用于提高泛酸产量的微生物和方法

专利名称：用于提高泛酸产量的微生物和方法
相关申请本申请要求递交于2002年7月3日、名称为“用于提高泛酸产量的微生物和方法”的美国临时专利申请号No.60/393,826的优先权。本申请与名称为“用于提高泛酸产量的微生物和方法”、递交于2002年1月18日(未决)的国际专利申请号No.PCT/US02/00925有关，该国际专利申请依次又要求名称为“用于提高泛酸产量的微生物和方法”、递交于2002年1月11日(未决)的在先临时专利申请系列号No.60/347,638、递交于2001年1月19日(届满)的在先临时专利申请系列号No.60/263,053以及递交于2001年1月19日(届满)的在先临时专利申请系列号No.60/262,995的权益。本发明也与递交于2000年9月21日(未决)的美国专利申请系列号No.09/667,569有关，该申请部分为递交于1999年9月21日(放弃的)的美国专利申请系列号No.09/400,494的延续。美国专利申请系列号No.09/667,569也要求递交于2000年6月7日(届满)的临时专利申请系列号No.60/210,072、递交于2000年7月28日(届满)的临时专利申请系列号No.60/221,836、以及递交于2000年8月24日(届满)的临时专利申请系列号No.60/227,860的权益。特此将上文提及的每一个申请的全部内容并入作为参考。
背景技术：
泛酸，也称之为遍多酸或维生素B5，为维生素B复合物成员，并且是哺乳动物，包括家畜和人类的必需营养物(如来自食物来源，作为水溶性维生素补充物或作为饲料添加剂)。在细胞中，泛酸主要地用于辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的生物合成。这些辅酶在酰基部分的代谢中发挥作用，其中酰基与这些分子的4’-磷酸泛酰巯基乙胺部分的巯基形成硫酯。这些辅酶在所有细胞中都是必不可少的，参与100多种不同的细胞代谢中间反应。
合成泛酸(尤其是生物活性D异构体)的常规方法是从大量的化学制品进行化学合成，该方法受过高底物耗费以及外消旋中间体旋光拆分需求的阻碍。因此，研究者们近来在寻找能产生在泛酸生物合成过程中有用的酶的细菌或微生物系统(因为细菌本身能够合成泛酸)。尤其是，生物转化方法已经被评价为泛酸优选异构体的有利制备方法。而且，直接微生物合成方法近来经检验是利于D-泛酸制备的方法。
然而，仍然显著需要改善的泛酸生产方法，尤其是，有必要优化微生物方法以制备更高产量的期望产物。
发明概述本发明涉及用于生产泛酸的改进方法(如微生物合成)。泛酸生产方法已在相关申请中描述，其公开了例如经改造能过表达泛酸生物合成途径和异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的关键酶(如参见

图1)的微生物。改造后这些菌株在标准发酵过程中能够产生＞50g/L的泛酸(如参见国际出版物No.WO 01/21772和美国专利申请No.60/262,995)。特别是，增加panB、panC、panD和panE1基因以及ilvBNC和ilvD基因表达可以导致菌株将葡萄糖(丙酮酸)转化成具有商业吸引力的量的泛酸。
为提高例如泛酸的生产水平，已经在以上所描述方法基础上发展了各种改进措施。例如，美国专利申请系列No.09/667,569中描述了具有修饰的(例如，活性缺失或降低)泛酸激酶的生产菌株。在这些菌株中，通过减少泛酸在辅酶A(“CoA”)合成中的应用而有效提高了泛酸水平。美国专利申请系列No.60/262,995进一步描述了改进的泛酸生产菌株，所述菌株经过改造可使各种泛酸生物合成酶和/或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶和/或它们各自的底物最少地被应用于鉴定为[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的旁路产物的生产。
本发明详述了通过调整生物合成途径进一步提高泛酸产量的方法，所述生物合成途径提供用于泛酸生物合成途径的底物，即亚甲基四氢叶酸(“MTF”)生物合成途径。特别是，已经发现通过修饰MTF生物合成途径提高MTF的水平可导致泛酸生物合成途径关键中间体(酮泛解酸)水平的提高。酮泛解酸水平的提高又可以在适宜的工程化菌株中导致泛酸生产水平的显著提高。实质上，本发明人已经鉴定出在过表达如panB、panC、panD、panE1、ilvBNC和ilvD基因的工程化菌株中类泛酸化合物(panto-compounds)(如泛酸)生产的限制步骤，并在此描述了通过修饰MTF生物合成途径用于克服此限制的方法。
本文至少描述了三种有效的改变MTF生物合成途径的方法。一方面，已经证实，增加产生泛酸的微生物的培养基中的丝氨酸水平可以导致类泛酸化合物产量的提高。也已证实，增加3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA基因产物)的合成或活性或增加丝氨酸羟甲基转移酶(glyA基因产物)的合成或活性，由此促进在适宜的工程化微生物中丝氨酸和亚甲基四氢叶酸的生物合成，可以增加类泛酸化合物的生产。提高3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA基因产物)的合成可以例如，通过利用适当工程化的表达盒过表达serA来实现。提高丝氨酸羟甲基转移酶(glyA基因产物)的合成可以例如通过利用适当工程化的表达盒过表达glyA来实现。备选地，丝氨酸羟甲基转移酶(glyA基因产物)的水平可以通过改变对glyA基因的调控来提高。例如，glyA表达的负调控因子(即，阻遏物)的编码基因purR，其突变或缺失可有效提高glyA的表达。适用于提高类泛酸化合物生产微生物中的MTF水平的其它方法包括对负责将甘氨酸转化为MTF的酶(如甘氨酸裂解酶)进行去调节处理。
因此，在一方面，本发明涉及用于提高泛解酸和泛酸产量的方法，该方法包括在使泛酸产量得以提高的条件下培养具有修饰的泛酸生物合成酶活性以及具有修饰的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成酶活性的微生物。在另一方面，本发明涉及用于提高泛解酸和泛酸产量的方法，该方法包括在使泛酸产量得以提高的条件下培养具有修饰的泛酸生物合成酶活性、具有修饰的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶、以及具有修饰的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成酶活性的微生物。特别是，本发明描述了通过提高关键中间体酮泛解酸的水平(通过对其生物合成起作用的酶来提高)增加所需产物(如泛解酸和/或泛酸)产量的方法。优选的方法导致培养微生物36小时后泛酸的生产水平高于50、60、70g/L或更多，或培养微生物36小时后至少生成60、70、80、90、100、110、120g/L或更多的泛酸。本发明也描述了重组微生物和其培养条件。还描述了该微生物产生的组合物。
本发明的其他特点和优势将在以下详细的描述和权利要求中彰显。
附图简述图1为泛酸和异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的示意图。泛酸生物合成酶以粗体标出，其相应基因以斜体显示。异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶以粗斜体标出，其相应的基因以斜体显示。
图2为大肠杆菌中(及推测地枯草芽孢杆菌中)的亚甲基四氢叶酸(“MTF”)生物合成途径的示意图。
图3为构建质粒pAN665的示意图。
图4为构建质粒pAN670的示意图。
图5为质粒pAN004的示意图。
图6为质粒pAN396的示意图。
图7为质粒pAN393的示意图。
图8为枯草芽孢杆菌purR基因的克隆pAN835F的结构示意图。
图9为被设计以安装断裂的枯草芽孢杆菌purR基因的质粒pAN838F的结构示意图。
图10为被设计以缺失部分serA基因、用于卡那霉素抗性选择的质粒pAN821的结构示意图。
图11为被设计在serA基因座整合不可扩增的P26serA盒、用于Ser+选择的质粒pAN824的结构示意图。
图12为被设计在serA基因座整合并扩增P26serA表达盒的中等拷贝质粒pAN395的结构示意图。
发明详述本发明涉及用于产生类泛酸化合物(如酮泛解酸、泛解酸和/或泛酸)的改进的方法和应用于该改进方法中的工程化菌株。能够产生＞50g/L泛酸的菌株可按照国际专利申请系列No.WO 01/21772和美国专利申请系列No.60/262,995中的教导进行构建。通过增加panB、panC、panD和panE1基因的表达以及通过增加ilvBNC和ilvD基因的表达，可设计出能将葡萄糖(丙酮酸)转化成具有商业吸引力的量的泛酸的菌株(如，芽孢杆菌属菌株)。
但是，目前已经发现在表达高水平panB基因产物-酮泛解酸羟甲基转移酶的工程化菌株(如在美国专利申请系列No.09/667,569中描述的PA824和在美国专利申请系列No.60/262,995中描述的PA668-24)中，进一步提高泛酸产量的限制步骤仍是α-酮异戊酸(α-KIV)向酮泛解酸的转化。增加α-KIV合成的方法已在国际专利申请系列No.WO 01/21772和美国专利申请系列No.60/262,995中先期描述过。此处我们公开，可以通过改造类泛酸化合物的生产菌株使得MTF水平或MTF合成速率提高或增加，甚至进一步地提高泛酸的产量。
因此，本发明涉及用于提高类泛酸化合物生产的方法，包括调节亚甲基四氢叶酸(“MTF”)生物合成途径。具体地，在类泛酸化合物的生产微生物中提高MTF水平是增进酮泛解酸生产的一种有效手段，而这又可以导致适当工程化的重组微生物中泛解酸和/或泛酸产量的提高。
酮泛解酸羟甲基转移酶催化从α-酮异戊酸(“α-KIV”)和MTF产生酮泛解酸(参见，如图1)。具体地，该酶催化羟甲基基团由MTF转移到α-KIV上生成酮泛解酸。α-KIV和MTF均为该反应的底物，因此可增加它们的合成以提高酮泛解酸的产量。图2中描述了大肠杆菌(以及枯草芽孢杆菌)中用于MTF生物合成的途径。MTF由四氢叶酸和丝氨酸合成，该反应由glyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶催化。为提高MTF的合成，细胞需增加两种底物和glyA基因产物的数量。
在一个实施方案中，本发明涉及用于提高泛酸产量的方法，包括在可使泛酸产量增加的条件下培养微生物，所述微生物具有(i)去调节的泛酸生物合成途径(例如，具有一个、两个、三个或四个去调节的泛酸生物合成酶)以及(ii)去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径(例如，具有至少一个或两个去调节的MTF生物合成酶)。泛酸生物合成酶的示例包括酮泛解酸羟甲基转移酶、酮泛解酸还原酶、泛酸合成酶和门冬氨酸-α-脱羧酶。MTF生物合成酶的示例包括serA基因产物和glyA基因产物。
在另一实施方案，本发明涉及用于提高泛酸产量的方法，包括在可使泛酸产量提高的条件下培养微生物，所述微生物具有(i)去调节的泛酸生物合成途径(例如，具有一个、两个、三个或四个去调节的泛酸生物合成酶)，(ii)去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径(例如，具有一个、两个或三个去调节的ilv生物合成酶)和(iii)去调节的MTF生物合成途径(例如，具有至少一个或两个去调节的MTF生物合成酶)。ilv生物合成酶的示例包括乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸异构还原酶和二羟酸脱水酶。
在另一实施方案中，本发明涉及用于生产泛酸的方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径、去调节的ilv生物合成途径和去调节的MTF生物合成途径的微生物，从而致使在微生物培养36小时后泛酸的产量为至少50g/L，优选地致使在微生物培养36小时后泛酸的产量为至少60g/L，且更优选地致使在微生物培养36小时后泛酸的产量为至少70g/L，最优选地致使在微生物培养36小时之后产生至少80g/L的泛酸、至少90g/L的泛酸、至少100g/L的泛酸、至少110g/L的泛酸或者至少120g/L的泛酸(或者更多)。
在另一实施方案中，本发明公开了用于生产泛酸的方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径、去调节的ilv生物合成途径和去调节的MTF生物合成途径的微生物，所述去调节致使在微生物培养48小时后泛酸的产量至少为70g/L，优选地致使在微生物培养48小时后泛酸的产量至少为80g/L，且更优选地致使在微生物培养48小时后泛酸的产量至少为90g/L。
在一个例示性的实施方案中，MTF生物合成途径的去调节是通过使类泛酸化合物生产菌株中serA基因产物去调节实现的，例如通过组成型表达serA基因，或者通过引入serA的抗反馈等位基因而实现。在另一个例示性的实施方案中，MTF生物合成途径的去调节是通过使类泛酸化合物生产菌株中glyA基因产物去调节而实现的，例如过表达glyA基因或通过突变或破坏purR基因产物来调节对glyA基因的阻遏作用。在其它例示性的实施方案中，MTF的生物合成通过增加培养基中的丝氨酸或者使甘氨酸裂解酶去调节来调控。
本发明进一步涉及如以上所描述的方法，其中通过调节泛酸激酶的活性(例如，降低泛酸激酶的活性)进一步提高泛酸的产量。在一个实施方案中，将CoaA缺失且将CoaX下调。在另一实施方案中，将CoaX缺失且将CoaA下调。而在另一实施方案中，将CoaX和CoaA均下调。本发明还涉及如以上所描述的方法，其中微生物在丝氨酸过量的条件下培养。本发明进一步涉及如以上所描述的方法，其中微生物的泛酸生物合成途径被去调节致使泛酸的生产不依赖于饲喂β-丙氨酸。
本发明还涉及根据本发明方法合成的产物，以及包括根据该方法生产的泛酸的组合物。本发明还涉及用于本发明方法中的重组微生物。在一个实施方案中，本发明涉及用于提高泛酸产量的重组微生物，所述重组微生物具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的MTF生物合成途径。在另一实施方案中，本发明涉及用于提高泛酸产量的重组微生物，该重组微生物具有去调节的泛酸生物合成途径、去调节的MTF生物合成途径和去调节的ilv途径。微生物可进一步具有降低的泛酸激酶活性。优选的微生物属于芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌。
