专利名称：培养容器和培养设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于培养细胞的培养容器和培养设备。
背景技术：
培养细胞时，按顺序执行多个步骤，所述步骤包括提取步骤，从提取自患者体内的骨髓液或其他体液中提取出待培养细胞；培养基制备步骤，制备适合于待培养细胞的培养基；初级培养步骤，将所提取的细胞放与培养基一起投入适合的培养容器中，并在预定培养条件培养；以及二次培养步骤，将初级培养之后的细胞混合到人体组织填充材料中进一步培养。
传统上认为，这种类型的细胞培养应在洁净室中执行，该洁净室在整体密封之后其内部的尘埃量受到控制(例如，见特公平3-57744、第二页、第三行)。
也就是说，在洁净室中，例如形成从天花板朝向地板流动的空气流，在这种情况下，当各处理步骤中产生了尘粒等时，尘粒通过空气的流动被运往地板方向，然后被设置在地板下面的集尘器收集。在洁净室中布置有机械臂，并且细胞可在各步骤之间被传送。
然而，在以这种方式在比较大的洁净室中执行所有处理步骤的情况中，由于在其中执行各步骤的空间是连续的，因此在一个步骤中所产生的尘粒可能污染出于其他步骤的细胞。因此，在同时培养多个细胞的情况中，由于细胞之间的混合或被添加的物质污染，因而导致产生了问题。
考虑到前述情况，本发明的目的是提供能够使用简单结构减少在各处理步骤中因灰尘、细菌等产生的污染的培养容器和培养设备。
发明内容
本发明提供了一种培养容器，包括具有一个其中密封有培养基的主培养容器的至少一个培养基容器，以及能够容纳所述培养容器中的流体的至少一个废培养基容器，通过能够限制所述容器之间流体的流动的连接管线使得所述培养基容器和培养容器相对于外部密封。
在具有前述结构的培养容器中，细胞被放置在主培养容器中，解除培养基容器与主培养容器之间的连接管线中流体流动的限制，以允许培养基通过连接管线从培养基容器流入到主培养容器中。然后，在这种状态中再次限制在前述连接管线中流体的流动，可使主培养容器的内部相对于其他容器封闭。因此，可以在相对于外部密封的主培养容器中培养细胞。
另外，在经过了指定量的时间之后必须更换主培养容器中的培养基的情况下，解除主培养容器与废培养基容器之间的连接管线的流体流动的限制，同时使培养基从主培养容器朝向废培养基容器流动。因此，主培养容器中不再需要的废培养基可被排出到废培养基容器中。
随后，通过再次使培养基从培养基容器朝向主培养容器流动并限制连接管线中的流体流动而继续进行细胞培养。
以这种方式，由于可在完全密封的容器中执行细胞培养和细胞培养所需的培养基的供应和更换，所以即使以极接近的方式执行多种类型的细胞培养，也可抑制细胞的混合和被细菌等污染。
另外，本发明提供了一种培养容器，其中前述连接管线装有阀，并且通过所述阀允许或限制连接管线内的流体流动。依照该培养容器，可通过控制所述阀而控制连接管线中的流体流动。因此，连接管线可被容易地打开和关闭，使得可在诸如培养基从培养基容器中流入主培养容器、从主培养容器中向废培养基容器中排出培养基以及在主培养容器中培养细胞的步骤之间进行切换。
另外，本发明提供了一种培养容器，其中连接管线是用挠性材料制成的并且通过夹紧那些连接管线而限制其中的流体流动。依照该培养容器，在从培养容器的外部压迫连接管线时，由挠性材料制成的连接管线被压扁，内部的流路被阻塞，限制了流体的流动。因此，在无需在连接管线中提供阀的情况下可简化培养容器的结构。在培养容器是一次性的情况下，通过简化结构来减少成本是理想的。
另外，本发明提供了一种培养容器，其中血液收集管线与主培养容器相连接。依照该培养容器，通过将血液收集管线插入到患者体内并从患者体内收集血液、骨髓或其他体液，待培养的细胞可被供应到主培养容器中。
另外，本发明提供了一种培养容器，其中通过连接管线将密封有蛋白分解酶的至少一个酶容器连接于主培养容器，所述连接管线在它相对于外部密封的状态下限制它们之间的流体流动。依照该培养容器，在例如培养粘着性细胞诸如间叶干细胞的情况中，细胞通过在经过预定培养时间之后附着于主培养容器的内壁而成长。因此，在会收所述细胞的情况中，在已将主培养容器中的培养基排出到废培养基容器中之后，可通过解除酶容器与主培养容器之间的连接管线中的流动限制并允许蛋白分解酶流入到主培养容器中而将细胞从主培养容器的内壁上分离下来。
另外，本发明提供了一种培养容器，在该主培养容器中密封有人体组织填充材料。依照该培养容器，当细胞被放置于主培养容器中并且培养基被供应到主培养容器中时，细胞附着于密封在主培养容器中的人体组织填充材料，以人体组织填充材料作为架子(scaffold)生长。所以，在适合的培养周期期间重复进行从培养基容器到主培养容器的培养基供应和不需要的培养基从主培养容器中向废培养基容器中的排出，从而可产生人体组织填充体，其中细胞在人体组织填充材料上已充分地成长。
另外，本发明提供了一种培养容器，其中在主培养容器中密封有人体组织填充材料，并且密封有含增长因子的成长促进剂的至少一种成长促进剂容器通过连接管线与主培养容器相连接，该连接管线在其相对于外部密封的状态下能够限制所述容器之间的流体流动。依照该培养容器，在培养期间通过解除主培养容器与成长促进剂容器之间的连接管线的流体流动限制并且允许含增长因子的成长促进剂流入到主培养容器中可加速细胞的成长。
另外，本发明提供了一种培养容器，其中连接管线是用通过加热可被密封或熔合的一种材料制成的。依照该培养容器，特别是通过加热密封连接管线可只将主培养容器与其他容器相分离。因此，例如，在培养周期结束后，通过加热使连接管线密封可只分离主培养容器，从而只有已成长的细胞被输送或传送。另外，在用人体组织填充材料培养的情况中，通过只分离主培养容器，以只密封人体组织填充体的方式被输送或传送。另外，由于用可通过加热而熔合的材料构成连接管线，因此通过熔合相应的连接管线可将细胞从一个主培养容器中输送到另一个主培养容器中。在这种情况中，由于可在相对于外部密封的空间中执行细胞输送，因此可抑制细菌等的污染。
另外，本发明提供了一种培养容器，其中主培养容器设有端部封闭的封闭型连接管线，并且该封闭型连接管线是用通过加热可被密封或熔合的材料制成的。依照该培养容器，可通过加热切割而后熔合设在一个主培养容器上的封闭型连接管线与设在另一个主培养容器上的封闭型连接管线而将两个主培养容器连接在一起。例如，可通过使得在一个主培养容器中充分成长的细胞经过封闭型连接管线并将它们输送到其中密封有人体组织填充材料的另一个主培养容器而产生人体组织填充体。
另外，本发明优选使构成所述培养容器的各容器的内部容积可变。依照该结构，流体可通过减小容器的内部容积而在容器之间输送。
另外，本发明提供了一种培养设备，所述培养设备装有本发明所涉及的培养容器，以及用于可使构成所述培养容器的容器中的流体流入到设在所述容器中的连接管线中的装置。
在本发明的培养设备中，优选使用这样一种结构，其中构成培养容器的各容器的内部容积可变，并且培养设备装有具有用于容纳构成所述培养容器的各容器的凹槽的壳体，以及用于通过施加外部压力而使容纳在凹槽中的各容器收缩的压制装置。依照该培养设备，通过将培养容器的各容器容纳在形成在壳体中的凹槽中，其中多个容器通过连接管线相连接，从而将培养容器保持在壳体中，整体操纵得到提高。通过使压制装置以这种状态作用，通过选择性地施加外力而使各容器收缩。此时，通过解除连接所收缩的容器的连接管在流动上的限制，密封在收缩的容器内部的流体可通过连接管线被输送到另一个容器。此时，由于各容器被容纳在设在壳体中的凹槽中，因此通过简单地按压所述压制装置可有效地使得内部的流体流出。
另外，本发明提供了一种培养设备，其中连接管线是由挠性材料制成的，通过夹紧所述连接管线而限制管线中的流体流动，培养容器的连接管线从中穿过的连接管线通道被设在壳体中，并且设置有通过沿径向夹紧设置在连接管线通道中的连接管线而限制通过连接管线的流体流动的阀装置。依照该培养设备，由于将构成培养设备的各容器容纳在设在壳体中的凹槽中，各容器被整体容纳在壳体中从而提高操纵容易性。在这种情况中，连接各容器的连接管线被如此设置，即，使其穿过设在壳体中的连接管线通道。由于阀装置设置在连接管线通道中，因此由于阀装置沿径向施加的外力，使得设置在壳体中的连接管线被挤压从而阻断内部的流动路径，由此限制流体流动。
