专利名称：药物试剂的递送系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物试剂的递送系统。所述递送系统包含脂质体，所述脂质体其内腔包含将要递送的药物试剂，而其外部表面连接细胞粘附分子NCAM或其片段。
背景技术：
脂质体已经广泛用于向细胞递送多种材料，例如治疗性药物和DNA。为了将包裹的材料靶向递送至特定细胞类型，已经开发了多种脂质体修饰方法。在一种方法中，将结合靶细胞的细胞表面分子ICAM-1(细胞间粘附分子-1)的粘附肽连接在脂质体表面(Jaafari MR、Foldvari M，J.Pharm.Sci.，91(2)396-404，2002)。在另一个方法中，通过单克隆抗体的手段在体外将阳离子脂质体靶向特定肿瘤细胞(Kao GY等人，Cancer Gene Ther.，3(4)250-6，1996)。
至今知道的基于脂质体的递送系统存在一个主要缺点，即它们不能向细胞有效递送药物试剂。
因此，需要用于药物试剂的基于脂质体的候选递送系统。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供用于胞内递送药物试剂的系统，其中所述系统包含脂质体，所述脂质体其内腔包含药物试剂，而其外部表面连接细胞粘附分子NCAM(神经细胞粘附分子)或其片段。
在本发明的一个优选实施方案中，所述NCAM片段包含IG(免疫球蛋白)环结构域I、II、和III。
在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞粘附分子通过跨膜结构域或疏水锚分子(如GPI锚)或者通过细胞粘附分子的异戊二烯化而连接至所述脂质体的所述外部表面，所述锚分子容许细胞粘附蛋白束缚在脂双层上。
本领域熟练技术人员知道用于生成脂质体的方法，描述于例如《Liposomes a practical approach》，RRC新版，牛津大学出版社的IRL出版社，1990年。
术语“细胞粘附分子”在用于本文时至少涵盖由其天然来源分离的细胞粘附分子、通过重组技术生成的细胞粘附分子、和通过体外肽合成法生成的细胞粘附分子及其片段。
术语药物试剂在用于本文时涵盖在生物系统中发挥作用的所有类型的化学化合物。用于本发明的优选药物试剂是选自下组的分子DNA、RNA、寡核苷酸、多肽、肽、抗肿瘤试剂、激素、维生素、酶、抗病毒剂、抗生素、抗炎药、抗原生动物药、抗风湿药、放射性化合物、抗体、前药、及其组合。
在本发明的一个优选实施方案中，所述药物试剂是DNA，优选可操作连接基因表达构建物的cDNA，所述表达构建物容许所述cDNA的表达，更优选的所述cDNA编码功能性蛋白质。通常，表达构建物包含在宿主细胞中实现表达所需要的调控序列，而且它可以包含质粒复制所需要的必需序列，从而使质粒以游离体的状态存在，或者可以根据染色体整合的要求进行设计。术语调控序列在用于本文时涵盖来自从所述表达构建物待表达的基因的天然调控序列和异源调控序列两种。本领域熟练技术人员知道这些表达构建物的构建，描述于例如Sambrook等人，《MolecularCloningA Laboratory Manual》，纽约，冷泉港实验室，2001年。
当所述表达构建物意欲进行染色体整合时，优选通过在表达构建物中包含能够被瞬时表达的转座酶识别的顺式元件来实现进入宿主基因组的整合，所述转座酶例如为“Sleeping Beauty”。可以通过在递送系统中包含相关mRNA而暂时表达转座酶。意欲进行染色体整合的所述表达构建物优选包含在随机整合后预防转录沉默的顺式元件。