如以上所描述，本发明的某些方面涉及用于提高类泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生产的方法，所述方法包括培养具有至少去调节的泛酸生物合成途径的微生物。术语“泛酸生物合成途径”包括涉及泛酸形成或合成中利用的泛酸生物合成酶(如编码生物合成酶的基因所编码的多肽)、化合物(如底物、中间体或产物)、辅因子等等的生物合成途径。术语“泛酸生物合成途径”包括在微生物中(如，在体内)引起泛酸合成的生物合成途径和在体外引起泛酸合成的生物合成途径。
如这里使用的，“具有去调节的泛酸生物合成途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)(两个术语如这里定义)的泛酸生物合成酶以致使泛酸产量增加(如，与所述微生物在所述生物合成酶去调节之前的泛酸产量相比或与野生型微生物相比)的微生物。术语“泛酸(panthothenate)”包括游离酸形式的泛酸，也称作“泛酸(pantothenicacid)”，以及其任何盐(如，通过用阳离子，例如钙、钠、钾、铵、镁替代泛酸的酸性氢得到的盐)，也称作“泛酸盐(panthothenate salt)”。术语“泛酸”也包括泛酸的醇衍生物。优选的泛酸盐是泛酸钙或泛酸钠。优选的醇衍生物是羟泛酸。本发明的泛酸盐和/或醇包括可以从这里描述的游离酸通过常规方法制备的盐和/或醇。在另一个实施方案中，泛酸盐由本发明的微生物直接合成。本发明的泛酸盐也可以用常规方法转变为游离酸形式的泛酸。术语“泛酸”在本文中也缩写为“pan”。
优选，“具有去调节的泛酸生物合成途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)的泛酸生物合成酶以致使泛酸产量可以达1g/L或更高的微生物。更优选，“具有去调节的泛酸生物合成途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)的泛酸生物合成酶以致使泛酸产量可以达2g/L或更高的微生物。更为优选地，“具有去调节的泛酸生物合成途径”的微生物包括具有至少一个去调节的(如，过表达)泛酸生物合成酶以致使泛酸产量可以达10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L或更高的微生物。
术语“泛酸生物合成酶”包括在泛酸生物合成途径的化合物(如，中间体或产物)的形成中利用的任何酶。例如，泛解酸从α-酮异戊酸(α-KIV)通过中间体酮泛解酸合成。酮泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanB或酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)催化。泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanE1或酮泛解酸还原酶(panE1基因产物)催化。从门冬氨酸合成β-丙氨酸由泛酸生物合成酶PanD或门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)催化。从泛解酸和β-丙氨酸(如，缩合)形成泛酸由泛酸生物合成酶PanC或泛酸合成酶(panC基因产物)催化。泛酸生物合成酶也可以执行旁路功能作为这里所述的HMBPA生物合成途径中的酶。
因此，在一个实施方案中，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有至少一个去调节(如，去调节以致使泛酸产量增加)的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶选自例如PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)、PanE1(或酮泛解酸还原酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有至少两个去调节的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶选自例如PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)和PanE1(或酮泛解酸还原酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有至少三个去调节的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶选自例如PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)和PanE1(或酮泛解酸还原酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有至少四个去调节的泛酸生物合成酶的微生物，例如，具有去调节的PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)和PanE1(或酮泛解酸还原酶)的微生物。
在另一个方面，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径的微生物。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括涉及在丙酮酸转变为缬氨酸或异亮氨酸的形成或合成过程中利用的异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶(如编码生物合成酶的基因所编码的多肽)、化合物(如底物、中间体或产物)、辅因子等等的生物合成途径。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括在微生物中(如，在体内)引起缬氨酸或异亮氨酸合成的生物合成途径和在体外引起缬氨酸或异亮氨酸合成的生物合成途径。
如这里使用的，“具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)(两个术语如这里定义)的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶致使异亮氨酸和/或缬氨酸和/或缬氨酸前体(α-酮异戊酸(α-KIV))产量增加(如，与所述微生物在所述生物合成酶去调节之前的异亮氨酸和/或缬氨酸和/或α-KIV产量相比，或与野生型微生物相比)的微生物。图1包括异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径的图解表示。异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶以粗斜体描述，其相应基因用斜体字表示。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶”包括在异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径的化合物(如，中间体或产物)的形成中利用的任何酶。根据图1，从丙酮酸通过中间体(乙酰乳酸、α，β-二羟基异戊酸(α，β-DHIV)和α-酮异戊酸(α-KIV))合成缬氨酸。从丙酮酸形成乙酰乳酸由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸合成酶(ilvBN基因产物，或alsS基因产物)催化。从乙酰乳酸形成α，β-DHIV由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸异构还原酶(ilvC基因产物)催化。从α，β-DHIV合成α-KIV由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶二羟酸脱水酶(ilvD基因产物)催化。而且，通过支链氨基酸转氨酶，缬氨酸和异亮氨酸可与它们各自的α-酮化合物进行相互转化。异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶也可以执行旁路功能作为这里所述的HMBPA生物合成途径中的酶。
因此，在一个实施方案中，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有至少一个去调节(如，去调节以致使缬氨酸和/或异亮氨酸和/或α-KIV产量增加)的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，所述酶选自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羟酸合成酶)、IlvC(或乙酰羟酸异构还原酶)和IlvD(或二羟酸脱水酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有至少两个去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，所述酶选自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羟酸合成酶)、IlvC(或乙酰羟酸异构还原酶)和IlvD(或二羟酸脱水酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有至少三个去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，例如，所述微生物具有去调节的IlvBN或AlsS(或乙酰羟酸合成酶)、IlvC(或乙酰羟酸异构还原酶)和IlvD(或二羟酸脱水酶)。
如本文所提到的，已发现泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径的酶在[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的合成或[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途径中具有旁路活性。术语“[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途径”包括涉及传统上与泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径相关的、HMBPA形成或合成中所用的生物合成酶和化合物(如底物等)的旁路生物合成途径。术语“HMBPA生物合成途径”包括导致微生物(如体内)合成HMBPA的生物合成途径以及导致体外合成HMBPA的生物合成途径。
术语“HMBPA生物合成酶”包括在HMBPA生物合成途径的化合物(如，中间体或产物)的形成中利用的任何酶。例如，从α-酮异戊酸(α-KIV)合成2-羟基异戊酸(α-HIV)由panE1或panE2基因产物(PanE1这里可替换称作酮泛解酸还原酶)和/或由ilvC基因产物(这里可替换称作乙酰羟酸异构还原酶)催化。从β-丙氨酸和α-HIV形成HMBPA由panC基因产物(这里可替换称作泛酸合成酶)催化。
术语“[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionic acid)(“HMBPA”)”包括游离酸形式的HMBPA，也称作“[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionate)”，及其任何盐(如，通过用阳离子，例如，钙、钠、钾、铵、镁替代3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸的酸性氢得到的盐)，也称作“3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸盐(propionic acid salt)”或“HMBPA盐”。优选的HMBPA盐是HMBPA钙或HMBPA钠。本发明的HMBPA盐包括可以通过常规方法从这里所述的游离酸制备的盐。本发明的HMBPA盐也可以通过常规方法转变为游离酸形式的3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸。
在优选的实施方案中，本发明公开了用于提高类泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生产的方法，包括培养具有去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径的微生物。术语“亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径”指涉及到在PanB底物(MTF)的形成或合成中应用的MTF生物合成酶(如由编码生物合成酶的基因编码的多肽)、化合物(如底物、中间体或产物)、辅因子等的生物合成途径。术语“亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径”指导致体内合成MTF的生物合成途径(如大肠杆菌中的途径，如在图2中所示)，以及导致体外合成MTF的生物合成途径。术语“亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成酶”包括在亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径的化合物(如中间体或产物)的形成中所应用的任何酶。
本发明至少部分基于这样的发现，即，使某些MTF生物合成酶去调节可以导致MTF产量的增加。去调节后可以导致MTF产量增加的MTF生物合成酶被称作为“MTF生物合成增强酶”。“MTF生物合成增强酶”的示例为serA基因产物(3-磷酸甘油酸脱氢酶)和glyA基因产物(丝氨酸羟甲基转移酶)。“具有去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径”的微生物为这样的微生物，其具有至少一个去调节的(如过表达)MTF生物合成增强酶从而使得MTF的生产或生物合成提高(例如，与所述微生物在所述生物合成酶去调节之前的MTF产量相比或与野生型微生物中的MTF产量相比)。