另外，本发明提供了一种装有离心装置的培养设备，并且以与转动轴线相间隔的方式设置用以容纳主培养容器的凹槽，所述离心装置使所述壳体与内部的培养容器一起转动。依照该培养设备，离心装置的运作使安装有培养容器的壳体与所安装的培养容器一起转动，借此，主培养容器内部的培养基和细胞可被离心分离。由于主培养容器以与离心装置的转动轴线相间隔的方式布置，因此通过离心分离，所分离的细胞可积聚在沿径向最远离转动轴心的固定位置处。
另外，本发明提供了一种培养设备，其中具有封闭的端部的封闭型连接管线设置在主培养容器上，所述封闭型连接管线是用通过加热可被密封或熔合的材料制成的，所述壳体具有使壳体与内部的反应容器一起转动的离心装置，并且在主培养容器被容纳在所述壳体的凹槽中的状态下，所述封闭型连接管线沿以转动轴心为中心的主反应容器的径向向外设置。依照该培养设备，尽管所分离的细胞积聚在径向方向上最远离转动轴心的位置处，但由于封闭型的连接管线被设置在该位置处，因此当封闭型连接管线从主培养容器中被挤出时离心分离出的细胞可从所述封闭型连接管线中被有效地移除到外部。
图1是示出了本发明第一实施例中所涉及的培养容器的正视图。
图2是用于解释应用本发明的培养步骤的解释性视图。
图3是用于解释这样一个步骤的示意图，在该步骤中使用图1的培养容器将培养基从培养基容器供应到主培养容器中。
图4是与图3相似的示意图，用于解释这样一个步骤，在该步骤中将培养基从主培养容器排出到废培养基容器中。
图5是示出了图1培养容器的变体的正视图。
图6是示出了图1培养容器的另一个变体的正视图。
图7是示出了图1培养容器的另一个变体的正视图。
图8A、8B和8C是用于解释按步骤顺序说明无菌管切割的立体图。
图9A、9B和9C是用于解释按步骤顺序说明无菌管切割的立体图。
图10是示出了封闭型连接管的端部结构的纵向截面图。
图11是示出了用在本发明第二实施例中所涉及的培养设备中的培养容器的正视图。
图12是示出了其中容纳有图11的培养容器的壳体的平面图。
图13是示出了部分切割的图11的培养设备的纵向截面图。
图14是示出了本发明第三实施例中所涉及的培养设备的平面图。
图15是示出了第一、第二和第三实施例的培养设备的变体的纵向截面图。
图16是示出了本发明第四实施例中所涉及的培养设备的正视图。
图17是图16的培养设备的侧视图。
图18是示出了用在图16的培养设备中的培养容器的正视图。
图19是示出了这样一个步骤的正视图，在所述步骤中培养基在图16的培养设备中从主培养容器被排出到废培养基容器。
图20是示出了这样一个步骤的正视图，在所述步骤中培养基在图16的培养设备中从培养基容器被供应到主培养容器。
图21是示出了图16的培养设备中的培养容器的变体的正视图。
图22是图21中所示的培养容器的立体图。
图23是示出了本发明第五实施例中所涉及的培养设备的侧视图。
图24是图23中所示的培养设备的正视图。
图25是示出了本发明第六实施例中所涉及的培养设备的平面图。
图26是图25中所示的培养设备的正视图。
图27是示出了这样一个步骤的正视图，在所述步骤中培养基在图25的培养设备中从主培养容器中被排出到废培养基容器。
图28是示出了这样一个步骤的正视图，在所述步骤中培养基在图25的培养设备中从培养基容器中被供应到主培养容器。
具体实施例方式下面参照
本发明第一实施例中所涉及的培养容器。
如图1中所示的，本实施例中所涉及的培养容器包括一个主培养容器2、一个培养基容器3、一个废培养基容器4、连接主培养容器2和培养基容器3的第一连接管线5、以及连接主培养容器2和废培养基容器4的第二连接管线6。
主培养容器2、培养基容器3和废培养基容器4分别由诸如氯乙烯等挠性材料构成。另外，第一连接管线5和第二连接管线6也是由诸如氯乙烯制成的挠性管构成的。这些容器2到4以及连接管线5和6的内部空间能够相互连通，并以它们的内部空间相对于外部密封的状态连接。也就是说，可从外部打开和关闭的阀7和8被设置在第一连接管线5和第二连接管线6的中间位置处。
另外，前述培养基容器3中密封有诸如最小必须培养基(MEM)、牛胎儿血清(FBS)以及抗生素等以例如84∶15∶1的预定混合比的培养基。也可用人体血清来代替FBS。前述废培养基容器4最初是空的并处于充分收缩的状态。
前述主培养容器2配有注射口9，所述注射口9可被注射针刺入并且在移除注射针之后可由于弹性而闭合。因此，可通过将用于收集骨髓液的注射器的注射针刺入注射口将诸如骨髓液等体液注入到主培养容器2中，并且可通过从注射口处撤回注射针而使得主培养容器2的内部与外部相隔离。
在解释以该方式构成的本实施例中所涉及的培养容器1的作用之前，将给出用作人体组织填充体的骨填充体的制造过程的大体描述。如图2中所示的，为了制造骨填充体，首先从患者的髂骨等中收集骨髓液。所收集的骨髓液被放置在离心装置并且旋转以便于提取出具有较大比重的骨髓细胞。
所提取的骨髓细胞与预制的培养基一起被放入到培养容器中并且进行混合。一部分培养基被移除并进行感染诊察。
随后，通过保持在诸如预定温度(例如，37±0.5℃)、湿度(例如，100％)以及CO2浓度(例如5％)的培养条件在固定的培养条件下培养混合的骨髓液和培养基预定时间对细胞进行初级培养。在细胞培养的过程中在预定更换时间将培养基从培养容器中排出。然后再次混入培养基并且通过重复培养步骤继续进行培养。对所排出的培养基的一部分进行感染诊察。
在预定培养周期完成后，以及在培养基从培养容器中被排出之后，将蛋白分解酶(诸如胰蛋白酶)加入到培养容器中并进行混合。因此，附着于培养容器底部已成长的间叶干细胞从主培养容器的底部分离。然后通过在离心装置中旋转而提取已经以这种方式分离的间叶细胞。
在调整了细胞数量之后，将所提取的间叶干细胞在容纳有骨填充材料和适合培养基的培养容器中混合。实际上，间叶干细胞通过附着于骨填充材料而装入到培养基中。之后以与前述相同的方式通过保持在诸如预定温度(例如，37±0.5℃)、湿度(例如，100％)以及CO2浓度(例如5％)的培养条件在固定的培养条件下培养混合的间叶干细胞和培养基预定时间以进行二级培养。
同样，在该二级培养步骤中，以与初级培养步骤相同的方式周期性地更换培养基，并且使得一部分加入的培养基和一部分废弃的培养基分别进行感染诊察。在预定的培养周期过后，提取用于质量检验的标本以便于运输和用于感染诊察的标本，并且所制造的骨填充材料被密封并作为成品提供。
下面说明本实施例中所涉及的培养容器1的操作。本实施例中所涉及的培养容器1是在上述培养步骤中的初级培养步骤中所使用的培养容器1。
如前面所述的，通过用用于收集骨髓液的注射器的注射针刺入注射口9将骨髓液注入到主培养容器2中。如图3中所示，在打开设在第一连接管线5中的阀7的同时，通过从外部施力(诸如通过用活塞10挤压)而使培养基容器3的内部容积收缩。因此，预定量培养基从培养基容器3中被供应到主培养容器2中，并且与注入到主培养容器2中的骨髓液相混合。此时，设在第二连接管线6中的阀8关闭。
然后在处于这种状态时通过使主培养容器2经受诸如37±0.5℃的温度和5％CO2的浓度的培养条件而进行培养。可通过将CO2溶解在培养基中或用可渗透CO2的过滤器构成全部或部分主培养容器2而实现CO2培养条件。
随后，当到达了预定的培养基更换时间时，如图4中所示，将设在第二连接管线6中的阀8打开并且通过施加外力(诸如用活塞11施加挤压力)而使主培养容器2收缩。因此，不再需要的培养基通过阀8从主培养容器2被排出到废培养基容器4中。
当已排出预定量的培养基之后，设在第二连接管线6中的阀被再次关闭，设在第一连接管线5中的阀7被打开，并且如图3中所示，使培养基容器3收缩。因此，新鲜的培养基再次被供应到主培养容器2中。