在一个更为优选的实施方案中，所述DNA构建物设计成选择性整合到宿主细胞基因组中。为此目的，优选使用φ噬菌体C31的整合酶(Ortiz-Urda S等人，Nat.Med.，8(10)1166-70，2002)。在使用φ噬菌体C31整合酶时，DNA构建物包含被C31整合酶识别的AttB序列。例如，可以在宿主细胞中由使用本发明递送系统递送到细胞中的腺病毒表达载体表达整合酶。同样，有可能在本发明的递送系统中包含体外生成的编码C31整合酶的mRNA。宿主细胞中通过重组腺病毒或mRNA的C31整合酶瞬时表达涉及如下观念这些DNA重排酶的长期表达自身可能具有基因毒性，因而应当避免。
在另一个优选实施方案中，所述DNA构建物还包含基因座控制元件(LCR)，如基质附着位点。
在本发明的一个更为优选的实施方案中，所述DNA编码人肌营养不良蛋白。
在本发明的一个优选实施方案中，包含DNA作为药物试剂的所述递送系统还包含DNA压缩剂(compacting agent)，例如阳离子肽。所述DNA压缩剂缩小脂质体颗粒的尺寸。优选的DNA压缩剂是能够在颗粒形成后交联的可逆交联阳离子。更为优选的交联是硫桥。
在本发明的另一个优选实施方案中，包含DNA作为药物试剂的所述递送系统还包含化学内含物(例如仲胺和季胺)和/或生物学内含物(例如腺纤维(adeno fiber))以突破胞内内体屏障(endosomal barrier)。
包含DNA作为药物试剂的所述递送系统优选包含核定位信号，更优选的是所述核定位信号是PNA连接的肽和/或PNA连接的配体。可以通过细胞核-细胞质穿梭来获得所述PNA连接的肽或PNA连接的配体，并导致DNA的核递送。
在本发明的另一个优选实施方案中，包含DNA作为药物试剂的所述递送系统还包含抗凋亡活性。
优选的抗凋亡活性选自下组Bc1-2、针对Bax的小型干扰性RNA(siRNA)、和包含caspase抑制剂序列的肽。用于本发明递送系统的优选抗凋亡活性是Bc1-XL。本发明的递送系统可以包含所述抗凋亡活性之一或其混合物。在本发明递送系统中包含所述活性以避免成功转染的细胞因凋亡而丧失。例如，抗凋亡活性可以以腺病毒表达载体的形式或体外生成的mRNA的形式存在于本发明的递送系统中。
必须理解，用于DNA的本发明递送系统可以包含上述实施方案中公开的结构元件的任意组合。
本发明的另一个目标是包含本发明的递送系统的药物组合物。
本发明的递送系统和药物组合物是用于治疗多种人类疾病的合适工具，例如遗传病和癌症，以及用于基因疗法。
包含编码功能性肌营养不良蛋白的DNA作为药物试剂的所述递送系统是用于治疗杜兴氏肌营养不良的有用工具。依赖于本发明递送系统中所包含的细胞粘附分子，可以将药物试剂靶向人或动物身体中的特定细胞和/或组织。本发明的递送系统还可以用于在体外将药物试剂导入细胞。
本发明的递送系统或药物组合物可以通过单次推注或一段时间连续输液来进行静脉内施用，或者采用肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入方式。这些药物组合物可以包含本质上无毒且无治疗作用的制药学可接受载体。这些载体的范例包括离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质(诸如人血清清蛋白)、缓冲剂(诸如磷酸盐或甘氨酸)、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸、水、盐、或电解质诸如硫酸鱼精蛋白的部分甘油酯混合物、氯化钠、金属盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素聚合物、和聚乙二醇。
实施例现在，通过实施例进一步例示本发明。
实施例1其膜中掺入了细胞粘附分子的脂质体的生成在一次性玻璃管中在氮气下干燥0.5μmol二油酰磷脂酰胆碱。用干燥器在真空中抽空30分钟。添加缓冲液/蒸馏水至所需体积，并刮擦玻璃管壁以逐出脂质。每使用1μl脂质添加1μg蛋白质。旋涡震动30秒钟。在超声浴中于7℃处理两次，每次15秒钟。
这一流程产生多层囊泡，随着超声处理时间延长变成小型单层囊泡(SUV)。为了生成大型单层囊泡，需要使用挤压机。