在一个实施方案中，本发明涉及用于提高类泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生产的方法，包括培养如此处所定义的具有去调节的“亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径”的微生物。在另一实施方案中，本发明涉及用于提高类泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生产的方法，包括培养具有去调节的MTF生物合成增强酶的微生物。在优选的实施方案中，本发明涉及用于提高类泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生产的方法，所述方法包括培养具有去调节的glyA基因产物(丝氨酸羟甲基转移酶)和/或去调节的serA基因产物(3-磷酸甘油酸脱氢酶)的微生物。
而本发明的另一方面涉及用于提高泛酸产量的方法，包括在挑选的利于泛酸产生的培养条件下培养微生物，例如，通过在培养基中使用过量丝氨酸(glyA底物)培养微生物。术语“过量丝氨酸”包括使丝氨酸水平增加或高于那些常规用于培养所涉及的微生物的水平。例如，本实施例中描述的芽孢杆菌微生物的培养常规在存在约0-2.5g/L丝氨酸的条件下进行。相应地，过量丝氨酸水平可包括大于2.5g/L的丝氨酸水平，例如，大约2.5至10g/L。过量丝氨酸水平可包括大于5g/L的丝氨酸水平，例如，大约5至10g/L。
而本发明的另一方面涉及在使泛酸产量进一步增加的条件下对此处描述的微生物进行培养，例如，增加如此处所定义的泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径前体和/或中间体(例如在过量的β-丙氨酸、缬氨酸和/或α-KIV存在下培养微生物)，或备选地，进一步修饰该微生物使其在缺乏β-丙氨酸饲喂的条件下能产生显著水平的β-丙氨酸(即，β-丙氨酸非依赖性微生物，如在美国专利申请系列No.09/09/667,569中所描述的)。
而本发明的另一方面涉及进一步对泛酸生产菌株中的泛酸激酶活性进行调节以使泛酸产量提高。泛酸激酶为催化从泛酸生成辅酶A(CoA)的关键酶(参见如美国专利申请系列No.09/09/667,569)。调节泛酸激酶(如降低泛酸激酶的活性或水平)可以减少CoA的产生，从而利于泛酸的积聚。在一个实施方案中，泛酸激酶活性通过缺失CoaA和下调CoaX活性而降低(在某些微生物中CoaA和CoaX均可催化CoA生物合成的第一个步骤)。在另一实施方案中，泛酸激酶活性通过缺失CoaX和下调CoaA而降低。而在另外的实施方案中，泛酸激酶活性通过下调CoaA和CoaX的活性而降低。
本发明的各方面将在以下分部分中作进一步详细描述。
I.靶向编码各种泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成酶的基因在一个实施方案中，本发明涉及修饰或增加泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径的各种生物合成酶的水平。特别是，本发明详述了通过修饰或改变编码所述生物合成酶的基因而修饰与所述途径有关的各种酶的活性。
这里使用的术语“基因”包括在生物体中可以通过基因间DNA(即在生物的染色体DNA中天然位于基因侧翼和/或分开基因的间插或间隔DNA)与另一个基因或其它基因分开的核酸分子(如，DNA分子或其片段)。或者，一个基因可以些微重叠另一个基因(如，第一个基因的3’端与第二个基因的5’端重叠)，这些重叠基因通过基因间DNA与其它基因分开。基因可以指导酶或其它蛋白分子合成(如，可以包含编码序列，例如，编码蛋白的连续开放阅读框架(ORF))或本身可以在生物体中起作用。生物体中的基因可以簇集在操纵子(见本文中的定义)中，所述操纵子通过基因间DNA与其它基因和/或操纵子分开。这里使用的“分离的基因”包括基本不含有在该基因所来源的生物体的染色体DNA中天然位于该基因侧翼的序列(即，不含编码第二个或不同蛋白的相邻编码序列或相邻结构序列等)的基因，但该基因可以任选包括5’和3’调节序列，例如启动子序列和/或终止序列。在一个实施方案中，分离的基因主要包括蛋白质的编码序列(如，编码芽孢杆菌蛋白的序列)。在另一个实施方案中，分离的基因包括编码蛋白的序列(如，编码芽孢杆菌蛋白的序列)和来自该基因的来源生物体的染色体DNA的相邻5’和/或3’调节序列(如，相邻5’和/或3’芽孢杆菌调节序列)。优选，分离的基因含有少于大约10kb，5kb，2kb，1kb，0.5kb，0.2kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的在该基因的来源生物体的染色体DNA中天然位于该基因侧翼的核苷酸序列。
术语“操纵子”包括至少两个相邻基因或ORF，它们任选在至少一个基因或ORF的5’或3’端在序列上重叠。术语“操纵子”包括含有与一个或多个相邻基因或ORF(如，编码酶，例如，生物合成酶的结构基因)相连的启动子和可能的调节元件的基因表达协同单位。例如，可以通过与调节元件结合的调控蛋白或通过抗转录终止协同调节这些基因(如结构基因)的表达。操纵子的基因(如结构基因)可转录为编码所有蛋白的单一mRNA。
这里使用的“具有突变的基因”或“突变基因”包括具有包含至少一个改变(如置换、插入、缺失)的核苷酸序列的基因，其中所述改变致使由所述突变体编码的多肽或蛋白显示出与野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白不同的活性。在一个实施方案中，具有突变的基因或突变基因编码的多肽或蛋白与野生型基因编码的多肽或蛋白相比，当在例如相似条件下测定(如，在相同温度下培养的微生物中测定)时，具有增加的活性。这里使用的“活性增加”或“酶活性增加”是指比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少高5％的活性，优选至少高5-10％，更优选至少高10-25％，甚至更优选比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少高25-50％，50-75％或75-100％，介于上面引用的值中间的范围，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本发明中。这里使用的“活性增加”或“酶活性增加”也可以包括比野生型基因编码的多肽或蛋白的活性至少高1.25倍的活性，优选至少高1.5倍，更优选至少高2倍，甚至更优选比野生型基因编码的多肽或蛋白的活性至少高3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍。
在另一个实施方案中，例如，当在相似条件下测定时(如，在相同温度下培养的微生物中测定时)，具有突变的基因或突变基因编码与野生型基因编码的多肽或蛋白相比活性降低的多肽或蛋白。突变基因也可不编码多肽或编码产量水平降低的野生型多肽。这里使用的“活性降低”或“酶活性降低”是指比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少低5％的活性，优选至少低5-10％，更优选至少低10-25％，甚至更优选比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少低25-50％，50-75％或75-100％。介于上面引用的值中间的范围，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本发明中。这里使用的“活性降低”或“酶活性降低”也可以包括活性被消除或“剔除”(如，比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性低大约100％的活性)。
可以根据任何被很好接受用于测定感兴趣的特定蛋白的活性的试验来确定活性。可以直接测定或检测活性，例如，测定粗细胞提取物中的蛋白的活性或从细胞或微生物分离或纯化的蛋白的活性。可供选择地，可在细胞或微生物内或细胞外介质内测定或检测活性。例如，可以通过使突变基因在微生物例如，具有温度敏感性酶的突变微生物中表达，然后检测突变基因弥补温度敏感性(Ts)突变体的酶活性的能力，对突变基因(例如，所述编码降低的酶活性的突变体)进行检测。编码“增加的酶活性”的突变基因可以是能比例如相应野生型基因更有效地弥补Ts突变体的基因。编码“降低的酶活性”的突变基因是在弥补Ts突变体方面不如例如相应野生型基因有效的基因。
本领域技术人员明了，与相应野生型多肽或蛋白相比，核酸或基因序列中甚至单一置换(如，在相应氨基酸序列中编码氨基酸改变的碱基置换)也可能急剧地影响所编码多肽或蛋白的活性。这里定义的突变基因(如，编码突变多肽或蛋白)可容易地与编码蛋白同系物(homologue)的核酸或基因区别，因为突变基因编码活性改变的蛋白或多肽，并且任选地导致在表达所述突变基因或产生所述突变蛋白或多肽的微生物(即，突变微生物)中可观察到与表达野生型基因的相应微生物不同或明显不同的表型。相反地，蛋白同系物可具有等同或基本相似的活性，任选地导致当在微生物中产生时与表达野生型基因的相应微生物相比无可区别的表型。因此，不是由例如核酸分子、基因、蛋白或多肽间的序列等同程度来区分同系物和突变体，而是由所编码的蛋白或多肽的活性来区分同系物和突变体同系物可以具有例如低序列等同性(如，30-50％序列等同性)然而具有基本等同的功能活性，而突变体可以例如享有99％序列等同性然而具有大大不同或改变的功能活性。
本领域技术人员也将领会到用于本发明的核酸分子，基因，蛋白或多肽可来自具有MTF生物合成途径、ilv生物合成途径或泛酸生物合成途径的任何微生物。本领域技术人员可以使用已知技术如同源性筛选，序列比较等等鉴定这种核酸分子，基因，蛋白或多肽，并且本领域技术人员可以对这些核酸分子，基因，蛋白或多肽进行修饰以使其能在重组微生物中表达或产生(如，通过使用适当启动子、核糖体结合位点、表达或整合载体，修饰基因序列使转录增加(考虑优选密码子使用)等，根据这里所述的技术和本领域已知的那些技术来实现)。
在一个实施方案中，本发明的基因来自革兰氏阳性微生物生物体(如，由于生物体外围绕存在革兰氏阳性壁而保持碱性染色，例如，结晶紫的微生物)。术语“来自”(如“来自”革兰氏阳性微生物)是指在此微生物中天然存在的基因(如革兰氏阳性微生物的天然基因)。在优选实施方案中，本发明的基因来自属于选自芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Cornyebacterium)(如谷氨酸棒杆菌(Cornyebacterium glutamicum))、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(lactococci)和链霉菌属(Streptomyces)属的属的微生物。在更优选实施方案中，本发明的基因来自芽孢杆菌属的微生物。在另一个优选实施方案中，本发明基因来自选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、泛酸芽孢杆菌(Bacilluspantothenticus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽孢杆菌(Baciilus thuringiensis)、耐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)和其它1组芽孢杆菌种(例如，以16S rRNA型表征的种)的微生物。在另一个优选实施方案中，基因来自短芽孢杆菌(Bacillus brevis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。在另一个优选实施方案中，本发明的基因来自选自地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的微生物。在特别优选的实施方案中，基因来自枯草芽孢杆菌(如，是枯草芽孢杆菌来源的)。术语“来自枯草芽孢杆菌”或“枯草芽孢杆菌来源的”包括在枯草芽孢杆菌微生物中天然发现的基因。在本发明范围内包括芽孢杆菌来源的基因(如，枯草芽孢杆菌来源的基因)，例如，芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌purR基因，serA基因，glyA基因，coaX基因，coaA基因，pan基因和/或ilv基因。
在另一个实施方案中，本发明的基因来自革兰氏阴性(排除碱性染色)微生物。在优选实施方案中，本发明的基因来自属于选自沙门氏菌属(Salmonella)(如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))，埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙雷氏菌属(Serratia)和变形杆菌属(Proteus)的属的微生物。在更优选的实施方案中，本发明的基因来自埃希氏菌属的微生物。在甚至更优选的实施方案中，本发明的基因来自大肠杆菌(Escherichia coli)。在另一个实施方案中，本发明的基因来自酵母属(Saccharomyces)(如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
II.重组核酸分子和载体本发明还涉及包括这里所述的基因(如分离的基因)的重组核酸分子(如重组DNA分子)，所述基因优选芽孢杆菌基因，更优选枯草芽孢杆菌基因，甚至更优选枯草芽孢杆菌泛酸生物合成基因和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成基因和/或亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成基因。术语“重组核酸分子”包括经改变，修饰或工程化(如一个或多个核苷酸插入、缺失或置换)在核苷酸序列方面不同于其所来源的天然或自然核酸分子的核酸分子(如，DNA分子)。优选，重组核酸分子(如，重组DNA分子)包括可操作连接调节序列的本发明的分离基因。短语“可操作连接调节序列”意思是感兴趣的基因的核苷酸序列与调节序列以允许基因进行表达(如，增强的，增加的，组成的，基础的，衰减的，减少的或阻碍的表达)的方式，优选以允许该基因编码的基因产物表达(如，当将重组核酸分子包括在如这里定义的重组载体中并导入微生物中时)的方式连接。
术语“调节序列”包括影响(如，调制或调节)其它核酸序列(即基因)表达的核酸序列。在一个实施方案中，调节序列被包括在重组核酸分子中，其相对于感兴趣的特定基因的位置和方向与两者在天然情况下显示的位置和/或方向相似或等同，如为天然位置和/或方向。例如，感兴趣基因可包括在重组核酸分子中与如下调节序列可操作连接，所述调节序列在天然生物中伴随或邻近此感兴趣基因(如，可操作连接“天然”调节序列(如，连接“天然”启动子))。可供选择地，感兴趣基因可包括在重组核酸分子中与如下调节序列可操作连接，该调节序列在天然生物中伴随或邻近其它(如，不同的)基因。可供选择地，感兴趣基因可包括在重组核酸分子中与来自另一生物的调节序列可操作连接。例如，可以使来自其它微生物的调节序列(如，其它细菌调节序列，噬菌体调节序列等等)与特定感兴趣基因可操作连接。