在重复该培养基更换步骤的同时，间叶干细胞通过连续培养而充分地成长。通过加热而密封所有连接到所述主培养容器2的连接管线5和6，然后切割这些管线可独立地运输容纳已成长的间叶干细胞的主培养容器2。
以这种方式，依照本实施例中所涉及的培养容器1，可预先密封培养所需的培养基等，并且在初级培养步骤的整个培养周期中，培养容器1的内容物可以密封的状态与外部隔离。因此，在能够防止被来自于外部的尘粒和细菌污染的同时，还可消除被其他外部细胞污染和感染的影响。因此，可以非常接近的方式同时培养多种细胞，从而提高了培养效率。
而且，尽管本实施例中所涉及的培养容器1是作为适用于其中间叶干细胞以预定次数多次更换培养基时成长的初级培养步骤的培养容器说明的，但是培养容器1也可如此构成，即，使其适用于二级培养步骤，在所述二级培养步骤中骨填充材料(诸如β-磷酸三钙多孔体)被密封在主培养容器2中，并可以添加在初级培养步骤中培养的间叶干细胞。
另外，如图5中所示，血液收集管线12与主培养容器2相连接，并且通过所述血液收集管线12从患者体内收集的骨髓液可被直接加入到主培养容器2中。
另外，如图6中所示，可变内部容积的酶容器13可通过第三连接管线14与主培养容器2相连接。例如，诸如胰蛋白酶的蛋白分解酶被放入到酶容器13中，并且阀15被设在第三连接管线14中。
依照以这种方式构成的培养容器16，在其中间叶干细胞通过附着于主培养容器2的内壁上而成长的初级培养步骤完成之后，设在第二连接管线6中的阀8被打开且不再需要的培养基通过阀8从主培养容器2内部被排出到废培养基容器4中。在随后关闭第二连接管线6的阀8之后，将第三连接管线14中的阀15打开并将胰蛋白酶供应到主培养容器2中。因此，间叶干细胞与主培养容器2的内壁分离并且之后可被收集。
而且，在不使用胰蛋白酶或其他蛋白分解酶的情况下，也可在主培养容器2的内壁上以预定温度为临界进行亲水与疏水特性之间转换的温度响应处理。
通过用共价键将温度响应的高分子聚(N-异丙基丙烯酰胺)固定在内壁上进行温度响应处理。受到温度响应处理的区域以32℃为临界温度，在等于或大于该临界温度时，显示出与市场上可买得到的细胞培养容器相同程度的弱疏水特性，而将温度冷却到该临界温度或以下时，该区域显示出高亲水性。因此，通过在例如37℃下培养之后将温度冷却到32℃或更低，使主培养容器2的内壁改变成显示高亲水性，从而能够非侵害地分离间叶干细胞。
另外，如图7中所示，主培养容器2还可设有具有封闭的端部的封闭型连接管线17。该封闭型连接管线17是由可通过加热而被密封或熔合的一种材料(诸如氯乙烯)制成的。
使用沿图8A中所示的剪切方向移动的加热板18、如图8B中所示的在熔化连接管线的同时切割、和如图8C中所示的在将连接管的内部保持在无菌和密封状态下时封闭所切割的端部可获得以这种方式构成的封闭型连接管线17。该切割程序被称为无菌管切割。
另外，在同时切割图9A中所示的以平行的方式布置的两个封闭型连接管线17A和17B、并且移动所述管线以如图9B中所示使一个连接管线17A与另一个连接管线17B对齐之后，如图9C中所示的，通过移除加热板18而将一个连接管线17A与另一个连接管线17B相连接。尽管在连接过程中接合部分17b是封闭的，但是在通过外力连接管线壁时内部流径是可连续的。也就是说，在将内部保持在无菌状态下时可连接不同的连接管线17A和17B。该连接过程被称为无菌管连接。
也就是说，通过提供这种封闭型连接管线17，通过使用无菌管连接将其中已培养细胞的第一主培养容器2与另一个主培养容器2相连接，可将细胞输送到另一个主培养容器2。通过使用第一主培养容器2作为初级培养容器和另一个主培养容器2作为二级培养容器可连接初级培养步骤和二级培养步骤。
而且，在细胞C存在于封闭型连接管线17的情况中，由于存在细胞C被加热板18破坏的风险，如图10中所示，在封闭型连接管线17的端部中可形成用于切割的备用空间19。也就是说，通过沿穿过备用空间19的剖面线A切割，可防止加热板18与封闭型连接管线17中的细胞C直接接触，从而可在保持细胞C的生命力的同时进行无菌管连接。
接下来，将参照
本发明实施例中所涉及的培养设备。
如图11到13中所示，本实施例中所涉及的培养设备20具有培养容器21、容纳培养容器21的壳体22、挤压培养容器21的压制设备23、以及控制这些操作的控制设备24。
如图11中所示，培养容器21具有通过第一连接管线25相互连接的两个主培养容器2A和2B；通过第二连接管线26到第四连接管线28与第一主培养容器2A相连接的第一培养基容器3A、第一废培养基容器4A以及酶容器29；以及通过第五连接管线30到第七连接管线32与第二主培养容器2B相连接的第二培养基容器3B、第二废培养基容器4B以及成长促进剂容器33。
这些容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33与第一实施例中所涉及的培养容器1的各容器2、3和4相同，是用氯乙烯制成的薄壁容器，并且被构成为当受外力挤压作用时具有可变的内部容积。骨填充材料(诸如β-磷酸三钙多孔体)被密封在第二主培养容器2B中。与第一实施例中相似，培养基、蛋白分解酶(诸如胰蛋白酶)以及增长因子(诸如地塞米松)分别被密封在培养基容器3A和3B、酶容器29以及成长促进剂容器33中。
另外，第一到第七连接管线25到28和30到32都是由诸如氯乙烯等挠性材料构成。因此，在通过弯曲各连接管线25到28和30到32将各容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33布置在任意位置处的同时，通过用位于连接管线25到28和30到32的长度方向的中间位置处的夹子或夹阀沿径向夹紧这些管线而限制其中的流体流动。而且，在第一到第七连接管线25到28和30到32被连接于壳体22之前的状态中，所述连接管线例如由在外力作用下破裂的膜(未示出)封闭，以限制流体流动。
如图12中所示，前述壳体22在具有平板形状的上表面中具有多个凹槽34到41，这些凹槽能够分别将构成前述培养容器21的各容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33容纳。由于凹槽34到41容纳各容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33，这些凹槽34到41的大小形成为容纳各容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33而不会发生移位。
在各凹槽34到41之间都形成有用以容纳连接容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33的各连接管线25到28和30到32的容纳沟槽42到48。另外，夹阀49到55布置在各容纳沟槽42到48中位于所述容纳沟槽42到48的长度方向的中间位置处，该夹阀能沿径向夹紧布置在容纳沟槽42到48中的连接管线25到28和30到32。
另外，通过绝缘材料(未示出)将前述壳体22分成为包含用以容纳两个主培养容器2A和2B的凹槽34和35的第一区域X和包含用以容纳其余容器3A、3B、4A、4B、29和33的凹槽36到41的第二区域Y。将第一区域X可以保持在适合于培养的37±0.5℃的温度，并且将主培养容器2A和2B的周边保持在具有5％CO2浓度的大气中。另外，第二区域Y可被保持在例如大约4℃的冷却状态中。
如图13中所示，前述压制设备23具有布置在前述壳体22上表面上的设备主体56，以及活塞57到62。活塞57到62设置在与壳体22的各凹槽34到41相对应的位置处，并且被构成得能够下降和升高到期望高度。当活塞57到62下降时，容纳于布置于下面的凹槽34到36、38、39和41中的容器2A、2B、3A、3B、29和33被挤压，并且因此，容器2A、2B、3A、3B、29和33收缩以允许内部的流体从容器2A、2B、3A、3B、29和33中被挤出。
