20同样进行反应。
结果生成N-甲基苯丙氨酸0.21g/L，残留的L-苯丙氨酸为2.75g/L。
实施例23用与实施例10相同的方法从大肠埃希氏菌克隆株获得纯化的本发明酶。
往14μg酶中加入甲基丙酮酸(最终浓度30mM)、NADPH(最终浓度10mM)、用硫酸调至pH＝10的甲胺(最终浓度60mM)、磷酸缓冲液(pH7)(最终浓度100mM)，使所得反应液100μl在反应温度30℃下反应4小时。反应结束后用下述条件的HPLC进行分析。
色谱柱CHIRALPAK WH 250×4.6mm(ダィセル公司制)洗脱液2mM CuSO4流速0.5ml/min温度50℃检测UV254nm结果生成N-甲基丙氨酸0.1g/L。
产业适用性本发明提供与公知的脱氢酶具有不同性质的新型脱氢酶。通过使用本发明的脱氢酶，可以制备能用作医药或农药中间原料的N-烷基氨基酸。
序列表<110>三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation)<120>新型脱氢酶和编码该脱氢酶的基因<130>A31107A<160>8<210>1<211>341<212>PRT<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)<400>1Met Ser Ala Pro Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu1 5 10 15Leu Gln Ser Leu Leu Gln Ala Ile Phe Gln Arg His Gly Cys Ser Glu20 25 30Ala Val Ala Arg Val Leu Ala His Asn Cys Ala Ser Ala Gln Arg Asp35 40 45Gly Ala His Ser His Gly Val Phe Arg Met Pro Gly Tyr Val Ser Thr50 55 60Leu Ala Ser Gly Trp Val Asp Gly Gln Ala Thr Pro Gln Val Ser Asp65 70 75 80Val Ala Ala Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala Ala Gly Gly Phe Ala Gln85 90 95Pro Ala Leu Ala Ala Ala Arg Glu Leu Leu Val Ala Lys Ala Arg Ser100 105 110Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile His Asn Ser His His Phe Ala Ala115 120 125
Leu Trp Pro Asp Val Glu Pro Phe Ala Glu Glu Gly Leu Val Ala Leu130 135 140Ser Val Val Asn Ser Met Thr Cys Val Val Pro His Gly Ala Arg Lys145 150 155 160Pro Leu Phe Gly Thr Asn Pro Ile Ala Phe Ala Ala Pro Cys Ala Glu165 170 175His Asp Pro Ile Val Phe Asp Met Ala Thr Ser Ala Met Ala His Gly180 185 190Asp Val Gln Ile Ala Ala Arg Ala Gly Gln Gln Leu Pro Glu Gly Met195 200 205Gly Val Asp Ala Asp Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Lys Ala Ile Leu210 215 220Glu Gly Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly Gly His Lys Gly Ser Ala Leu225 230 235 240Ser Met Met Val Glu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gly Gly His Phe245 250 255Ser Trp Glu Phe Asp Trp Ser Gly His Pro Gly Ala Lys Thr Pro Trp260 265 270Thr Gly Gln Leu Ile Ile Val Ile Asn Pro Gly Lys Ala Glu Gly Glu275 280 285Arg Phe Ala Gln Arg Ser Arg Glu Leu Val Glu His Met Gln Ala Val290 295 300Gly Leu Thr Arg Met Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Arg Glu Arg Glu Val305 310 315 320Ala Glu Glu Glu Gly Val Ala Val Thr Glu Gln Glu Leu Gln Gly Leu325 330 335Lys Glu Leu Leu Gly
340<210>2<211>1026<212>DNA<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)<400>2atg tcc gca cct tcc acc agc acc gtt gtg cgc gtg cct ttt acc gag48Met Ser Ala Pro Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu1 5 10 15ctg caa agc ctg ttg cag gcc att ttc cag cgc cat ggg tgc agc gag96Leu Gln Ser Leu Leu Gln Ala Ile Phe Gln Arg His Gly Cys Ser Glu20 25 30gcc gtg gcc cgg gtg ctg gcc cac aac tgc gcc agc gcc cag cgt gat144Ala Val Ala Arg Val Leu Ala His Asn Cys Ala Ser Ala Gln Arg Asp35 40 45ggc gcc cat agc cat ggg gtg ttc cgc atg ccc