在一个实施方案中，调节序列是非自然或非天然存在的序列(如，已经被修饰，突变，置换，衍化，缺失的序列，包括化学合成的序列)。优选的调节序列包括启动子、增强子、终止信号、抗终止信号和其它表达控制元件(如，阻遏物或诱导物结合的序列和/或，例如，在转录的mRNA中，转录和/或翻译调节蛋白的结合位点)。例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版.，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中描述了这种调节序列。调节序列包括指导核苷酸序列在微生物中组成型表达的那些序列(如，组成型启动子和强组成型启动子)，指导核苷酸序列在微生物中可诱导表达的那些序列(如，诱导型启动子，例如，木糖诱导型启动子)和衰减或阻遏核苷酸序列在微生物中的表达的那些序列(如，衰减信号或阻遏物结合序列如，PurR结合位点)。通过去除或缺失调节序列来调节感兴趣基因的表达也包括在本发明的范围内。例如，可去除参与转录负调节的序列以使感兴趣基因表达增强。
在一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括可操作地连接启动子或启动子序列的编码至少一个细菌基因产物(如，泛酸生物合成酶，异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶和/或亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成酶)的核酸序列或基因。本发明优选的启动子包括芽孢杆菌启动子和/或噬菌体启动子(如，感染芽孢杆菌的噬菌体)。在一个实施方案中，启动子是芽孢杆菌启动子，优选强芽孢杆菌启动子(如，芽孢杆菌中与生物化学管家基因关联的启动子或芽孢杆菌中与糖酵解途径基因关联的启动子)。在另一个实施方案中，启动子是噬菌体启动子。在优选实施方案中，启动子来自噬菌体SP01。在尤其优选实施方案中，启动子选自P15，P26或Pveg，具有例如下列各序列GCTATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGTACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(SEQ ID NO1)，GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGCAGGACGC(SEQ ID NO2)，和GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCAATG(SEQ IDNO3)。其它优选的启动子包括tef(翻译延伸因子(TEF)启动子)和pyc(丙酮酸羧化酶(PYC)启动子)，它们可以在芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)中启动高水平表达。其它优选的启动子，例如，当用于革兰氏阳性微生物时，包括但不限于amy和SPO2启动子。其它优选的启动子，例如，当用于革兰氏阴性微生物时，包括但不限于cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIQ，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL。
在另一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括一个或多个终止序列(如，转录终止序列)。术语“终止序列”包括起终止mRNA转录作用的调节序列。终止序列(或串联转录终止子)可进一步起稳定mRNA(如，通过给mRNA添加结构)的作用，以例如，抗核酸酶。
在再一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括这样的序列，该序列使得含有它的载体能得以检测，即，可检测和/或可选择标记，例如，编码抗生素抗性序列或能克服营养缺陷突变的基因，例如，trpC，药物标记，荧光标记，和/或比色标记(如，lacZ/β-半乳糖苷酶)。在再一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括人工核糖体结合位点(RBS)或可转录为人工RBS的序列。术语“人工核糖体结合位点(RBS)”包括mRNA分子内(如，DNA内编码的)与核糖体结合(如，以启动翻译)的位点，该位点与天然RBS(如，天然基因中发现的RBS)至少有一个核苷酸不同。优选的人工RBS包括大约5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24，25-26，27-28，29-30或更多个核苷酸，其中大约l-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-15或更多个核苷酸与天然RBS(如，感兴趣基因的天然RBS，例如，天然panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO4)或天然panD RBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG(SEQ ID NO5))不同。
优选，对差异核苷酸进行置换使它们等同于最佳比对进行比较时理想RBS中的一个或多个核苷酸。理想RBS包括，但不限于，AGAAAGGAGGTGA(SEQ ID NO6)，TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG(SEQ ID NO7)，TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG(SEQID NO8)，AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG(SEQ ID NO9)，和AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG(SEQ ID NO10)。人工RBS可用于替代与特定基因关联的天然存在的或天然的RBS。优选人工RBS增强特定基因的翻译。优选的人工RBS(如，增加panB，例如，芽孢杆菌panB翻译的RBS)包括CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG(SEQ IDNO11)和CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO12)。优选的人工RBS(如，增加panD，例如，芽孢杆菌panD翻译的RBS)包括TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG(SEQ ID NO13)，TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG(SEQ ID NO14)，TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG(SEQ ID NO15)，
TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG(SEQ ID NO16)，ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG(SEQ ID NO17)，ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG(SEQ ID NO18)和ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG(SEQ ID NO19)。
本发明进一步公开了包括这里所述的核酸分子(如，基因或包含所述基因的重组核酸分子)的载体(如重组载体)。术语“重组载体”包括已经被改变，修饰或工程化从而含有与此重组载体所来源的天然或自然核酸分子中所包含的序列相比较多，较少或不同的核酸序列的载体(如，质粒、噬菌体、噬粒、病毒、粘粒或其它纯化的核酸载体)。优选，重组载体包括可操作地连接如这里定义的调节序列(例如，启动子序列，终止序列和/或人工核糖体结合位点(RBS))的编码生物合成酶的基因或包含所述基因的重组核酸分子。在另一个实施方案中，本发明的重组载体包括可以增强在细菌中的复制的序列(如，增强复制的序列)。在一个实施方案中，增强复制的序列在大肠杆菌中起作用。在另一个实施方案中，增强复制的序列来自pBR322。
在另一个实施方案中，本发明的重组载体包括抗生素抗性序列。术语“抗生素抗性序列”包括促进或使宿主生物(如，芽孢杆菌)抵抗抗生素的序列。在一个实施方案中，抗生素抗性序列选自cat(氯霉素抗性)序列，tet(四环素抗性)序列，erm(红霉素抗性)序列，neo(新霉素抗性)序列，kan(卡那霉素抗性)序列和spec(壮观霉素抗性)序列。本发明的重组载体可进一步包括同源重组序列(如，设计以允许感兴趣基因重组到宿主生物的染色体中的序列)。例如，bpr，vpr，或amyE序列可用作同源靶标以实现向宿主染色体中的重组。本领域技术人员也将领会到载体的设计可根据如选择的待被遗传改造的微生物，期望的基因产物表达水平等等因素来进行适应性调整。
III.重组微生物本发明进一步涉及包括如这里所述的载体或基因(如，野生型和/或突变基因)的微生物，即重组微生物。这里使用的术语“重组微生物”包括已经被遗传改变、修饰或改造(如遗传工程化)以致与它所来源的天然微生物相比显示出改变、修饰或不同的基因型和/或表型(如，当遗传学修饰影响该微生物的编码核酸序列时)的微生物(如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)。
在一个实施方案中，本发明的重组微生物是革兰氏阳性生物(如，由于存在革兰氏阳性壁围绕生物体而保持碱性染色，例如，结晶紫的微生物)。在优选实施方案中，重组微生物是属于选自芽孢杆菌属、棒杆菌属(例如，谷氨酸棒杆菌(Cornyebacterium glutamicum)、乳杆菌属、乳球菌属和链霉菌属的属的微生物。在更优选实施方案中，重组微生物是芽孢杆菌属的微生物。在另一个优选实施方案中，重组微生物选自枯草芽孢杆菌，缓病芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌，泛酸芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，耐芽孢杆菌和其它1组芽孢杆菌种(例如，以16S rRNA型表征的种)。在另一个优选实施方案中，重组微生物来自短芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一个优选实施方案中，重组微生物选自地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。
在另一个实施方案中，重组微生物是革兰氏阴性(不接受碱性染色)生物。在优选实施方案中，重组微生物是选自沙门氏菌属(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，沙雷氏菌属和变形杆菌属的属的微生物。在更优选实施方案中，重组微生物是埃希氏菌属的微生物。在甚至更优选的实施方案中，重组微生物是大肠杆菌。在另一个实施方案中，重组微生物是酵母属微生物(如，酿酒酵母)。
本发明优选的“重组”微生物是具有去调节的泛酸生物合成途径或酶、去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径或酶和/或修饰的或去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径或酶的微生物。术语“去调节的”或“去调节”包括改变或修饰微生物的至少一个编码生物合成途径中的酶的基因，使微生物中的该生物合成酶的水平或活性改变或变动。优选，改变或修饰至少一个编码生物合成途径中的酶的基因使基因产物增多或增加。短语“去调节的途径”包括这样的生物合成途径，在该途径中一个以上编码生物合成途径中的酶的基因被改变或修饰，以致一个以上的生物合成酶的水平或活性发生改变或变动。使微生物的生物学途径“去调节”的能力(如同时去调节给定生物合成途径中的一个以上基因)在有些情况下源自微生物的一种特殊现象，即微生物中一个以上的酶(如，两个或三个生物合成酶)可以由术语称作“操纵子”(见这里的定义)的连续基因物质上彼此邻近存在的基因编码。由于包括在操纵子中的基因被协同调节，单一启动子和/或调节元件的改变或修饰即可导致该操纵子编码的每个基因产物的表达都发生改变或变动。调节元件的改变或修饰可包括，但不限于，去除内源性启动子和/或调节元件，添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子或去除调节序列使基因产物表达被改变，改变基因或操纵子在染色体中的位置，改变与基因或操纵子相邻的或位于操纵子内的核酸序列如核糖体结合位点，增加基因或操纵子的拷贝数量，修饰参与基因或操纵子转录和/或基因或操纵子的(一个或多个)基因产物翻译的蛋白(如，调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活物等等)，或本领域中使基因表达去调节的任何其它常规方法(包括但不限于反义核酸分子的使用，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。去调节也可涉及改变一个或多个基因的编码区，以得到例如可抵抗反馈作用或具有更高或更低的比活性的酶。
在另一个优选实施方案中，设计或改造重组微生物使至少一个泛酸生物合成酶、至少一个异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶和/或至少一个MTF生物合成酶过表达。术语“过表达的”或“过表达”包括基因产物(如生物合成酶)的表达水平比该微生物操作前的表达水平高或比未接受操作的可比较微生物中的表达水平高。在一个实施方案中，微生物可被遗传设计或改造以过表达基因产物，从而使基因产物水平比没有被改造的可比较微生物中的表达水平高。