以下说明以这种方式构成的本实施例中所涉及的培养设备20的作用。
为了用本实施例中所涉及的培养设备20培养细胞C，首先操纵控制设备24以通过关闭所有的夹阀49到55而夹紧连接管线25到28和30到32来限制流体的流动。同时在这种状态中，患者骨髓液通过血液收集管线或注射器(未示出)被收集并被放入到第一主培养容器2A中。
接下来，操纵控制设备24以便于打开已关闭第二连接管线26的夹阀50，同时操纵压制设备23以使布置在第一培养基容器3A上方的活塞59下降并且通过第二连接管线26将第一培养基容器3A中的培养基供应到第一主培养容器2A中。随后，通过再次关闭第二连接管线26的夹阀50使第一主培养容器2A相对于外部密封。
由于第一主培养容器2A被布置在第一区域X中，因此它经受预定的培养条件。通过允许在该状态中保持预定时间，第一主培养容器2A中的细胞C通过附着于第一主培养容器2A的底部在培养基中成长。
在预定培养周期过后，操纵控制设备24以打开已关闭第三连接管线27的夹阀51，并且使布置在第一主培养容器2A上方的活塞57下降。因此，第一主培养容器2A中的培养基被排出到第一废培养基容器4A中。在这种情况中，第一主培养容器2A中的所有培养基都可被排出或仅可排出一部分。此时，由于细胞C被保持在附着于第一主培养容器2A的内壁的状态下，它们在没有流入到第一废培养基容器4A中的情况下保留在第一主培养容器2A中。
随后，第三连接管线27的夹阀51被再次关闭，并且已关闭第二连接管线26的夹阀50被操纵并被打开。与此同时，已从上方挤压在第一主培养容器2A上的活塞57升高，并且布置在第一培养基容器3A上方的活塞59下降。因此，第一培养基容器3A中的培养基被供应到第一主培养容器2A，从而进行第一主培养容器2A中的培养基的更换。
在多次周期性地重复该培养基更换步骤之后，第一主培养容器2A中的所有或部分培养基被排出到第一废培养基容器4A中，并且在第三连接管线27的夹阀51被关闭的状态中，已关闭第四连接管线28的夹阀52被打开。与此同时，第一主培养容器2A上方的活塞57升高同时布置在酶容器29上方的活塞60下降。因此，酶容器29中的胰蛋白酶被供应到第一主培养容器2A中，并且通过附着于第一主培养容器2A的内壁的已成长的细胞C与内壁分离。
接下来，在其中与第一主培养容器2A相连接的第一到第四连接管线25到28的夹阀全部关闭的状态中，整个培养容器21与壳体22一起进行离心操作。因此，第一主培养容器2A中的细胞C与培养基和胰蛋白酶相分离。当将培养容器21放置于离心装置中时，通常如此布置培养容器21，即，由于所分离的细胞C收集在第一连接管线25中，因而当从相对于第一主培养容器2A的离心轴线观察时，使得连接第一主培养容器2A与第二主培养容器2B的第一连接管线25沿径向被布置在外部。
在已以这种方式分离之后，通过打开布置在第一连接管线25中的夹阀49并且使布置在第一主培养容器2A上方的活塞57下降，通过第一连接管线25将细胞C输送到第二主培养容器2B中。然后通过打开与第二主培养容器2B相连接的第五连接管线30的夹阀53并且使位于第二培养基容器3B上方的活塞61下降，将培养基供应到第二主培养容器2B中。另外，与此同时或在此之后，通过打开第七连接管线32的夹阀55并且使位于成长促进剂容器33上方的活塞62下降，将地塞米松或其他增长因子供应到第二主培养容器2B中。
由于骨填充材料被密封在第二主培养容器2B中，因此从第一主培养容器2A供应的细胞C、从第二培养基容器3B供应的培养基以及从成长促进剂容器33供应的增长因子在第二主培养容器2B中相混合。由于第二主培养容器2B被布置在保持在预定培养条件下的第一区域X中，因此通过保持该状态而执行二级培养。在二级培养周期期间，通过周期性地控制设置在第五到第七连接管线30到32中的夹阀53到55的打开和关闭，以及布置在第二主培养容器2B、第二培养基容器3B和成长促进剂容器33上方的活塞58到62的升高和下降，多次进行培养基的更换。在预定的二级培养周期过后，通过使用骨填充材料作为架子而使得细胞C成长而在第二主培养容器2B中产生了骨填充体。
然后通过打开设在第六连接管线47中的夹阀54并且通过活塞58挤压第二主培养容器2B而使得第二主培养容器2B内部中的培养基排出到第二废培养基容器4B中。在这种情况中，排出部分培养基即可。然后在这种状态下，通过关闭与第二主培养容器2B相连接的所有连接管线25和30到32的夹阀49和53到55将骨填充体密封在第二主培养容器2B中。在封闭状态下通过使用例如无菌管切割方法切断所有连接管线25和30到32，从而将密封有骨填充体的第二主培养容器2B与其他容器2A、3A、3B、4A、4B、29和33相分离，因此骨填充体可作为成品被独立地运输。
依照以这种方式构成的本实施例中所涉及的培养设备20，在从患者体内收集血液到二级培养完成期间，可在完全与外部相隔离的封闭系统中执行培养。因此，可防止被来自于外部的尘粒等污染。也就是说，通过在运输、处理和培养步骤的各步骤中防止来自于外部的尘粒等污染可将细胞保持在可存活的状态中。
另外，由于通过将培养容器21布置在具有凹槽34到41的壳体22中执行培养，可将培养容器21容易地布置在培养设备20中。因此，甚至一个不熟悉所述设备的操作者也可容易地培养细胞C。而且，通过更换其中密封有所有培养基和其他必需物质的培养容器21，可容易且连续地培养不同的细胞。
在前述实施例中，由于用在初级和二级培养步骤中的培养基被储存在第一和第二废培养基容器4A和4B中，因此通过使用储存在这些容器4A和4B中的培养基可在各阶段进行感染诊察等。在这种情况中，通过无菌管切割方法切割第三和第六连接管线27和31，可将第一和第二废培养基容器4A和4B分别且独立地输送到检查步骤。另外，独立的标本抽取容器(未示出)可与第一和第二主培养容器2A和2B相连接。另外，保留在第一连接管线25中的培养基也可用于检查。
以这种方式，在本实施例中，可通过对第一到第七连接管线25到28和30到32进行无菌管切割而将各容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33分离。可在各容器2A、2B、3A、3B、4A、4B、29和33上粘贴表示所述容器是相互关联的容器的记号、尤其是条形码，以防止由于前述分离导致所培养的细胞C、废弃的培养基等之间的关系变得不清楚。所述条形码可为相同的条形码或相互关联的条形码。
而且，尽管在前述实施例中从开头就已将第二主培养容器2B描述得通过第一连接管线25与第一主培养容器2A相连接，但是第二主培养容器2B也可通过无菌管连接方法与第一主培养容器2A、第二培养基容器3B或第二废培养基容器4B等相连接。当这样做时，可适当地选择使用容纳有对应于所要产生的骨填充体的量和形状的骨填充材料的第二主培养容器2B。除多孔块以外，粒状、胶状或其他任意形状的骨填充材料都可用作密封在内部的骨填充材料。另外，任意的适合生物体的材料都可用作所述材料。
另外，可将一部分或全部第一和第二主培养容器2A和2B构成为透明的，并且在容纳这些主培养容器2A和2B的壳体22的凹槽34和35中可形成观察窗(未示出)。因此，例如在培养周期期间使用倒置显微镜通过观察窗可观察到培养情况。
另外，尽管最终制造的骨填充体被放入到注射枪中以便于注射到患者体内，为了在密封状态下执行该操作，可预先通过连接管线(未示出)将注射枪(未示出)与第二主培养容器2B相连接。另外，随后可通过无菌管连接方法将注射枪与第二主培养容器2B相连接。另外，可使用这样的注射枪，即，在通过无菌管切割方法与其他容器2A、3A、4A和33分离之后能够直接装填第二主培养容器2B，以及可使用这样的结构，即，其中第二主培养容器2B在注射枪中破裂以允许内部的骨填充体被无菌地注射。