ggt tat gtc tcg acc192Gly Ala His Ser His Gly Val Phe Arg Met Pro Gly Tyr Val Ser Thr50 55 60ttg gcc agc ggc tgg gtc gat ggc cag gcc acg cca cag gtc agc gac240Leu Ala Ser Gly Trp Val Asp Gly Gln Ala Thr Pro Gln Val Ser Asp65 70 75 80gtg gcc gcc ggc tat gtg cgt gtc gat gct gcg ggc ggt ttt gcc cag288Val Ala Ala Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala Ala Gly Gly Phe Ala Gln85 90 95cea gca ctg gcg gcg gcc cgt gag ctg ttg gtg gcg aag gcg cgc agc336Pro Ala Leu Ala Ala Ala Arg Glu Leu Leu Val Ala Lys Ala Arg Ser
100 105 110gca ggc att gcc gtg ctg gcg atc cac aac tcg cac cac ttc gcc gcg384Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile His Asn Ser His His Phe Ala Ala115 120 125cta tgg ccg gat gtc gag ccg ttc gcc gaa gag ggc ctg gta gcc ctc432Leu Trp Pro Asp Val Glu Pro Phe Ala Glu Glu Gly Leu Val Ala Leu130 135 140agc gtg gtc aac agc atg acc tgc gtg gtg ccg cat ggt gca cgc aag480Ser Val Val Asn Ser Met Thr Cys Val Val Pro His Gly Ala Arg Lys145 150 155 160ccg ctg ttc ggt acc aac ccc atc gct ttt gct gcg cct tgc gcc gag528Pro Leu Phe Gly Thr Asn Pro Ile Ala Phe Ala Ala Pro Cys Ala Glu165 170 175cat gac ccg atc gtt ttc gac atg gcc acc agt gcc atg gcc cat ggc576His Asp Pro Ile Val Phe Asp Met Ala Thr Ser Ala Met Ala His Gly180 185 190gat gtg cag att gcc gcg cgc gcc ggc cag caa ttg ccg gag ggc atg624Asp Val Gln Ile Ala Ala Arg Ala Gly Gln Gln Leu Pro Glu Gly Met195 200 205ggg gtg gat gcc gat ggc cag ccg acc acc gac ccg aag gcg atc ctg672Gly Val Asp Ala Asp Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Lys Ala Ile Leu210 215 220gaa ggc ggc gcc ctg ctg cca ttt ggc ggg cac aag ggc tcg gcg ttg720Glu Gly Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly Gly His Lys Gly Ser Ala Leu225 230 235 240tcg atg atg gtc gag ctg ctg gcg gcg gcg ctg acc ggc ggt cat ttc768Ser Met Met Val Glu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gly Gly His Phe
245 250 255tcc tgg gag ttc gat tgg tcc ggg cat ccg ggg gcg aaa acg cca tgg816Ser Trp Glu Phe Asp Trp Ser Gly His Pro Gly Ala Lys Thr Pro Trp260 265 270acc ggg cag ttg atc atc gtc atc aac cca ggc aag gcc gag ggc gag864Thr Gly Gln Leu Ile Ile Val Ile Asn Pro Gly Lys Ala Glu Gly Glu275 280 285cgc ttt gcc cag cgc agc cgc gag ctg gtg gag cac atg cag gcg gtg912Arg Phe Ala Gln Arg Ser Arg Glu Leu Val Glu His Met Gln Ala Val290 295 300ggg ctg acg cgc atg ccg ggc gag cgg cgc tac cgt gag cgc gag gtg960Gly Leu Thr Arg Met Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Arg Glu Arg Glu Val305 310 315 320gcc gag gag gag ggg gtg gcg gtg acc gag cag gag ttg caa ggc ctg1008Ala Glu Glu Glu Gly Val Ala Val Thr Glu Gln Glu Leu Gln Gly Leu325 330 335aaa gag ctg ctt ggc tga1026Lys Glu Leu Leu Gly340<210>3<211>16<212>PRT<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)<400>3Ala Phe Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu Lys Gln1 5 10 15