遗传学改造(工程化)可包括，但不限于，改变或修饰与特定基因表达关联的调节序列或位点(如，添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子或去除调节序列使表达成为组成型的)，改变特定基因的染色体位置，改变与特定基因邻近的核酸序列如核糖体结合位点，增加特定基因的拷贝数量，修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白(如，调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活物等等)，或本领域中使特定基因表达去调节的其它任何常规方法(包括但不限于反义核酸分子的使用，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。遗传学改造也可包括缺失基因，例如，以阻断生物学途径或去除阻遏物。
在另一个实施方案中，可从物理上或环境上操作微生物以过表达基因产物，使基因产物水平高于微生物操作前的表达水平或高于没有被操作的可比较微生物中的表达水平。例如，可以在存在已知或猜测可以增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的试剂时培养微生物或用这些试剂处理微生物，使转录和/或翻译增强或增加。可供选择地，可以在能增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的选择温度下培养微生物，使转录和/或翻译增强或增加。
IV.重组微生物的培养和发酵术语“培养”包括使本发明的活微生物维持和/或生长(如，使培养物或菌株维持和/或生长)。在一个实施方案中，在液体培养基中培养本发明的微生物。在另一个实施方案中，在固体或半固体培养基中培养本发明的微生物。在优选实施方案中，在包含对微生物的维持和/或生长而言必需或有益的营养物质(如，碳源或碳底物，例如碳水化合物，碳氢化合物，油，脂，脂肪酸，有机酸和醇；氮源，例如，胨，酵母提取物，肉膏，麦芽汁，大豆粉，大豆面粉，大豆粗磨粉，尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如，磷酸，其钠和钾盐；微量元素，例如，镁，铁，锰，钙，铜，锌，硼，钼，和/或钴盐；以及生长因子如氨基酸，维生素，生长促进剂等等)的培养基(如，无菌的液体培养基)中培养本发明的微生物。
优选，在受控pH下培养本发明的微生物。术语“受控pH”包括可以引起期望产物(如，泛解酸和/或泛酸)产生的任何pH。在一个实施方案中，在大约pH7培养微生物。在另一个实施方案中，在6.0和8.5之间的pH培养微生物。期望的pH可以通过本领域技术人员所知的任何方法维持。
也优选，在受控通气下培养本发明的微生物。术语“受控通气”包括足以导致期望产物(如，泛解酸和/或泛酸)产生的通气(如，氧气)。在一个实施方案中，通气由调节培养物中的氧水平来控制，例如，由调节溶解在培养基中的氧量来控制。优选，通过搅拌培养物来控制培养物的通气。搅拌可以用螺旋桨或类似机械搅拌装置，用旋转或摇动培养容器(如，管或烧瓶)或用各种泵装置来提供。还可以将无菌空气或氧气通入培养基(如，通入发酵混合物)控制通气。也优选，在没有过量泡沫(如，通过添加消泡剂)的条件下培养本发明的微生物。
此外，可在受控温度下培养本发明的微生物。术语“受控温度”包括可以引起期望产物(如，泛解酸和/或泛酸)产生的任何温度。在一个实施方案中，受控温度包括15℃和95℃之间的温度。在另一个实施方案中，受控温度包括15℃和70℃之间的温度。优选温度是20℃至55℃，更优选30℃至50℃。
可以在液体培养基中培养(如维持和/或生长)微生物，优选利用常规培养方法如固定培养、试管培养、摇动培养(如，旋转摇动培养，摇瓶培养等)、通风旋转培养或发酵，连续或间断地培养。在优选实施方案中，在摇瓶中培养微生物。在更优选实施方案中，在发酵罐中(如，发酵方法)培养微生物。本发明的发酵方法包括但不限于分批发酵、补料分批发酵和连续发酵过程或方法。短语“分批方法”或“分批发酵”是指培养基、养料、补充添加剂等等的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行改变的系统，然而，可以尝试控制如pH和氧气浓度等因素以防止过度培养基酸化和/或微生物死亡。短语“补料分批方法”或“补料分批”发酵是指随着发酵的进行添加(如，递增或连续添加)一种或多种底物或补充物的分批发酵。短语“连续方法”或“连续发酵”是指这样的系统，其中将规定的发酵培养基连续添加到发酵罐中同时移去等量使用过的培养基或“条件”培养基，优选用于回收期望产物(如泛解酸和/或泛酸)。已经开发出多种此类方法，且它们是本领域熟知的。
短语“在使期望化合物产生的条件下培养”包括在适宜或足以产生期望化合物或产生期望产量的特定化合物的条件下(如，温度，压力，pH，持续时间等)对微生物进行维持和/或生长。例如，可以使培养持续足以产生期望量化合物(如，泛解酸和/或泛酸)的时间。优选，培养持续足以基本达到适当化合物产量的时间(如，足以达到适当的泛解酸和/或泛酸浓度或适当的泛解酸和/或泛酸HMBPA比率的时间)。在一个实施方案中，持续培养大约12至24小时。在另一个实施方案中，持续培养大约24至36小时，36至48小时，48至72小时，72至96小时，96至120小时，120至144小时，或超过144小时。在再一个实施方案中，在可导致大约36小时内产生至少大约5至10g/L化合物，大约48小时内产生至少大约10至20g/L化合物，或大约72小时内产生至少大约20至30g/L化合物的条件下培养微生物。在再一个实施方案中，在可导致大约36小时内产生至少大约5至20g/L化合物，大约48小时内产生至少大约20至30g/L化合物，大约72小时内产生至少大约30至50或60g/L化合物的条件下培养微生物。而在另一实施方案中，在可导致于约36小时内至少产生约40到60g/L化合物，或约48小时内至少产生约60到90g/L化合物的条件下培养微生物。本领域内的技术人员将会理解，通过此处描述的方法也可获得高于此处所引范围的上限的数值，例如，在特定的发酵程序中或应用特定的工程化菌株。
优选地，本发明的生产方法导致泛酸的生产水平“与适当的对照相比提高”。术语“适当的对照”，如此处所定义，包括本领域技术人员公认的适于确定加强的、增加的或提高的所需产物水平的任何对照。例如，当方法涉及培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物且该微生物进一步具有去调节的MTF生物合成途径(即，经过改造使至少一个MTF生物合成酶去调节，例如，过表达)时，适当的对照包括在操作MTF酶或途径之前的微生物或未进行此操作的微生物的培养物(即仅具有去调节的泛酸生物合成途径)。同样，当方法涉及培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的ilv生物合成途径的微生物且该微生物进一步具有去调节的MTF生物合成途径(即经过改造使至少一个MTF生物合成酶去调节，例如，过表达)时，适当的对照包括在操作MTF酶或途径之前的微生物或未进行此操作的微生物(即仅具有去调节的泛酸生物合成途径和ilv生物合成途径)的培养物。不必在根据本发明实践的每一方法中均进行比较。例如，本领域技术人员可通过例如在相同或类似的条件下进行一系列反应(如试管培养、摇瓶培养、发酵)，根据经验确定适当的对照。例如，在明了特定菌株的常规生产水平的条件下，本领域技术人员能够识别较此水平增强的、增加的或提高的生产水平。换言之，与适当对照的比较包括与预先确定的数值(如预先确定的对照)的比较。
这样，在一个实施方案中，当适宜的工程化菌株在36小时内产生40g/L的泛酸时(在使泛酸产量提高的操作之前)，50、60、70g/L或更多的泛酸产量(操作后，例如，在使至少一个MTF生物合成酶过表达的操作之后)则为产量提高的示例。同样，在一个实施方案中，当适宜的工程化菌株在48小时内产生50g/L泛酸(在使泛酸产量提高的操作之前)时，60、70、80、90g/L或更多的泛酸产量(操作后，例如，在使至少一个MTF生物合成酶过表达的操作之后)则为产量提高的示例。
本发明的方法还可以包括回收期望化合物(如，泛解酸和/或泛酸)的步骤。术语“回收”期望化合物包括从培养基中提取，收获，分离或纯化化合物。可根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法回收化合物，这些方法包括但不限于用传统树脂处理(如，阴离子或阳离子交换树脂，非离子吸附树脂等)，用传统吸附剂处理(如，活性炭，硅酸，硅胶，纤维素，矾土等)，改变pH，溶剂提取(如，用常规溶剂如醇、乙酸乙酯、己烷等等)，透析，过滤，浓缩，结晶，重结晶，pH调节，冷冻干燥等等。例如，从培养基中回收化合物可以通过首先从培养物中移出微生物来进行。然后可以使培养基通过或加载于阳离子交换树脂上以去除阳离子，然后通过或加至阴离子交换树脂上以去除无机阴离子和比感兴趣化合物具有更强酸性的有机酸。所得化合物可随后转化成如这里所述的盐(如，钙盐)。
优选，“提取”、“分离”或“纯化”本发明的期望化合物使所得制品基本上不含其它培养基成分(如，不含培养基成分和/或发酵副产物)。短语“基本上不含其它培养基成分”包括其中期望化合物与产生它的培养物中的培养基成分或发酵副产物已相分离的期望化合物制品。在一个实施方案中，该制品中有多于大约80％的期望化合物(干重)(如，少于大约20％的其它培养基成分或发酵副产物)，更优选多于大约90％的期望化合物(如，少于大约10％的其它培养基成分或发酵副产物)，再更优选多于大约95％的期望化合物(如，少于大约5％的其它培养基成分或发酵副产物)，和最优选多于大约98-99％的期望化合物(如，少于大约1-2％的其它培养基成分或发酵副产物)。当期望化合物已经衍生为盐时，优选该化合物进一步不含与形成该盐相关的化学污染物。当期望化合物已经衍生为醇时，优选该化合物进一步不含与醇形成相关的化学污染物。
在可供选择的实施方案中，并不从微生物中纯化期望化合物，例如，当微生物在生物学上无危险性(如，安全)时。例如，可将全部培养物(或培养上清)用作产物(如，粗产物)来源。在一个实施方案中，使用未经修饰的培养物(或培养上清)。在另一个实施方案中，浓缩培养物(或培养上清)。在另一个实施方案中，干燥或冷冻干燥培养物(或培养上清)。
而在另一实施方案中，期望化合物被部分纯化。术语“部分纯化”包括已至少经过一些加工，例如，用商用树脂处理(如批处理)的培养基制品。在优选的实施方案中，“部分纯化的”制品含有大于约30％(干重)的期望化合物，优选地大于约40％的期望化合物，更优选地大于约50％的期望化合物，更优选地大于约60％的期望化合物，且最优选地大于约70％的期望化合物。“部分纯化的”制品也优选含有80％或少于80％(干重)的期望化合物(即纯度小于此处所述的“提取的”、“分离的”或“纯化的”制品)。
根据所操作的生物合成酶或生物合成酶的组合，为了产生期望化合物，可能期望或需要给本发明微生物提供(如，饲喂)至少一种生物合成前体。术语“生物合成前体”或“前体”包括这样的试剂或化合物，当提供、接触微生物，或包括在微生物的培养基中时其起增强或增加期望产物的生物合成的作用。在一个实施方案中，生物合成前体或前体是门冬氨酸。在另一个实施方案中，生物合成前体或前体是β-丙氨酸。优选门冬氨酸或β-丙氨酸的添加量可以导致培养基中的浓度足够增加微生物的生产力(如，足以增加泛解酸和/或泛酸产量的浓度)。本发明的生物合成前体可以以浓缩溶液或悬浮液形式(如，在适宜溶剂，如水或缓冲液中)或固体形式(如，粉末形式)添加。此外，本发明的生物合成前体可以以单份额添加，连续或间断给予给定的一段时间。术语“β-丙氨酸过量”包括使β-丙氨酸水平增加或高于常规用于培养所涉及的微生物的水平。例如，本实施例中所述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0-0.01g/L β-丙氨酸存在下进行。因此，过量β-丙氨酸水平可包括大约0.01-1，优选大约1-20g/L的水平。
在另一个实施方案中，生物合成前体是缬氨酸。在另一个实施方案中，生物合成前体是α-酮异戊酸。优选，缬氨酸或α-酮异戊酸的添加量可以导致培养基中的浓度足以引起期望化合物(如泛解酸和/或泛酸)产生。术语“α-KIV过量”包括使α-KIV水平增加或高于常规用于培养所述微生物的水平。例如，本实施例中所述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0-0.01g/Lα-KIV存在下进行。因此，过量α-KIV水平可包括大约0.01-1g/L，优选大约1-20g/Lα-KIV。术语“缬氨酸过量”包括使缬氨酸水平增加或高于常规用于培养所涉及的微生物的水平。例如，本实施例中所述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0-0.5g/L缬氨酸存在下进行。因此，过量缬氨酸水平可包括大约0.5-5g/L，优选大约5-20g/L缬氨酸。
而在另一实施方案中，生物合成前体为丝氨酸。优选地，丝氨酸以导致培养基中的浓度足以引起期望化合物(如泛解酸和/或泛酸)产生的量添加。也可根据此处描述的生产方法加入过量的丝氨酸(如此处所定义)，例如，用于提高泛酸的产量。本领域技术人员将理解，极度过量的生物合成前体可能对微生物产生毒性。生物合成前体这里也称作“补充的生物合成底物”。
本发明的另一个方面包括以这里所述的重组微生物为特征的生物转化方法。术语“生物转化方法”，这里也称作“生物转变方法”，包括导致适当底物和/或中间体化合物生成(如，转化或转变成)期望产物的生物学方法。
生物转化反应中使用的微生物和/或酶以允许它们执行预期功能(如，产生期望化合物)的形式存在。微生物可以是整个细胞，或可以仅仅是获得期望的最终结果所需的那些细胞部分。可以将微生物悬浮(如，在适当溶液如缓冲溶液或培养基中)，洗涤(如，洗涤以除去培养微生物时的培养基)，丙酮干燥，固定(如，用聚丙烯酰胺凝胶或κ-角叉菜胶或在合成载体，例如，珠，基质等等上)，固着，交联或透化处理(如，透化处理膜和/或壁以便化合物，例如，底物、中间体或产物可更容易通过所述膜或壁)。
本发明进一步由以下实施例作举例说明，但所述实施例不应视为本发明的限制。在此申请中的全部参考文献、专利和出版的专利申请的内容均在此引用作为本发明的参考。