另外，多孔骨填充材料可被布置在第二主培养容器2B中的第六连接管线21的入口处。因此，悬浮在排出到第二废培养基容器4B的培养基中的细胞C在与培养基一起被排出时可被多孔骨填充材料俘获。因此，可在不会浪费的情况下回收细胞C。除β-磷酸三钙多孔体之外，还可使用任何适合生物体的材料(诸如磷灰石片)作为多孔骨填充材料。
而且，当通过设在连接管线25到28和30到32中的中间位置处的夹阀49到55而打开第一到第七连接管线25到28和30到32时，可在各连接管线25到28和30到32中的中间位置处设置只允许其中的流体沿预期流动方向流动而不能沿相反方向流动的止回阀(未示出)。
接下来，将参照附图14说明本发明第三实施例中所涉及的培养设备70。而且，相同的附图标记用来表示本实施例中的那些与前述实施例的构成相同的位置，因此将省略对它们的描述。
如图14中所示，本实施例中所涉及的培养设备70是用于执行初级培养步骤的培养设备70，并且具有通过用连接管线5、6和14连接主培养容器2、培养基容器3和废培养基容器4构成的培养容器71、壳体84、布置在壳体84上方的压制设备(未示出)、以及用于控制它们的控制设备。壳体84具有用以容纳容器2到4和13以及连接管线5、6和14的凹槽72到78。
壳体84形成为圆盘形状，并且被构成为能够在未示出的转动驱动机构的操纵下围绕穿过其中心的竖直轴心82水平地转动。
另外，各容器2到4和13在由可改变容积的挠性材料构成的方面都与第二实施例相同，连接管线5、6和14在由能够由于沿径向被夹紧而关闭内部流径的挠性材料构成的方面都与第二实施例相同，并且打开和关闭连接管线5、6和14的夹阀79到81在被设置于壳体84中的方面都与第二实施例相同。另外，以与第二实施例相同，通过适合的加热装置和冷却装置，第一区域X被保持在37±0.5℃的温度，并且第二区域Y被保持在4℃的温度。
在本实施例所涉及的培养设备70中，容纳各容器2到4和13的凹槽72到78，尤其是容纳用于培养细胞C的主培养容器2的凹槽72布置在远离转动轴心82的位置处。因此，当使得壳体84围绕转动轴心82转动时，离心力朝向外部沿径向作用在容纳于凹槽72中的主培养容器2内部的流体上。而且，容纳其他容器3、4和13的凹槽73到75也被布置在远离转动轴心82几乎与容纳主培养容器2的凹槽72相同距离的位置处。
另外，本实施例中所涉及的培养设备70的培养容器71具有与主培养容器2相连接的封闭型连接管线17。该封闭型连接管线17是用氯乙烯制成的，并且其端部被封闭以便于防止内部的流体泄漏。如图中所示，当从壳体84的转动轴心82处观察时，该封闭型连接管线17沿主培养容器2的径向被布置于外部。
另外，前述压制设备被安置于例如图14中的虚线所指示的位置处，并且具有上下移动的单独活塞83。由于壳体84围绕转动轴心82转动，因此活塞83可分别压制在主培养容器2、培养基容器3以及废培养基容器4上。
下面说明以这种方式构成的本实施例中所涉及的培养设备70的作用。
在从患者体内收集的细胞C被放在主培养容器2中的状态下，控制设备动作以驱动所述转动驱动机构并且将培养基容器3布置在活塞83的下面。然后通过打开关闭主培养容器2与培养基容器3之间的第一连接管线5的夹阀79，并且降低活塞83，培养基容器3内部的培养基通过第一连接管线5流入到主培养容器2中。然后当预定量的培养基已流入到主培养容器2中时停止活塞83的下降并且再次关闭夹阀79。因此，由于细胞C被混合在培养基中，因此通过使其保持在该状态下而开始细胞C的初级培养。
接下来，使壳体84转动以便于在预定时间过后在适合的培养基更换时将主培养容器2布置在活塞83下面。然后通过打开关闭主培养容器2与废培养基容器4之间的第二连接管线6的夹阀80并且降低活塞83将主培养容器2中的培养基排出到废培养基容器4中。此时，由于细胞C附着于主培养容器2的底部，因此细胞保留在主培养容器2中而不会被排出到废培养基容器4中。
然后通过再次转动壳体84以将培养基容器3布置在活塞83下面并且控制活塞83和夹阀79而将培养基容器3中的培养基供应到主培养容器2中。借此，更换培养基。
在完成了其中细胞在以预定更换间隔多次更换培养基的同时被培养的初级培养步骤之后，壳体84转动以将主培养容器2布置在活塞83下面。然后通过控制活塞83和夹阀80而将培养基从主培养容器2中排出到废培养基容器4中。随后，通过再次转动壳体84以将酶容器13布置在活塞83下面，并且控制活塞83和夹阀81，将胰蛋白酶从酶容器13中供应到主培养容器2中。所述胰蛋白酶作用在主培养容器2中的细胞C上，使得附着于内壁的细胞C被分离下来。
然后在该状态下，通过关闭所有夹阀79到81并且操纵转动驱动机构使得壳体84以高速转动。因此，通过离心分离作用将悬浮在主培养容器2中的胰蛋白酶中的细胞C沿径向从胰蛋白酶中收集到外部。由于封闭型连接管线17沿主培养容器2的径向被布置于外部，所分离的细胞C被收集在封闭型连接管线17中。
之后使壳体84停止在使主培养容器2位于活塞83下面的位置处，并且例如通过无菌管连接方法将其中密封有骨填充材料的第二主培养容器(未示出)连接于封闭型连接管线17，然后通过降低活塞83，被收集在封闭型连接管线17中的细胞C可被有效地输送到所述第二主培养容器中。
以这种方式，依照本实施例中所涉及的培养设备70，可通过使壳体84转动而减少压制装置的活塞83的数量从而简化结构。另外，由于主培养容器2被布置在远离壳体84的转动轴心82的位置处，并且封闭型连接管线17沿容纳于壳体84的凹槽72中的主培养容器2的径向被设于外部，因此离心分离出的细胞C被收集在封闭型连接管线17中，从而允许培养继续有效地进行到随后的二级培养步骤。
而且，壳体和容器的形状不局限于前述各实施例中所示出的那些。另外，尽管所述描述使用每种容器只提供一个作为示例，但是也可提供例如多个培养基容器和废培养基容器。
另外，尽管前述各实施例的描述都描述了一种通过用活塞挤压各容器的培养基等的排出侧来输送培养基等的方法，如图15中所示，也可使用其中各容器2和4都布置在相对于外部密封的容纳室90和91中的方法，并且通过减小所述容纳室90和91中的压力将培养基等吸出，在所述容纳室中所述容器容纳在接收培养基等侧。
更具体地说，如图15中所示，为了将培养基供应到主培养容器2中，除通过操纵控制设备24打开已关闭第一连接管线26的夹阀50之外，通过操纵第一真空泵92而降低主培养容器2布置于其中的容纳室90中的压力。由于其中容纳有培养基容器3的容纳室93构成为通过连通孔94而朝向大气开放，因此培养基容器3自由收缩而导致培养基被吸入到主培养容器2中。
另外，在预定培养周期过后，除通过操纵控制设备24来操作已关闭第二连接管线27的夹阀57打开第二连接管线27之外，容纳主培养容器2的容纳室90内部中的压力朝向大气开放。然后通过操纵第二真空泵95而降低其中容纳有废培养基容器4的容纳室中的压力。因此，主培养容器2中的培养基朝向废培养基容器4被吸出。
接下来，将参照
本发明第四实施例中所涉及的培养设备的描述。
本实施例中所涉及的培养设备101用在前述培养过程中，并且尤其用在初级培养步骤中。
如图16和17中所示，本实施例中所涉及的培养设备101是由培养容器102和所述培养容器102附于其外圆周表面上的转动鼓(高度差调节装置)103构成的。如图18中所示，培养容器102由一个主培养容器104、一个培养基容器105、一个废培养基容器106、连接主培养容器104和培养基容器105的第一连接管线107、以及连接主培养容器104和废培养基容器106的第二连接管线108构成。
主培养容器104、培养基容器105和废培养基容器106分别由诸如硬质聚苯乙烯等材料构成。另外，第一连接管线107和如第二连接管线108由诸如氯乙烯等的挠性管构成。因此，在可通过弯曲各连接管线107和108而将各容器104、105和106布置在任意位置的同时，通过沿连接管线107和108的长度方向用沿径向夹紧的夹子或夹阀夹紧中间位置可限制内部流体的流动。而且，在安装到转动鼓103之前，第一和第二连接管线107和108通过例如可移除的夹子(未示出)而被封闭，以便于限制流体的流动。