<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4ggaattccat atgtccgcac cttccaccag caccg35<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>5gggaagcttt cagccaagca gctctttcag g31<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>6cggaattcat gtatccggat ttaaaagg28
<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>7gcaagcttat taaccgcggc ctg23<210>8<211>783<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>8atg tat ccg gat tta aaa gga aaa gtc gtc gct att aca gga gct gct48Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala1 5 10 15tca ggg ctc gga aag gcg atg gcc att cgc ttc ggc aag gag cag gca96Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala20 25 30aaa gtg gtt atc aac tat tat agt aat aaa caa gat ccg aac gag gta144Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val35 40 45aaa gaa gag gtc atc aag gcg ggc ggt gaa gct gtt gtc gtc caa gga192Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly50 55 60
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权利要求
1.一种具有以下理化性质的脱氢酶(1)作用用NADPH和/或NADH作为辅酶由丙酮酸与烷基胺或二烷基胺生成N-烷基-L-丙氨酸；(2)底物特异性对烷基胺或二烷基胺显示活性，但对氨不显示活性；(3)以苯丙酮酸和甲胺为底物时的最适pH为10左右；和，(4)在30℃处理30分钟后，酶在pH5～10.5左右稳定。
2.下述任意一项的多肽(1)包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽；(2)包含在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一个至多个氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有脱氢酶活性的多肽；或(3)包含与序列号1所示的氨基酸序列具有50％或50％以上同源性的氨基酸序列，并且具有脱氢酶活性的多肽。
3.编码权利要求2所述的多肽的DNA。
4.下述任意一项的DNA(1)包含序列号2所示的碱基序列的DNA；(2)包含在序列号2所示的碱基序列中缺失、取代和/或添加一个至多个碱基所得的碱基序列，并且编码具有脱氢酶活性的多肽的DNA；或(3)与包含序列号2所示的碱基序列的DNA在严紧条件下杂交，并且编码具有脱氢酶活性的多肽的DNA。
5.包含权利要求3或4所述的DNA的重组载体。
6.一种转化体，其包含权利要求3或4所述的DNA或权利要求5所述的重组载体。
7.N-烷基-氨基酸衍生物的制备方法，该方法包括使下述通式(I)所示的含有二羰基的化合物与R3(R4)NH(式中，R3和R4分别独立地表示氢原子或可以被取代的烷基，但R3与R4不同时为氢原子)所示的烷基取代胺类，在权利要求1所述的脱氢酶、权利要求2所述的多肽或权利要求6所述的转化体的存在下进行反应 (式中，R1表示氢原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)。
8.权利要求7所述的制备方法，其中R1为氢原子。
9.权利要求7或8所述的制备方法，其中R3为可以被氨基取代的C1～C6直链、支链或环状烷基，R4为氢原子。
10.权利要求7～9中任意一项所述的制备方法，其中式(I)所示的含有二羰基的化合物为丙酮酸、苯丙酮酸、β-氟代丙酮酸、2-氧代丁酸、2-酮基己酸或2-酮基正戊酸。
11.N-烷基-氨基酸衍生物的制备方法，该方法包括使下述通式(II)所示的氨基羧酸类、与可以将通式(II)所示的氨基羧酸类转变成通式(I)所示化合物的酶、以及R3(R4)NH(式中，R3和R4分别独立地表示氢原子或可以被取代的烷基，但R3与R4不同时为氢原子)所示的烷基取代胺类，在权利要求1所述的脱氢酶、权利要求2所述的多肽或权利要求6所述的转化体的存在下进行反应 (式中，R1表示氢原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)； (式中，R1和R2与通式(II)中的定义相同)。
12.权利要求11所述的制备方法，其中R3为可以被氨基取代的C1～C6直链、支链或环状烷基，R4为氢原子。
13.权利要求11或12所述的制备方法，其中通式(II)所示的氨基羧酸类为苯丙氨酸或蛋氨酸。
14.权利要求11～13中任意一项所述的制备方法，其中可以将式(II)所示的氨基羧酸类转变成式(I)所示的烷基取代胺类的酶为D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸脱氢酶、氨基酸转移酶。
全文摘要
本发明的目的是提供与公知脱氢酶具有不同性质的新型脱氢酶。根据本发明，提供具有以下理化性质的脱氢酶(1)作用以NADPH和/或NADH为辅酶由丙酮酸和烷基胺或二烷基胺生成N－烷基－L－丙氨酸；(2)底物特异性对烷基胺或二烷基胺显示活性，而对氨不显示活性；(3)以苯丙酮酸和甲胺为底物时的最适pH为10左右；和，(4)在30℃处理30分钟后，酶在pH5～10.5左右稳定。
文档编号C12N15/31GK1639328SQ0380486
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月27日 优先权日2002年2月28日
发明者江崎信芳, 三原久明, 原磨理, 上田诚 申请人:三菱化学株式会社