实施例实施例I类泛酸化合物生产菌株在开发芽孢杆菌菌株用于泛酸生产时，对参与泛酸生物合成途径和异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径(图1)的基因和酶实施了多种遗传操作，如在美国专利申请系列No.09/400,494和美国专利申请系列No.09/667,569中所描述的。例如，具有去调节的panBCD操纵子和/或具有去调节的panE1的菌株表现出增加的泛酸产量(当在β-丙氨酸和α-酮异戊酸(α-KIV)存在的条件下培养时)。进一步使ilvBNC和ilvD去调节的菌株在仅存在β-丙氨酸的条件下即表现出增加的泛酸产量。此外，可以通过进一步去调节panD以实现不依赖于β-丙氨酸。
泛酸生产菌株的一个示例PA824为色氨酸原养型，Spec和Tet抗性，在panBCD座位有去调节的panBCD，在panE1座位有去调节的panE1(在枯草芽孢杆菌基因组中有两个基因与大肠杆菌的panE同源，即，panE1和panE2，前者编码参与泛酸生产的主要酮泛解酸还原酶，而panE2对泛酸合成无贡献(美国专利申请系列No.09/400,494))，在ilvD座位有去调节的ilvD，在amyE座位过表达ilvBNC盒子且在bpr座位过表达panD。当根据标准发酵方法在14L发酵罐内培养48小时后，PA824常规产生约40-50g/L的泛酸(参见如，临时专利申请系列No.60/263,053或临时专利申请系列No.60/262,995，在此引用作为参考)。简言之，在含痕量元素的分批培养基(4.5L)中接种PA824的摇瓶培养物。控制发酵的温度(如，43℃)、溶解的O2和pH值，且按葡萄糖限制性分批补料方法进行发酵。第一批葡萄糖消耗后，葡萄糖的浓度通过连续补给新鲜流加培养基(FEED medium)维持在约0到1g/L之间。pH值设定在7.2，并进行监控和通过加入NH3-或H3PO4-溶液进行维持。溶解氧浓度[pO2]通过调节搅动和通气速率维持在约10-30％。通过加入适当的消泡剂控制泡沫形成。离心移除细胞后测定(通过HPLC分析)发酵肉汤中的泛酸滴度。
第二个示例菌株为PA668。PA668为PA824的衍生物，含额外拷贝的在vpr和/或panB座位扩增的P26panB。PA668应用panB表达载体(pAN636)构建，这使得可以应用氯霉素进行多拷贝的筛选。简言之，连接pAN636的NotI限制性片段(不含载体序列)，然后用于转化PA824，用含5μg/ml氯霉素的平板进行筛选。分离可以抗30μg/ml氯霉素的转化体，并在48小时试管培养物中筛选泛酸的产量。此分离株产生比PA824约多10％的泛酸。在10-L的发酵物中，第一菌株PA668-2A与在类似的条件下培养的PA824产生数量相当的泛酸(如在36小时时为～45-50g/L)。36小时后，当PA824的泛酸产生例行开始减慢时，PA668-2A仍持续产生相当高水平的泛酸(如在48小时时为～60-65g/L的泛酸)。第二菌株PA668-24产生泛酸的速率甚至更快，48小时后达到60-70g/L。
第三个生产菌株PA721B-39按如下所述改造以进一步含有可扩增的P26panBpanD盒子。首先，构建一单独的表达盒子，所述盒子能够使panB和panD整合在bpr座位。两个基因结合在一个表达盒子中通过消除抗生素抗性标记简化了所产生的菌株。构建P26panBpanD表达盒子使其含有两个不同的panD核糖体结合位点(RBS已先期在国际公开No.WO01/21772和美国专利申请No.60/262,995中合成并测试)。盒子进一步包括合成的panB基因核糖体结合位点(RBS1)，但此设计允许将来通过简单的寡核苷酸盒子替换来改变panB RBS。在构建的第一步中，panB基因与两个panD基因盒子连接，如图3所示的pAN665的构建。然后，将产生的panBpanD盒子转移到枯草芽孢杆菌表达载体pOTP61中，见图4中所示。构建的每一质粒(pAN670和pAN674)的基本特征总结在表1中。
表1.含不同枯草芽孢杆菌panBpanD基因表达盒子的质粒
这些新质粒从单一载体上组合产生额外的PanB和PanD，且相对存在于PA668中的panB表达载体(pAN636)，预期其产生水平增高的PanB。在泛酸生产菌株中安装P26panBpanD载体的策略利用了bpr和panE1间的遗传连锁。首先通过用分离自PA930(panE1∷cat)的染色体DNA转化菌株并筛选氯霉素抗性，构建PA824的衍生物，该衍生物的内在panD表达盒子被除去。通过对四环素的敏感性筛选产生的转化株，对两株名为PA715的Tet敏感性分离株进行保存。该菌株为测试P26 panBpanD载体的宿主菌株(参见以下)。为恢复PA715中的P26 panE1盒子，用每一载体首先转化PA328菌株，该菌株含P26 panE1但不含整合在bpr座位的盒子。PA328确实含有P26 panBCD座位，但其未进行过量产生α-KIV的改造。应用来自这两个载体的适当NotI限制性片段获得抗四环素的PA328转化体，产生的菌株命名为PA710和PA714。
下一步是将此盒子转入PA715，以使其可在PA824菌株背景中进行评价。以上通过从菌株PA710和PA714中分离染色体DNA、应用两种DNA单独转化PA715并应用四环素抗性筛选来实现。通过对氯霉素的敏感性来筛选四环素抗性转化体；这可鉴定出通过与bpr座位的P26 panBpanD盒子连锁还从供体DNA获得P26 panE1基因的期望转化体。获得了来自转化反应的氯霉素敏感分离株，此反应中PA710或PA714染色体DNA用作供体。保存在试管培养试验中产生最高泛酸滴度的分离株。这些菌株分别命名为PA717和PA721。重复两次进行新菌株以及PA824和PA715的试管培养，菌株生长在SVY+10g/L门冬氨酸中，43℃培养48小时后测试泛酸、HMBPA和β-丙氨酸。此外，对每一菌株的提取物进行SDS-PAGE胶实验。试管培养试验的结果在表2中显示。
表2.培养在加有10g/L门冬氨酸的SVY中的PA717和PA72l菌株的泛酸产量
如预期，每一新菌株产生的泛酸和β-丙氨酸均多于PA715。两个菌株(PA717-24和PA721-39)与PA824产生的泛酸大约相同，而PA721-35产生的泛酸多于PA824。所有三个新菌株产生的HMBPA均少于PA824。蛋白质凝胶分析显示三个新菌株产生的PanB均多于任何一个对照菌株。
菌株PA717-24、PA721-35和PA721-39也在基于豆粉的培养基中在摇瓶培养中进行了评价。如在表3中显示，这些具有可扩增的P26panBpanD盒子的菌株产生的泛酸和HMBPA的水平与同时含有独立的可扩增P26panB和P26panD盒子的PA668-2和PA668-24菌株中观察到的水平类似。
表3.摇瓶实验48小时
条件40ml培养基/200ml带挡板的摇瓶、4X生物防护盖(Bioshield covers)、300rpm、2.5％接种物(1.0ml)。
大豆培养基20g/l Cargill 200/20豆粉、8g/l(NH4)2SO4、5g/l谷氨酸盐、1×PSTE、0.1M磷酸盐pH 7.2和0.3M MOPS pH 7.2。60g/l葡萄糖或麦芽糖w/10mM镁和1.4mM钙。
重复两次试验的烧瓶的平均值。
除了产生泛酸(以及其他在图1和本文中描述的类泛酸化合物)，已经证明某些用于生产商用数量的期望类泛酸化合物的工程化菌株也产生鉴定为3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的副产物(此处也称为“β-丙氨酸2-(R)-羟基异戊酸”、“β-丙氨酸2-羟基异戊酸”、“β-丙氨酰-α-羟基异戊酸”和/或“fantothenate”)。(术语“fantothenate”本文中也简写为“fan”。)。
HMBPA是[R]-α-羟基异戊酸(α-HIV)和β-丙氨酸的缩合产物，由PanC酶催化产生。α-HIV是α-KIV还原产生的，该反应是由α-酮还原酶PanE(如，PanE1和/或PanE2)和/或IlvC催化的反应。由此提出，在微生物中存在至少两个途径竞争α-KIV(生物合成酶PanB的底物)，这两个途径即泛酸生物合成途径和HMBPA生物合成途径。(竞争α-KIV的第三个和第四个途径是导致从α-KIV产生缬氨酸或亮氨酸的途径，如见图1)。泛酸生物合成途径和HMBPA生物合成途径至少还产生竞争酶PanC的底物，即α-HIV和泛解酸。HMBPA的产生可能对泛酸的产生有显著影响。例如，HMBPA途径可以与泛酸途径竞争前体(α-KIV和β-丙氨酸)和一些酶(PanC，PanD，PanE1和/或IlvC)。另外，因为HMBPA的结构与泛酸的结构相似，它可能具有负面调节泛酸途径中的一个或多个步骤的不受欢迎的性能。基于HMBPA的鉴定，美国临时专利申请系列No.60/262,995教导了，使泛酸生物合成过程与HMBPA生物合成过程相比能更有利地利用底物(α-KIV和β-丙氨酸)和/或酶(PanC，PanD，PanE1和/或IlvC)的任何方法均可改进或优化泛酸的制备。
实施例II通过增加丝氨酸利用度提高泛酸产量至少一种优化泛酸生产的方法涉及调节微生物培养物中的丝氨酸的利用度。特别是，可以证实，增加丝氨酸的利用度可导致泛酸产量的提高(如相对于HMBPA的生产)，而降低丝氨酸的利用度可导致泛酸的生产相对于HMBPA的生产有所降低。该方法基于这样的理解，即源自丝氨酸的化合物一亚甲基四氢叶酸(MTF)在泛酸生物合成反应中将其羟甲基基团交给α-KIV以产生酮泛解酸(如参见图1和2)。这样，调节丝氨酸水平是调节酮泛解酸水平的一个有效方法，而这又可以调节在适宜的工程化微生物中泛解酸和/或泛酸的生产。为证实该调节作用，将PA824在试管培养基中43℃培养48小时，所述培养基为SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸和±5g/L的丝氨酸。
表4加入或不加入丝氨酸时PA824的泛酸和HMBPA产量
如表4中显示的数据所证实，丝氨酸的加入增加了泛酸的生产水平(而相反降低了HMBP的产量)。
实施例III.改造细菌细胞以增加丝氨酸羟甲基转移酶(glyA基因产物)的量作为饲喂丝氨酸的备选方案，提高丝氨酸水平和/或丝氨酸利用水平(且相应地，亚甲基四氢叶酸水平)以调节泛酸生产水平的另一方法是增加3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸羟甲基转移酶(分别为serA和glyA基因产物)的合成或活性，以由此增加在适宜的工程化微生物中的丝氨酸和亚甲基四氢叶酸的生物合成。
通过用含枯草芽孢杆菌glyA基因的表达盒子转化枯草芽孢杆菌细胞来增强glyA基因的表达，在盒子中所述基因克隆在强组成型启动子的下游。为构建此表达盒子，用在表5中描述的引物RY417和RY418通过PCR从分离自枯草芽孢杆菌PY79的染色体DNA中扩增glyA基因。
表5用于扩增枯草芽孢杆菌的glyA和serA的引物
RY417含有的RBS2合成核糖体结合位点正好位于XbaI位点的下游。然后，用XbaI和BamHI切割扩增的DNA并克隆在载体pAN004(图5)的XbaI和BamHI位点之间，以生成质粒pAN396(图6；SEQ ID NO24)。pAN004载体在紧接XbaI克隆位点的上游含有噬菌体SP01 P26启动子以驱动克隆的glyA基因的表达。恰在表达盒子的下游，pAN396含有可以在枯草芽孢杆菌中行使功能的cat基因。为转化枯草芽孢杆菌，从pAN396中分离含P26glyA盒子和cat基因的N0tI DNA片段、使其自连接并转化导入枯草芽孢杆菌PY79感受态细胞中。筛选出几株氯霉素抗性转化体并命名为PA1007和PA1008。从每个菌株中分离染色体DNA并用于转化PA721B-39和PA824感受态细胞以分别产生PA1011和PA1014菌株。对筛选的PA1011和PA1014分离株的细胞提取物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，证实这些菌株与其亲本菌株PA721B-39(实施例I中描述)和PA824(在国际公布No.WO 01/21772中描述)相比含有数量增加的glyA基因产物。为试验增强glyA表达对泛酸生产的影响，PA1011和PA1014在试管培养基(培养基为SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸)中在43℃培养48小时。如表6中提供的数据所显示，PA1014的泛酸产量(4.5g/L)多于其亲本菌株PA824的产量(3.2g/L)。同样，PA1011的平均泛酸产量(4.35g/L)也多于其亲本菌株PA721B-39的产量(4.05g/L)。
表6.比较PA1011和PA1014与PA721B-39和PA824的泛酸和HMBPA产量.
实施例IV.改造细菌细胞以提高其3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA基因产物)量。
serA基因产物3-磷酸甘油酸脱氢酶为丝氨酸生物合成途径中第一个发挥作用的酶(参见图2)。由于丝氨酸为MTF合成的底物之一，我们改造了serA基因使其过表达以增加细胞内的丝氨酸水平。与实施例III中描述的用于glyA基因的方法类似，通过用含枯草芽孢杆菌serA基因的表达盒子(盒中该基因克隆在强组成型启动子下游)转化枯草芽孢杆菌细胞来增强serA基因的表达。为构建表达盒子，用表5中描述的引物RY405和RY406通过PCR从分离自枯草芽孢杆菌PY79的染色体DNA中扩增serA基因。然后用XbaI和BamHI切割扩增的DNA并克隆到载体pAN004(图5)的XbaI和BamHI位点之间，以生成质粒pAN393(图7，SEQ ID NO25)。为转化枯草芽孢杆菌，从pAN393中分离含P26serA盒子和cat基因的NotIDNA片段、自连接并转化导入枯草芽孢杆菌PY79感受态细胞中。筛选出几株氯霉素抗性转化体并命名为PA1004和PA1005。从每个菌株中分离染色体DNA并用于转化PA721B-39和PA824感受态细胞以分别产生PA1010和PA1013菌株。对筛选的PA1010和PA1013分离株的细胞提取物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，证实这些菌株与其亲本菌株PA721B-39和PA824相比含有数量增加的serA基因产物。
为试验增强serA表达对泛酸生产的影响，将PA1010和PA1013在试管培养基(此培养基为SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸)中43℃培养48小时。如表7中提供的数据所显示，PA1010的平均泛酸产量(4.7g/L)多于其亲本菌株PA721B-39的产量(4.1g/L)。同样，PA1013的平均泛酸产量(4.1g/L)多于其亲本菌株PA824的产量(3.1g/L)。
表7.比较PA1010和PA1013与PA721B-39和PA824的泛酸和HMBPA产量.