另外，培养基容器105在主培养容器104侧和主培养容器104在废培养基容器106侧分别具有倾斜表面105a和104a以便于培养基容器105中的流体流动到主培养容器104中以及主培养容器104中的流体流动到废培养基容器106中。在图18中，附图标记109表示用于将各容器104、105和106安装于转动鼓103上的安装孔。
另外，用最小必须培养基(MEM)、牛胎儿血清(FBS)以及抗生素以诸如84∶15∶1的指定混合比制备的培养基被密封在前述主培养容器104和培养基容器105的内部。也用人体血清来代替FBS。任意抗生素都可用作所述抗生素，例如包括青霉素类、头孢类、大环内酯类、四环素类、磷霉素类、氨基糖苷类、以及新喹诺酮类的抗生素。
浓度为5％无菌状态的气体(诸如CO2气)被密封在前述废培养基容器106中。
前述主培养容器104具有注射口110，所述注射口110可被注射针刺入并且在移除注射针之后可由于弹性而关闭。因此，可通过用用于收集骨髓液的注射器的注射针刺入注射口110而将诸如骨髓液的体液注入到主培养容器104中，并且可通过从注射口110处撤回注射针而使得主培养容器104的内部与外部相隔离。
前述转动鼓103具有以水平转动轴线为中心的圆柱面，并且与诸如马达(未示出)的转动驱动源相连接。另外，用于安装前述各容器104、105和106的容器安装托架111、112和113被设在用作转动鼓103的外圆周表面的圆柱面的外表面上。主培养容器104的容器安装托架111被布置在培养基容器105的容器安装托架112和废培养基容器106的容器安装托架113之间，并且它们分别沿转动鼓103的圆周方向相隔一定距离布置。例如，在图16和17中所示的示例中，安装托架沿转动鼓103的圆周方向以90°的间隔布置。
例如使用螺栓114将各容器104、105和106安装在转动鼓103上。除螺栓114以外还可使用指旋螺丝、带状件、钩或其他任意固定装置。
另外，当各容器104、105和106已被安装于各容器安装托架111、112和113时，在连接管线路径中设置夹阀115和116，所述夹阀115和116沿径向在长度方向上的中间位置处夹紧各连接管线107和108，在所述连接管线路径中连接管线107和108布置在容器104、105和106之间。夹阀115和116设有从转动鼓103的内部朝向圆柱面的外侧沿径向延伸到外侧的两个销115a和116a，并且通过将连接管线107和108插入到这些销115a和116a之间而简单地转换销115a和116a的距离可打开和关闭连接管线107和108。通过未示出的控制器控制各夹阀115和116的打开和关闭。
下面说明以这种方式构成的本实施例中所涉及的培养设备101的作用。
为了使用本实施例中所涉及的培养设备101培养细胞，如前面所述，首先通过用用于收集骨髓液的注射器的注射针刺入注射口110而将骨髓液注射到主培养容器104中。
然后使得转动鼓103转动预定角度，并且将转动鼓103锁定在使主培养容器104水平位于最高位置处的位置处。在该状态中，通过使得主培养容器104经受诸如37±0.5℃的温度、100％的湿度以及5％的CO2浓度的预定培养条件而进行培养。可通过将CO2溶解在培养基中或用可渗透CO2的过滤器构成全部或部分主培养容器104来实现CO2培养条件。
随后，当到达了预定培养基更换时间时，如图19中所示，使得转动鼓103转动预定角度以将主培养容器104定位于高于培养基容器106的位置处。在本实施例的情况中，由于在培养期间主培养容器104被布置在最高位置处，因此不必使转动鼓103转动。然而，为了更平稳地将主培养容器104中的培养基输送到废培养基容器106中，例如如图19中所示，优选将主培养容器104沿对角线布置在上方同时优选将废培养基容器106沿对角线布置在下方。
在该状态中，已关闭第二连接管线108的夹阀116被打开。因此，不再需要的培养基借助于其自身重量从主培养容器104通过第二连接管线108被排出到废培养基容器106中。当主培养容器104中的预定量培养基已被排出之时，操纵夹阀116再次关闭第二连接管线108。
接下来，如图20中所示，使转动鼓103转动预定角度以使主培养容器104布置在比培养基容器105低的位置处。也就是说，将主培养容器104沿对角线布置在下方而将培养基容器105沿对角线布置在上方。然后打开已关闭第一连接管线117的夹阀115。因此，新鲜的培养基从培养基容器105中通过第一连接管线117被供应到主培养容器104中。因此，由于完成了培养基更换步骤，使转动鼓103转动预定角度以使主培养容器104返回到最高位置处并且继续进行培养。
由于在多次重复该培养基更换步骤的同时继续进行培养，因此间叶干细胞在主培养容器104的底部上充分地成长。可通过加热密封而后切割与主培养容器104相连接的所有连接管线107和108而独立地输送容纳已成长的间叶干细胞的主培养容器104。
以这种方式，依照本实施例中所涉及的培养设备101，培养所需的培养基等可预先被密封，并且在整个初级培养步骤的培养周期中主培养容器102的内部可在密封状态下与外部相隔离。因此，可防止来自外部的尘粒等的污染。另外，甚至对于更换培养基飞沫易于飞散的培养基时，通过简单地转动所述转动鼓103并将各容器104、105和106布置在预定位置处，使培养基在处于密封在各容器104、105和106和连接管线107和108内的状态下，在重力作用下在容器104、105和106之间输送。因此，可消除被来自外部的其他细菌污染的影响。
而且，尽管本实施例中所涉及的培养容器102已被描述为可适用于初级培养步骤，在该步骤中间叶干细胞在以预定次数多次更换培养基的同时成长，但是培养容器102也可如此构成而适用于二级培养步骤，即，通过将骨填充材料(诸如β-磷酸三钙多孔体)密封在主培养容器104中并且放入在初级培养步骤中培养的间叶干细胞。
另外，血液收集管线(未示出)可与主培养容器104相连接，并且从患者体内收集的骨髓液可通过所述血液收集管线被直接加入到主培养容器104中。
另外，尽管是通过设在转动鼓103中的夹阀115和116打开和关闭连接管线107和108的，但是除这些夹阀之外，也可在连接管线107和108中直接设置打开和关闭阀。
另外，前述实施例中所涉及的培养设备101，以尽管已使用其中主培养容器104、培养基容器105以及废培养基容器106通过连接管线107和108相互连接的培养容器102为例进行了说明，但是如图21中所示，各培养容器104、105和106以及连接管线107和108都可被整体安装于可弯曲的柔软板材117上。在板材117中甚至配有用于安装于转动鼓103的螺栓安装孔118和用于允许夹阀115和116的销从中穿过的通孔119。
由于以这种方式构成，当将培养容器102安装于转动鼓103时，将各容器104、105和106以及连接管线107和108组合成一个单元的板材117被弯曲成如图22中所示的圆柱形状并且安装于转动鼓103的外表面。因此，可消除对各容器104、105和106以及连接管线107和108定位的需要，从而便于安装操作。
接下来，将参照附图23说明本发明第五实施例中所涉及的培养设备。
而且，在本实施例中所涉及的培养设备120的描述中，用相同的附图标记表示本实施例中的那些与前述第四实施例的培养设备101的构成相同的位置，因此将省略对它们的描述。
如图23中所示，本实施例中所涉及的培养设备120的培养容器121与前述第四实施例中的培养容器102的不同之处在于，它具有通过第三连接管线123与主培养容器122相连接的酶容器124，并且不同之处还在于，为主培养容器122提供细胞回收管线125。
诸如胰蛋白酶的蛋白分解酶被密封在酶容器124中，并且第三连接管线123由可移除的夹子封闭。酶容器124被安装在转动鼓126上沿长度方向成一排布置在例如沿圆周方向与培养基容器105相同位置处。