实施例2脂质标记蛋白质的表达和掺入了所述脂质标记蛋白质的脂质体的制备用质粒转化大肠杆菌菌株HB101，并在含氨苄青霉素的LB培养基中于37℃进行培养。所述质粒编码六组胺酰尾，用于纯化被标记的蛋白质。将编码大肠杆菌主要脂蛋白(1pp)的信号肽和N端氨基酸残基的DNA序列连接至编码蛋白质的DNA。将由此生成的蛋白质的N端半胱氨酸残基酶促连接至细菌膜中的脂质。用IPTG诱导后，将细胞于30℃再培养12小时，并通过离心收获。将来自1升培养物的细胞重悬于50ml裂解缓冲液，并通过超声处理进行裂解。通过超速离心(150,000g，1小时，4℃)收集细胞包膜，并将沉淀悬浮于含1％(w/v)Triton-X-100的HEPES缓冲液(pH7.4)。
将样品施加到Ni2+柱上以纯化具有六组胺酰尾的脂质标记蛋白质。
在试管中将10mg磷脂酰胆碱溶于1ml氯仿。在氮气气流下充分干燥后，将它悬浮于1ml HEPES缓冲液(pH7.4)，并超声处理10分钟。于30,000g离心20分钟后，将最终的脂质体沉淀悬浮于1ml HEPES缓冲液。然后将纯化的脂质标记蛋白质溶液加到由此生成的脂质体中，并于4℃搅动。
尽管显示并描述了目前优选的本发明实施方案，显然可以理解，本发明不限于此，但是可以在下述权利要求的范围内以其它方式进行多种体现和实践。
权利要求
1.药物试剂的递送系统，其中所述系统包含脂质体，所述脂质体其内腔包含药物试剂，而其外部表面连接细胞粘附分子NCAM或其片段。
2.权利要求1的递送系统，其中所述NCAM片段包含IG环结构域I、II、和III。
3.依照权利要求1或2的递送系统，其中所述细胞粘附分子通过跨膜结构域或疏水锚分子连接至所述脂质体的所述外部表面。
4.依照任一上述权利要求的递送系统，其中所述药物试剂选自下组DNA、RNA、寡核苷酸、多肽、肽、抗肿瘤试剂、激素、维生素、酶、抗病毒剂、抗生素、抗炎药、抗原生动物药、抗风湿药、放射性化合物、抗体、前药、及其组合。
5.依照权利要求4的递送系统，其中所述药物试剂是DNA，优选可操作连接基因表达构建物的cDNA。
6.依照权利要求5的递送系统，其中所述cDNA编码功能性蛋白质。
7.依照权利要求6的递送系统，其中所述功能性蛋白质是人肌营养不良蛋白。
8.依照权利要求5或6的递送系统，其中所述递送系统包含DNA压缩剂。
9.依照权利要求8的递送系统，其中所述DNA压缩剂是能可逆交联的阳离子。
10.依照权利要求9的递送系统，其中所述可逆交联是硫桥。
11.依照权利要求5-10任一项的递送系统，其中所述递送系统包含化学内含物和/或生物学内含物，用于突破内体屏障。
12.依照权利要求5-11任一项的递送系统，其中所述递送系统包含核定位信号，该核定位信号优选为PNA连接的肽或PNA连接的配体的形式。
13.依照权利要求5-12任一项的递送系统，其中所述递送系统包含抗凋亡活性。
14.依照权利要求13的递送系统，其中所述抗凋亡活性选自下组Bcl-2、针对Bax的小型干扰性RNA、包含caspase抑制剂序列的肽，优选Bcl XL。
15.依照权利要求4-14任一项的递送系统，其中所述递送系统包含DNA整合酶活性或编码这种DNA整合酶活性的分子。
16.依照权利要求15的递送系统，其中所述整合酶是φC31噬菌体的整合酶。
17.包含依照权利要求1-16的递送系统的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及药物试剂的递送系统。所述递送系统含有脂质体，其中所述脂质体在其内腔包含待递送的药物试剂，并且在其外表面连接细胞粘附分子NCAM或其片段。在优选的实施方案中，所述药物试剂为DNA，优选为与基因表达构建物有效连接的cDNA。
文档编号C12N15/88GK1665489SQ03816266
公开日2005年9月7日 申请日期2003年7月8日 优先权日2002年7月10日
发明者丹尼斯·布龙 申请人:丹尼斯·布龙