实施例V.应用serA和glyA表达增强的菌株进行的摇瓶和发酵罐实验。
基于试管试验的结果，选择具有可扩增的serA盒子的两菌株和具有可扩增的gly盒子的两菌株，其各来自亲本菌株PA824和PA721B-39。四株菌与亲本一道在摇瓶中培养(表8)。在大豆面粉MOPS葡萄糖(SMG)培养基中，四株菌产生的泛酸均多于其亲本菌株。在大豆面粉MOPS麦芽糖(SMM)培养基中，四株菌中的一株表现出优于其亲本株。
来自各自亲本的serA过表达株和glyA过表达株在10升的Chemap台式发酵罐中同时培养。glyA过表达株PA1014-3(来源于PA824)在SMM中产生的泛酸滴度最高，而在发酵罐中也有最佳表现(表9)。在36小时，菌株PA1014-3的培养物上清中的泛酸产量为71g/l且在48小时培养物上清中的泛酸产量为86g/l，与之比较其亲本PA824的产量分别为41g/l和46g/l。serA菌株PA1012-4的培养物上清中的泛酸产量也显著高于PA824对照，在36和48小时时分别为52g/l和60g/l。这些结果清楚地证明增加glyA和serA的有效性。
PA721B-39的serA过表达和glyA过表达衍生物也明显地较其亲本有所改进。二者培养48小时后在培养物上清中均产生约80g/l的泛酸(分别为82g/l和79g/l)。相对于PA824衍生物，PA721B-39衍生物中提高的PanB水平的效应亦显示在HMBPA的减少上。PA721B-39和其衍生物48小时后产生的HMBPA低于PA824或甚至低于PA668-24。增加GlyA也表现出可减少碳流向HMBPA。
表8.摇瓶生产评价过表达serA或glyA的泛酸生产菌株
所有数据为两次重复试验摇瓶培养物48小时后的平均值。
条件40ml培养基/200ml带挡板的摇瓶，4X生物防护盖，300rpm，2.5％的接种物及43℃培养。
培养基20g/Cargill 200/20豆粉，1×PSTE，8g/l(NH4)2SO4和5g/l谷氨酸盐。
缓冲液0.1M磷酸盐pH7.2以及0.3M MOPS pH7.2。
碳源(单独灭菌，作为20倍贮液)60g/l葡萄糖或麦芽糖w/10mM镁和1.4mM钙。
表9.过表达serA或glyA的泛酸生产菌株用10升发酵罐评价。
应用的培养基为PFM-222。除以下的变化外与在美国系列No.60/262,995(2001年1月19日提交)中描述的PFM-155培养基相同，所述的变化为(1)在分批材料中没有Amberex 1003。Cargill 200/20(豆粉)40g/L已改变为Cargill 20-80(大豆粗磨粉)50g/L，MgSO4·7H2O替换为MgCl2·7H2O，1g/L，且SM-1000X替换为PSTE-1000X(PSTE-1000X＝MnCl2·4H2O，2.0g/L；ZnSO4·7H2O，1.5g/L；CoCl2·6H2O，2.0g/L；CuSO4·5H2O，0.25g/L；Na2MoO4·2H2O，0.75g/L)。在补料材料中SM-1000X替换为PSTE-1000X。
提高泛酸产量也可在单一菌株中组合过表达serA和glyA来实现，和/或通过引入突变来实现，所述突变导致serA或glyA或二者均抵抗反馈作用。
实施例VI.通过突变purR基因提高glyA基因的表达如实施例III和V所述，glyA基因的表达可通过添加其中glyA基因由强组成型启动子驱动的一个或多个拷贝的表达盒提高。提高glyA表达的替代方法是改变对其的调节。描述glyA∷lacZ融合物的文献提示glyA启动子在正常条件下是中等强度的(约400Miller单位)，但是如果其负调控因子purR基因缺失的话，该启动子能够被诱导至相对的高水平(1,800 Miller单位)(Saxild等(2001)J.Bacteriol.1836175-6183)。因此，进行实验以确定是否glyA的表达以及由此泛酸产量可通过缺失泛酸生产菌株中的purR而得以提高。
由PY79染色体DNA通过PCR扩增枯草芽孢杆菌purR基因，并将所得片断克隆到PvuII切割的pGEM5-Zf(+)载体DNA中，以产生质粒pAN835F(SEQ ID NO26，图8)。这个步骤消除了插入物两端的PvuII位点，留下位于purR开放读框中间的唯一的PvuII位点。下一步，将来自pAN363F(SEQ ID NO27)的含革兰氏阳性卡那霉素抗性基因的平端PCRDNA片断连接到pAN835F的此唯一PvuII位点中，以产生pAN838F(SEQID NO28，图9)。
然后将pAN838F转化到PY79、PA668-24和PA824中，以10mg/l进行卡那霉素抗性选择，产生新的菌株系列，分别命名为PA1059、PA1060和PA1061。通过PCR证明所有新分离菌株均含有由双交换事件所预期的被破坏的purR∷kan等位基因。对几个PA1060和PA1061分离株在生长于SVY葡萄糖+β-丙氨酸的试管培养物中进行了泛酸产量测试(表10)。衍生自PA668-24的最佳分离株PA1060-2和PA1060-4分别将3.0g/l泛酸提高到5.3至5.1g/l，这是75％的提高。同样地，衍生自PA824的最佳分离株PA1061-1和PA1061-2将泛酸产量从约3.1g/l提高到5.4g/l，也是75％的增长。这些结果提示glyA基因在这些菌株中通过purR基因的破坏而得以被充分诱导。或者，PA1060和PA1061中泛酸产量的提高可能是由于更为复杂的多效作用引起。在任何情况下，解除purR调节子的调控作用对泛酸生产均具有正面效果。
在其它实施方案中，可以在其它泛酸生产菌株中实施purR破坏，例如那些具有整合的P26serA等位基因或者不止一个拷贝的P26panBCD操纵子的菌株。purR基因也可用作为添加期望的表达盒如P26panB的位点。也可以利用对鸟嘌呤类似物例如8-氮杂鸟嘌呤的抗性作为对purR突变的选择方法。
表10.在于SVY葡萄糖+5g/lβ-丙氨酸中生长的试管培养物中含破坏的purR的PA824和PA668-24衍生物的泛酸和fantothenate产量
b.d.＝检测不到*接种菌落所取自的培养皿中的抗生素浓度实施例VII.由非扩增型盒过表达serA基因本实施例描述了提高丝氨酸产量的另一种方法，其中一个两步操作将强组成型启动子(P26)置于染色体serA基因的前面。构建了两个质粒，分别含有来自天然serA基因紧上游区域的大约700个碱基对的DNA序列。第一个质粒pAN821也含有serA编码区的3’部分，并且在前述两序列之间含有卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO30，图10)。当转化入枯草芽孢杆菌中时，进行卡那霉素抗性选择，pAN821将引起serA基因被破坏，导致丝氨酸营养缺陷型。这产生了称之为ΔserA∷kan等位基因的遗传序列。
被设计用于引入P26serA结构的第二个质粒，通过在pAN395中在P26启动子5’端插入serA上游序列构建。所得质粒pAN824示于图11(SEQ IDNO31)。质粒pAN395类似于实施例IV中所述的pAN393。serA基因的开放读框利用枯草芽孢杆菌PY79DNA作为模板通过PCR合成。上游引物含XbaI位点和中等强度的合成核糖体结合位点RBS2。下游引物含BamHI位点。该serA开放读框被用来取代中等拷贝质粒pAN006中的panBCD基因，以产生pAN395(SEQ ID NO29，图12)。该质粒含有自P26启动子表达的serA基因和RBS2核糖体结合位点。
将来自pAN821的ΔserA∷kan等位基因引入到菌株PA824中以产生PA1026。如预期的那样，PA1026在基本培养基中不生长。在第二步中，将来自质粒pAN824的P26serA盒引入到PA1026中，进行丝氨酸原养型选择，产生PA1028。几个PA1028分离株通过诊断性PCR证实具有预期的染色体结构(P26serA)。然后对这些分离株在于SVY+5g/lβ-丙氨酸中生长48小时的试管培养物中进行泛酸产量测试(表11)。PA1028分离株(衍生自PA824)使泛酸产量提高10％到25％。如表12所示，在摇瓶实验中，PA824产生大约7g/l泛酸，而PA1028产生11g/l。
实施例VIII.构建含整合的非扩增型P26serA盒以及扩增型P26glyA盒的泛酸生产菌株因为整合在serA处的非扩增型P26serA盒导致更高的泛酸合成(参见例如表12)，并且因为glyA处的氯霉素扩增型P26glyA盒导致高得多的泛酸合成(参见例如PA1014-3，表8)，我们提出将两者组合可能具协同作用。菌株PA1028-4为PA824的衍生物，其含整合在serA处的非扩增型P26serA盒，利用来自PA1014-3的染色体DNA进行转化以获得5mg/l的氯霉素抗性，产生命名为PA1038的菌株系列，现在这些菌株含有氯霉素可扩增的P26glyA盒子。利用在SVY+β-丙氨酸中生长的标准试管培养物对PA1038分离株进行泛酸产量测试(表13)。如预期的那样，PA1038的泛酸产量表现出显著提高，由PA824的约4.2g/l到PA1038组的6.6至7.5g/l。如表12所示对PA1038-3和PA1038-12分离株进一步在摇瓶中进行了测试。两者都产生平均13.6g/l的泛酸，相比之下PA824产生7.4g/l的泛酸。
表11.于SVY+5g/lβ-丙氨酸中生长48小时的试管培养物中，在serA基因座含单拷贝P26serA的PA824衍生物的泛酸和fantothenate产量
b.d.＝检测不到表12.过表达serA和/或glyA的泛酸生产菌株的摇瓶评价
所有数据为一式双份摇瓶培养物48小时后的平均值。
条件40ml培养基/200ml挡板式摇瓶，4X Bioshield covers，300rpm，2.5％接种物及43℃。
接种物SVY基w/麦芽糖43℃24小时。
培养基20g/l Cargill 200/20大豆粉，8g/l(NH4)2SO4，5g/l谷氨酸盐及1xPSTE。
缓冲液0.1M磷酸盐pH 7.2和0.3M MOPS pH 7.2。
碳源(作为20X贮液单独灭菌)30g/l麦芽糖，5mM MgCl2和0.7mM CaCl2。
表13.在serA处含非扩增型P26serA盒、而在glyA处含扩增型P26glyA盒的PA824衍生物PA1038的泛酸产量
试管培养物使用SVY葡萄糖+5g/lβ-丙氨酸在43℃培养48小时。
实施例IX.通过改变甘氨酸裂解途径提高MTF产量如上述实施例所证明的那样，提高细菌中的MTF产量可以提高已通过操纵panBCD和/或panE基因而被工程化以产生更多泛酸的菌株的泛酸产量。已证明泛酸产量可通过提高glyA或serA基因的表达而得以提高。如实施例III到V以及VII到VIII所证明的那样，可利用更强的启动子或核糖体结合位点来提高glyA或serA的表达。备选地，如实施例VI所举例说明的那样，芽孢杆菌中glyA基因的表达可通过破坏purR阻遏基因而去调节。
提高MTF产量的另一种方法是增强甘氨酸裂解途径中的酶的表达。例如，由gcvT、gcvPA、gcvPB、gcvH及pdhD基因编码的酶催化甘氨酸裂解为MTF、CO2和NH3。强组成型启动子例如之前描述过的SP01噬菌体P26启动子，可克隆到gcvT-gcvPA-gcvPB操纵子前或者gcvH或pdhD基因的前面以增强其表达。除上述方法以外，可额外向培养基中添加便宜的甘氨酸，以进一步提高如本文所述工程化的任何菌株的MTF产量。
等同方案 本领域技术人员将认识到，或只需使用常规试验即能够确定本文所述的本发明具体实施方案的很多等同方案。这些等同方案旨在包括在下列权利要求中。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>用于提高泛酸产量的微生物和方法<130>BGI-154PC2<150>60/393826<151>2002-07-03<160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>194<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述启动子序列<220>
<221>-35_signal<222>(136)..(141)<220>
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<223>人工序列的描述启动子序列<220>
<221>-35_signal<222>(113)..(118)<220>
<221>-10_signal<222>(136)..(141)<400>2gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc 60tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt 120atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc 163<210>3<211>127<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述启动子序列<220>
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<221>-10_signal<222>(98)..(103)<400>3gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat 60aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga 120tgcaatg 127<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖体结合位点<400>4taaacagag gaggagaaaa catg 24<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖体结合位点<400>5attcgagaaa tggagagaat ataatatg28<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖体结合位点<400>6agaaaggagg tga13
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<223>人工序列的描述核糖体结合位点<220>
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<223>人工序列的描述核糖体结合位点<220>
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<223>人工序列的描述核糖体结合位点<220>
<221>misc_feature<222>14，15，16，17，18，19，20<223>n＝a，c，t，或g<400>9agaaaggagg tgannnnnnn atg 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖体结合位点<220>
<221>misc_feature<222>14，15，16，17，18，19<223>n＝a，c，t，或g
<400>10agaaaggagg tgannnnnna tg 22<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖体结合位点<400>11ccctctagaa ggaggagaaa acatg25<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<2l0>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述核糖体结合位点<400>19attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28<210>20<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5′PCR引物<223>针对serA基因<400>20ccctctagag gaggagaaaa catgtttcga gtattggtct cagacaaaat g 51<210>21<211>43<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述3′PCR引物<223>针对serA基因<400>21cccggatcca attatggcag atcaatgagc ttcacagaca caa 43<210>22<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5′PCR引物<223>针对glyA基因<400>22ggatctagag gaggtgtaaa catgaaacat ttacctgcgc aagacgaa 48<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3′PCR引物<223>针对glyA基因<400>23cggggatccc ccatcaacaa ttacacactt ctattgattc tac 43<210>24<211>7926<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述serA过表达<223>质粒<400>24gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020tatcttgata ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080ggccatccgt caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140ctgcccgcca ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200tcctactcag gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260