用于安装酶容器124的容器安装托架127设置在转动鼓126上，同时，当酶容器124已被安装时，设置通过沿径向夹紧而封闭第三连接管线123的夹阀128。
当主培养容器122被安装于转动鼓126上时，前述细胞回收管线125被设在沿径向布置于外侧的表面的中心处。另外，如图24中所示，细胞回收管线125被设在其上的主培养容器122的表面形成为从圆周朝向中心的细胞回收管线125逐渐变窄的漏斗形状。细胞回收管线125是以与连接管线107、108和123相同的氯乙烯或其他挠性管构成的并且为其端部被封闭的封闭管形式。
下面说明以这种方式构成的本实施例中所涉及的培养设备120的作用。
该作用在周期性地更换培养基的同时培养细胞以前都是与第四实施例中所涉及的培养设备101是相同的。
依照的本实施例中所涉及的培养设备120，在间叶干细胞已在主培养容器122中以附着状态成长之后，通过使转动鼓126转动预定角度，将主培养容器122沿对角线布置在上方而废培养基容器106沿对角线布置在下方。之后操纵已关闭第二连接管线108的夹阀116以打开第二连接管线108，利用重力，将所定量的主培养容器122中的培养基用下排出到废培养基容器106中。
随后，通过使转动鼓126再次转动预定角度，将酶容器124布置在高于主培养容器122的位置处。之后通过操纵已关闭第三连接管线123的夹阀128来打开第三连接管线123，储存在酶容器124中的胰蛋白酶在重力作用下经由第三连接管线123被供应到主培养容器122中。
之后在通过操纵夹阀128再次关闭第三连接管线123的状态中通过允许保持预定量时间或通过摇动转动鼓126向主培养容器122施加振动，将已附着于主培养容器122中底部的间叶干细胞分离下来。因此，在已切断细胞之间的附着的状态下，所分离的间叶干细胞混合在由胰蛋白酶和培养基构成的流体中。
随后，通过沿一个方向连续地使转动鼓126转动而使得主培养容器122中包含间叶干细胞和胰蛋白酶的培养基经受离心作用。由于间叶干细胞具有比胰蛋白酶和其他物质更大的比重，因此在离心作用下细胞沿径向被旋转到外侧。
依照本实施例中涉及的培养设备120，由于主培养容器122形成为漏斗形状，因此已沿径向被旋转到外侧的间叶干细胞通过漏斗形状的容器壁聚集在中心处。由于细胞回收管线125设置在中心处，因此聚集的间叶干细胞在细胞回收管线125中被回收。
另外，由于该细胞回收管线125是由可通过加热而被密封或熔合的氯乙烯构成的，可在用无菌管切割方法切割细胞回收管线125的同时封闭切割的端部125a。也就是说，如图8A中所示，可通过使用沿图8A中所示的剪切方向移动的加热板129、如图8B中所示的在熔化的同时进行切割、以及如图8C中所示的在将连接管的内部保持在无菌且密封的状态下封闭切割端部而封闭切割的端部125a。
另外，也可如图9A到9C中所示的那样执行无菌管连接。也就是说，可通过如图9A中所示的同时切割平行布置的细胞回收管线125和另一个连接管线130之后，如图9B中所示的移动管线以使得细胞回收管线125与该另一个连接管线130对齐，然后如图9C中所示的移除加热板129，而将细胞回收管线125与该另一个连接管线130相连接。尽管接合部分17b在连接过程中被封闭，但在通过外力连接管线壁时内部流径也可为连续的。也就是说，细胞回收管线125与另一个连接管线130可在内部保持在无菌状态下直接连接在一起。
也就是说，通过借助于无菌管连接将其中已回收有间叶干细胞的细胞回收管线125与连接到其中密封有人体组织填充材料的另一个主培养容器(未示出)的连接管线130相连接，可在二级培养步骤中在无菌状态下继续进行回收的间叶干细胞的培养。
而且，由于间叶干细胞存在于细胞回收管线125的内部，有可能存在间叶干细胞被加热板129破坏的风险，如图10中所示，因此可在细胞回收管线125的端部形成用于切割的备用空间131。也就是说，通过沿穿过备用空间131的剖面线A切割，可防止加热板129与细胞回收管线125中的间叶干细胞直接接触，从而可在保持间叶干细胞的存活力的同时进行无菌管连接。
而且，尽管在本实施例中设置酶容器124并且通过胰蛋白酶来分离间叶干细胞，但是也可在主培养容器122的内壁上进行温度响应处理来代替胰蛋白酶的使用，该温度响应处理以预定温度为临界温度来进行亲水与疏水特性之间的转换。该温度响应处理转换与以前所述的相同。
下面，将参照
本发明第六实施例中所涉及的培养设备140。
如图25和26中所示，本实施例中所涉及的培养设备140具有主培养容器141、具有借助于连接管线142和143连接于所述主培养容器141的培养基容器144和废培养基容器145的培养容器146、以及安装框架(高度差调节装置)147，所述培养容器146安装在安装框架147上并且安装框架147改变其倾斜角。
前述主培养容器141形成为扁平的薄盒形状，具有较大的底表面面积。前述培养基容器144和废培养基容器145形成为比主培养容器141更高的盒状，同时也具有为主培养容器141的内部容积的若干倍的内部容积。该培养基容器144和废培养基容器145被设置在主培养容器141的同一侧上。
另外，与前述相似的培养基被密封在主培养容器141和培养基容器144中，而废培养基容器145的内部是空的。
前述安装框架147具有用以固定培养容器146的托盘部分148，以及用于使所述托盘部分148围绕水平轴线摇动的振动装置149。与第四实施例相似，在托盘部分148中设置与第四实施例相同的夹阀150和151，所述夹阀能够通过沿径向夹紧各连接管线142和143长度方向上的中间位置而打开和关闭连接管线142和143。振动装置149具有基底152和使所述托盘部分148相对于基底152摇动的马达153。
下面说明以这种方式构成的本实施例中所涉及的培养设备140的作用。
为了使用本实施例中所涉及的培养设备140来培养细胞，首先将骨髓细胞供应到主培养容器141中，使托盘部分148水平，并且在保持主培养容器141的底部水平的同时在与前述实施例中所指明的条件相似的预定培养条件下培养细胞。
当到达了预定的培养基更换时间时，通过操纵安装框架147的马达153并使托盘部分148相对于基底152摇动，如图27中所示，将主培养容器141布置在高于废培养基容器145的位置处。
在该状态下，设在托盘部分148中的夹阀150和151中的已关闭用以连接主培养容器141和废培养基容器145的连接管线143的夹阀151被打开。因此，将被排出到主培养容器141中的培养基在重力作用下被排出到废培养基容器145中。由于附着性间叶干细胞在主培养容器141内保持附着于底表面，因此通过操纵前述夹阀151再次关闭连接管线143。
随后，操纵安装框架147的马达153，如图28中所示，以将培养基容器144布置在高于主培养容器141的位置处。已关闭用以连接主培养容器141和培养基容器144的连接管线142的夹阀150被打开。因此，密封于培养基容器144中的新鲜培养基在重力作用下被供应到主培养容器141中。因此，由于主培养容器141中的培养基被新鲜培养基更换，因此通过再次关闭夹阀150而完成培养基更换。
由于在多次重复该培养基更换步骤的同时连续进行培养，因此在主培养容器141的底表面上间叶干细胞成长到所需的数量。在完成了培养之后，主培养容器141可在通过无菌管切割方法切割连接管线142和143而将间叶干细胞密封在其中的状态下被独立地输送。
以这种方式，依照本发明中所涉及的培养设备140，通过简单地摇动托盘部分148来更换主培养容器141中的培养基，细胞可在无菌状态下成长到所需数量。另外，由于在相对于外部密封的同时在培养容器146中培养细胞，因此可防止来自外部的其他细菌等污染。而且，由于使用包括简单地摇动托盘部分148的简单结构，可降低成本并且简化操作。
另外，由于主培养容器141形成为薄盒形状以获得最小所需的培养基深度，因此可减少所使用的培养基量。
另外，由于各容器141、144和145以及连接管线142和143都被安装在扁平托盘部分148中，因此它们的安装操作变得容易。
而且，在本实施例中，尽管培养基容器144和废培养基容器145被连接于主培养容器141的相同侧上，但是也可将它们连接在不同侧或连接在顶部和底部上。在这种情况中，需要提供用于使托盘部分148摇动的机构，从而在主培养容器141和安装于其上的培养基容器144或废培养基容器145之间形成高度差。另外，酶容器或其他容器也可与主培养容器141相连接。
另外，可通过提供用以使托盘部分148关于其法线转动的转动机构而在主培养容器141中离心分离出培养的间叶干细胞。而且，在主培养容器141的一侧上可设置用于回收离心分离出的间叶干细胞或将它们输送到另一个培养容器中的封闭型连接管线。
另外，由于通过对连接管线142和143进行无菌管切割可将各容器141、144和145分开，因此可在各容器141、144和145上粘贴用以表示所述容器是相互关联的容器的记号、尤其是条形码以防止由于前述分离而导致所培养的间叶干细胞、废弃的培养基等之间的关系变得不清楚。所述条形码可为相同的条形码或相互关联的条形码。
另外，主培养容器141的一部分或全部可构成为透明的，并且在其中安装有主培养容器141的托盘部分148中可形成观察窗(未示出)。因此，例如在培养周期期间使用倒置显微镜通过观察窗就可观察培养情况。
而且，在前述第四到第六实施例中，转动鼓103和126、安装框架147和容器104、105、106、122、124、141、144和145的形状不局限于前述各实施例中所描述的那些。另外，尽管在前面的描述中以各容器104、105、106、122、124、141、144和145均使用一个作为示例，但是例如也可设置多个培养基容器105和144或废培养基容器106和145。另外，除这些容器104、105、106、122、124、141、144和145之外，在例如二级培养步骤的情况中，可事先连接或可通过无菌管连接来连接其中密封有不同感生因子(诸如地塞米松)的容器。
而且，尽管以使用间叶干细胞作为培养细胞为例描述了前述各实施例，但是本发明也可适用于培养其他细胞的情况，例如包括ES细胞、体壁干细胞、骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。
另外，除骨髓液之外，末梢血液或脐带血也可用作供应到主培养容器中的体液。另外，可以是只有通过离心作用收集的骨髓液而获得的骨髓细胞被供应到主培养容器中。
另外，尽管以由β-磷酸三钙形成的骨填充材料作为人体组织填充材料为例进行了说明，但是也可使用诸如陶瓷、胶原蛋白或聚乳酸的任何适合生物体的材料。
工业实用性依照本发明中所涉及的培养容器和培养设备，在相对于外部封闭的培养容器中在多次更换培养基的同时培养细胞。因此，在所培养的细胞不会被来自于外部的尘粒等污染的情况下，细胞可在可存活的状态下被培养。
另外，由于细胞被密封在容器中，因此即使以接近的方式同时培养多种类型的细胞也不存在混合的风险，从而提高了培养效率。
权利要求
1.一种培养容器，包括具有一个其中密封有培养基的主培养容器的至少一个培养基容器，以及至少一个能够容纳培养容器中的流体的废培养基容器；通过能够限制所述容器之间流体的流动的连接管线使所述培养基容器和培养容器相对于外部密封。
2.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，所述连接管线设有阀，并且通过所述阀允许或限制连接管线内的流体流动。
3.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，所述连接管线由挠性材料制成并且通过夹紧所述连接管线来限制其中的流体流动。
4.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，血液收集管线与所述主培养容器相连接。
5.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，通过连接管线将密封有蛋白分解酶的至少一个酶容器连接于主培养容器，所述连接管线能够在相对于外部密封的状态下限制所述容器之间的流体流动。
6.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，在所述主培养容器中密封有人体组织填充材料。
7.根据权利要求6中所述的培养容器，其特征在于，至少一种类型的成长促进剂容器通过连接管线与主培养容器相连接，所述成长促进剂容器中密封有包含增长因子的成长促进剂，所述连接管线能在相对于外部密封的状态下限制所述容器之间的流体流动。
8.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，所述连接管线是用可通过加热而被密封或熔合的材料制成的。
9.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，所述主培养容器具有封闭型连接管线，其端部是封闭的，并且该封闭型连接管线是用可通过加热而被密封或熔合的材料制成的。
10.根据权利要求1中所述的培养容器，其特征在于，所述主培养容器、所述培养基容器以及所述废培养基容器的内部容积可变。
11.根据权利要求10中所述的培养容器，其特征在于，内部容积可变并且其中密封有蛋白分解酶的至少一个酶容器通过连接管线与主培养容器相连接，所述连接管线在相对于外部密封的状态下能够限制所述容器之间的流体流动。
12.根据权利要求10中所述的培养容器，其特征在于，人体组织填充材料被密封在主培养容器中，并且其中密封有包含增长因子的成长促进剂且内部容积可变的至少一个成长促进剂容器通过连接管线与主培养容器相连接，该连接管线在相对于外部密封的状态下能够限制所述容器之间的流体流动。
13.一种培养设备，所述培养设备包括根据权利要求1到12中任意一项所述的培养容器，以及用于允许构成培养容器的容器中的流体流入到设在所述容器中的连接管线中的装置。
14.根据权利要求13中所述的培养设备，其特征在于，构成培养容器的各容器的内部容积可变，并且培养设备设有具有用于容纳构成培养容器的各容器的凹槽的壳体，以及用于通过施加外部压力而使容纳在凹槽中的各容器收缩的压制装置。
15.根据权利要求14中所述的培养设备，其特征在于，所述连接管线是由挠性材料制成的，通过夹紧所述管线而限制连接管线内的流体流动，在壳体中设置培养容器的连接管线从中穿过的连接管线通道，并且设置有阀装置，该装置通过沿径向夹紧设置在连接管线通道中的连接管线而限制流体通过连接管线的流动。
16.根据权利要求14中所述的培养设备，其特征在于，配有离心装置，所述离心装置使所述壳体与内部的培养容器一起转动，并且容纳主培养容器的凹槽以与转动轴线相间隔的方式被布置。
17.根据权利要求14中所述的培养设备，其特征在于，具有封闭端部的封闭型连接管线被设置在主培养容器上，所述封闭型连接管线是用可通过加热而被密封或熔合的材料制成的，所述壳体设有使壳体与内部的培养容器一起转动的离心装置，并且在主培养容器容纳在所述壳体的凹槽中的状态下，所述封闭型连接管线沿以转动轴心为中心的主反应容器的径向向外设置。
全文摘要
通过一种简单的结构可减少在各处理步骤中被尘粒、细菌等的污染。使用培养容器(1)，其中密封有培养基的培养基容器(3)和能够容纳主培养容器(2)中的流体的废培养基容器(4)通过连接管线(5)和(6)与主培养容器(2)在相对于外部密封的状态下相连接，所述连接管线能够限制所述容器之间的流体流动。培养设备被如此构成，其中各容器(2、3、4)的内部容积都是可变的，并且所述培养设备设有具有用于容纳各容器(2、3、4)的凹槽的壳体，以及通过施加外部压力使容纳在凹槽中的容器收缩的压制装置。
文档编号C12M3/00GK1649995SQ03810130
公开日2005年8月3日 申请日期2003年8月15日 优先权日2002年8月19日
发明者矢内毅, 高宫裕儿, 日比野浩树 申请人:奥林巴斯株式会社