actgagcctt tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg gggagacccc 1320acactaccat cggcgctacg gcgtttcact tctgagttcg gcatggggtc aggtgggacc 1380accgcgctac tgccgccagg caaattctgt tttatcagac cgcttctgcg ttctgattta 1440atctgtatca ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac aggatccaat tatggcagat 1500caatgagctt cacagacaca atatcaggga catttgttag ttctttcaca attttatctt 1560ccagatgtct gtcaaaggaa agcatcatga tggcttctcc gcctttttcc ttacggccaa 1620cctgcatagt tgcaatgtta atatcattat ctccgagaat acgtcctact cggccgatga 1680cacctgttgt atcttgatgc tggatataca ccaagtgacc agtcggataa aaatcaatat 1740taaatccatt gatctcgaca attcgttctc cgaaatgagg aatatacgta gccgttacag 1800taaaggtgct gcggtctcct gtcactttta cgctgatgca gttatcgtat ccagattcag 1860aagaggaaat tttttcactg aagctaatgc cgcgttcttt tgcgacaccc ccggcattga 1920cctcattaac agtagagtct acgcgcggtt ttaaaaagcc tgacagaagg gcttttgtaa 1980tgaacgatgt ttcaagttta gcaattgtgc cttcatattg aatggcaaca tcctgtactg 2040gttctttcat gcactgtgat acaaggctgc caatttttcc tgcaatttga tggtaaggct 2100taattttagc aaattcatct tttgtcatgg caggcaggtt gatagctgac atgacaggca 2160ggccttttgc gaactgcaga acttcttctg acacttgggc ggcgacattg agctgtgctt 2220ctttcgttga tgctcccaag tgaggagtgg caatgactaa tggatgatca acaagtttgt 2280tgtcaactgg cggttcgact tcgaaaacgt caagcgctgc tcccgcaaca tgcccgtttt 2340ccaaagcttc gagaagtgct gcttcatcga taattccgcc tcgcgcacag ttaattaagc 2400gaacgccttt tttcgttttt gcaatcgttt ctttattcaa taagcctttt gtttcttttg 2460ttaaaggcgt gtgaacggta atgatatccg cactttcaag cacttcttca aatgtacggc 2520tgtttacgcc gatttttttc gctctttctt ccgttaagaa aggatcaaaa acgtgcacag 2580tcataccgaa cgctcctcga cgctgtgcaa tttcacttcc gattcggcct aatcctacaa 2640taccaagcgt ttttccataa agctctgaac cgacataagc tgtgcggttc cactctctgg 2700atttcactga gatattagcc tgcggaatgt gtctcattaa agaagagatc attgcaaatg 2760tatgctcagc tgtcgaaatg gtgttgccgt tcggagcatt gatcacgatt accccgtgtt 2820tcgtagcctc atcaatatcg atattatcga caccgacacc ggctcttccg acaattttta 2880aagaagtcat tttgttgaaa aggtcttctg ttacttttgt cgcgcttcgc accaaaagag 2940catcaaaagt atgtaattca tcttctgcat ctgctacgtt tttttgaacg atttcaataa 3000agtctgattc aataagtggc tgtaaaccgt cgttgctcat tttgtctgag accaatactc 3060gaaacatgtt ttctcctcct ctagagcgtc ctgctgttgt taagattatt ataccacacc 3120ttgtagataa agtcaacaac tttttgcaaa atttttcagg aattttagca gaggttgttc 3180tggatgtaga acaaaacatc tttccgctct tgtgctgtta ggatatcttt cttggaagct 3240aggtaggcct cgagttatgg cagttggtta aaaggaaaca aaaagaccgt tttcacacaa 3300aacggtcttt ttcgatttct ttttacagtc acagccactt ttgcaaaaac cggacagctt 3360catgccttat aactgctgtt tcggtcgaca agcttcgcga agcggccgca aaattcactg 3420gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3480gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3540tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3600catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3660gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg actatgcttg taaaccgttt 3720tgtgaaaaaa tttttaaaat aaaaaagggg acctctaggg tccccaatta attagtaata 3780taatctatta aaggtcattc aaaaggtcat ccaccggatc agcttagtaa agccctcgct 3840agattttaat gcggatgttg cgattacttc gccaactatt gcgataacaa gaaaaagcca 3900gcctttcatg atatatctcc caatttgtgt agggcttatt atgcacgctt aaaaataata 3960aaagcagact tgacctgata gtttggctgt gagcaattat gtgcttagtg catctaacgc 4020ttgagttaag ccgcgccgcg aagcggcgtc ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc 4080cgactacctt ggtgatctcg cctttcacgt agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc 4140gcgaggccaa gcgatcttct tcttgtccaa gataagcctg tctagcttca agtatgacgg 4200gctgatactg ggccggcagg cgctccattg cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga 4260ttttgccggt tactgcgctg taccaaatgc gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat 4320cgccagccca gtcgggcggc gagttccata gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata 4380gatcctgttc aggaaccgga tcaaagagtt cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc 4440tatgttctct tgcttttgtc agcaagatag ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga 4500agatacctgc aagaatgtca ttgcgctgcc attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg 4560gataacgcca cggaatgatg tcgtcgtgca caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa 4620tctcgctctc tccaggggaa gccgaagttt ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg 4680ttgtttcatc aagccttacg gtcaccgtaa ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca 4740ggccgccatc cactgcggag ccgtacaaat gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc 4800gctcgatgac gccaactacc tctgatagtt gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc 4860tcatgatgtt taactttgtt ttagggcgac tgccctgctg cgtaacatcg ttgctgctcc 4920ataacatcaa acatcgaccc acggcgtaac gcgcttgctg cttggatgcc cgaggcatag 4980actgtacccc aaaaaaacag tcataacaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac 5040cgctgcgttc ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgagcg catacgctac ttgcattaca 5100gcttacgaac cgaacaggct tatgtccact gggttcgtgc cttcatccgt ttccacggtg 5160tgcgtcaccc ggcaaccttg ggcagcagcg aagtcgaggc atttctgtcc tggctggcga 5220acgagcgcaa ggtttcggtc tccacgcatc gtcaggcatt ggcggccttg ctgttcttct 5280
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<223>人工序列的描述glyA过表达<223>质粒<400>25gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480
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权利要求
1.用于提高泛酸产量的方法，包括在使泛酸产量提高的条件下培养具有去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径的微生物。
2.用于提高泛酸产量的方法，包括在使泛酸产量提高的条件下培养微生物，所述微生物具有(i)去调节的泛酸生物合成途径，和(ii)去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径。
3.权利要求2的方法，其中所述微生物具有至少两个去调节的泛酸生物合成酶。
4.权利要求2的方法，其中所述微生物具有至少三个去调节的泛酸生物合成酶。
5.权利要求2的方法，其中所述微生物具有至少四个去调节的泛酸生物合成酶。
6.权利要求5的方法，其中所述微生物具有去调节的酮泛解酸羟甲基转移酶、去调节的酮泛解酸还原酶、去调节的泛酸合成酶和去调节的门冬氨酸-α-脱羧酶。
7.权利要求1到6任何一项的方法，其中所述微生物还具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径。
8.权利要求7的方法，其中所述微生物具有至少两个去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶。
9.权利要求7的方法，其中所述微生物具有至少三个去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶。
10.权利要求9的方法，其中所述微生物具有去调节的乙酰羟酸合成酶、去调节的乙酰羟酸异构还原酶和去调节的二羟酸脱水酶。
11.权利要求1到10任何一项的方法，其中微生物具有至少一个去调节的MTF生物合成酶。
12.权利要求11的方法，其中微生物具有去调节的glyA基因。
13.权利要求11的方法，其中微生物具有去调节的serA基因。
14.权利要求11的方法，其中微生物具有去调节的glyA基因和去调节的serA基因。
15.权利要求12或14的方法，其中微生物具有突变、缺失或破坏了的purR基因。
16.用于提高泛酸产量的方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径、去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径和去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径的微生物，其中所述去调节致使泛酸产量得以提高。
17.生产泛酸的方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径、去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径和去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径的微生物，使得在培养该微生物36小时后泛酸产量至少为50g/L。
18.权利要求17的方法，包括培养所述微生物使得在培养该微生物36小时后泛酸的产量至少为60g/L。
19.权利要求17的方法，包括培养所述微生物使得在培养该微生物36小时后泛酸的产量至少为70g/L。
20.用于生产泛酸的方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径、去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径和去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径的微生物，从而使得在培养该微生物48小时后泛酸的产量至少为60g/L。
21.权利要求20的方法，包括培养所述微生物使得在培养该微生物48小时后泛酸的产量至少为70g/L。
22.权利要求20的方法，包括培养所述微生物使得在培养该微生物48小时后泛酸的产量至少为80g/L。
23.前述任何一项权利要求的方法，其中通过调节泛酸激酶的活性进一步提高泛酸的产量。
24.权利要求23的方法，其中泛酸激酶的活性被降低。
25.权利要求24的方法，其中缺失CoaA并下调CoaX。
26.权利要求24的方法，其中缺失CoaX并下调CoaA。
27.权利要求24的方法，其中CoaX和CoaA均被下调。
28.以上任何一项权利要求的方法，其中所述微生物在丝氨酸过量的条件下培养。
29.用于生产泛酸的方法，包括在丝氨酸过量的条件下培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物，使泛酸产生。
30.以上任何一项权利要求的方法，其中所述微生物的泛酸生物合成途径被去调节以致泛酸的产生不依赖于β-丙氨酸的饲喂。
31.以上任何一项权利要求的方法，其中微生物为革兰氏阳性微生物。
32.以上任何一项权利要求的方法，其中微生物为芽孢杆菌属微生物。
33.以上任何一项权利要求的方法，其中微生物为枯草芽孢杆菌。
34.根据以上任何一项权利要求的方法合成的产物。
35.包含根据以上任何一项权利要求的方法生产的泛酸的组合物。
36.用于提高泛酸产量的重组微生物，所述微生物具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径。
37.用于提高泛酸产量的重组微生物，所述微生物具有去调节的泛酸生物合成途径、去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径。
38.权利要求36或37的微生物，其还具有降低的泛酸激酶活性。
39.权利要求36-38任何一项的微生物，所述微生物为革兰氏阳性微生物。
40.权利要求36-38任何一项的微生物，所述微生物属于芽孢杆菌属。
41.权利要求36-38任何一项的微生物，所述微生物为枯草芽孢杆菌。
42.用于生产泛酸的方法，包括在致使微生物于培养36小时后产生至少30g/l泛酸的条件下培养重组微生物，其中所述重组微生物具有(a)去调节的panB基因；(b)去调节的panD基因；和(c)至少一个去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶编码基因。
43.权利要求42的方法，其中所述微生物还具有去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径，且所述微生物在可使微生物于培养36小时后产生至少50g/l泛酸的条件下培养。
44.用于生产泛酸的方法，包括在丝氨酸过量的条件下培养具有如下基因的重组微生物(a)去调节的panB基因；和(b)去调节的panD基因；从而在微生物培养36小时后产生至少50g/l泛酸。
45.用于生产泛酸的方法，包括在缬氨酸过量的条件下培养具有如下基因的重组微生物(a)去调节的panB基因；(b)去调节的panD基因；和(c)去调节的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成途径；从而在微生物培养36小时后产生至少50g/l泛酸。
46.用于生产泛酸的方法，包括在缬氨酸过量的条件下培养具有如下基因的重组微生物(a)去调节的panB基因；(b)去调节的panD基因；和(c)去调节的glyA基因；从而在微生物培养36小时后产生至少50g/l泛酸。
47.用于生产泛酸的方法，包括在缬氨酸过量的条件下培养具有如下基因的重组微生物(a)去调节的panB基因；(b)去调节的panD基因；和(c)突变、缺失或破坏了的purR基因；从而在微生物培养36小时后产生至少50g/l泛酸。
48.用于生产泛酸的方法，包括在缬氨酸过量的条件下培养具有如下基因的重组微生物(a)去调节的panB基因；(b)去调节的panD基因；和(c)去调节的serA基因；从而在微生物培养36小时后产生至少50g/l泛酸。
49.用于生产泛酸的方法，包括在缬氨酸过量的条件下培养具有如下基因的重组微生物(a)去调节的panB基因；(b)去调节的panD基因；(c)去调节的serA基因；(d)去调节的glyA基因；从而在微生物培养36小时后产生至少50g/l泛酸。
全文摘要
本发明公开了利用具有修饰的泛酸生物合成酶活性以及具有修饰的亚甲基四氢叶酸(MTF)生物合成酶活性的微生物提高泛解酸和泛酸产量的改良方法。尤其是，本发明公开了通过增加直接或间接有助于关键性中间体酮泛解酸合成的酶或底物藉以提高酮泛解酸的水平，从而来提高期望产品的产量的方法。也公开了重组微生物和用于培养所述微生物的条件。此外还公开了由此类微生物产生的组合物。
文档编号C12N1/21GK1788089SQ03815784
公开日2006年6月14日 申请日期2003年7月3日 优先权日2002年7月3日
发明者R·R·约卡姆, T·A·帕特森, J·G·佩罗, T·赫尔曼 申请人:巴斯福股份公司