专利名称：利用病毒包膜导入生物分子的方法及其组合物和体系的制作方法
领域技术本发明涉及一种新的与直接施用生物分子相关的治疗方法。更具体地，本发明涉及利用病毒包膜施用生物分子。本发明也涉及一种以有效的方式将生物分子输送到脑部的方法。
背景技术：
为了基因功能分析、基因治疗以及相似应用的目的，已经发展出许多种将基因导入到培养细胞或生物学组织中的病毒和非病毒方法(Mulligan，Science，260，926 to 932，1993；and Ledley，Human Gene Therapy，Vol.6，1129 to 1144，1995)。病毒方法是将基因输送到细胞内的最为有效的方法。然而，由于共导入来源于亲代病毒的亲代基因所必需的基因元件、病毒基因的表达、免疫原性等等，病毒载体可能有着一些问题。另一方面，非病毒方法的脂质体方法虽然有着比病毒方法更低水平的细胞毒性和免疫原性，但也比病毒载体有着将更低水平的将基因输送到生物学组织中的效率。
日本血凝病毒(HVJ)首先被报道用于融合Ehrlich肿瘤细胞(Okada，Biken Journal，I，103-110，1958)，然后阐明了病毒与细胞膜融合的能力的机制(在此后称作为“融合活性”)并且已经研究了它作为基因导入载体的可能用途。已知HVJ具有高水平的免疫原性，以及当生成大量的NP蛋白时能特异地诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)(Cole G.A.et al.，Journal ofImmunology，158，4301 to 4309，1997)。HVJ抑制宿主的蛋白合成也是可能的。为了避免这些问题，已经设计了一种技术，其中将包括基因或蛋白的脂质体与已经被紫外线照射灭活的HVJ融合，制备出融合颗粒(HVJ-脂质体)。该技术使得将基因非侵入性地导入到培养细胞或有机体中成为可能(美国专利No.5,631,237；Dzau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，11421 to 11425，1996；and Kaneda et al.，Molecular Medicine Today，5，298to 303，1999)。然而，该技术要求制备两种不同的颗粒，即脂质体和病毒包膜，这使得该技术变得复杂化。脂质体和HVJ的融合颗粒的缺点是平均直径为HVJ的1.3倍以及融合活性是HVJ的十分之一。另外，对于常用的基于HVJ的载体，它们不能将基因导入到一些组织中，或者如果可以，也只可能有着非常低的效率。
本发明者已经提供了各种新的将基因或寡核苷酸导入到培养细胞或有机体中的灭活病毒包膜载体(WO01/57204)。具体地，通过将基因包装进各种包膜病毒(例如HVJ等)的包膜中，病毒的基因组已经被预先灭活，可以将所得到的病毒用作为能简便且高效地将基因导入到培养细胞或生物学组织中的载体。这些病毒载体对细胞也具有很小的毒性。
本发明者已经发展了一种采用烷化剂工业级生产灭活病毒包膜的方法，这是一种廉价的、有效的方法并能获得高质量的产品。
尽管目前许多疾病都有了一些治疗，但是脑部疾病或病变仍是只能找到很少方法的领域。因此，对这些治疗和预防的需求每年都在增加。
在脑病中，脑动脉的动脉粥样硬化或Moyamoya病所造成的脑闭塞性疾病常引起脑的慢性低灌注。尽管粥样病变不仅导致大脑缺血性事件，还导致神经病理性改变包括痴呆(Kalaria RN，Bhatti SU，Lust WD，PerryG.，Ann N Y Acad Sci.1993；695190-3.；Kudo T.Takeda M，Tanimukai S，Nishimura T.，Stroke.1993；24259-64；discussion 265.；Kurumatani T.KudoT，Ikura Y，Takeda M.，Stroke.1998；291058-62.；and Sekhon LH，MorganMK，Spence I，Weber NC.，Stroke.1994；251022-7)，但是还没有建立对低灌注的有效治疗。
最近，临床前研究已经证实血管生成生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)能刺激动物脑缺血模型中的侧支动脉的发生(Harrigan MR，Ennis SR，Masada T，Keep RF.，Neurosurgery.2002；50589-98；Lyons MK，AndersonRE，Meyer FB.，Brain Res.1991；558315-20.；and Yoshimura S，et al.，Hypertension.2002；391028-34.)，一种被称为治疗性血管发生的概念。在重症肢体缺血或心肌梗死的人患者中已经报道利用血管生成因子的基因输送的治疗性血管发生的疗效(Baumgartner I，et al.，Circulation.1998；971114-23.；Losordo DW，et al.，Circulation.1998；982800-4.；Symes JF，et al.，Ann Thorac Surg.1999；68830-6；discussion 836-7.；and RosengartTK，et al.，Circulation.1999；100468-74.)。因此，如果发展出能用于人体治疗的安全且有效的基因输送方法，那么可能的治疗性血管发生对于脑缺血患者的治疗应当是有可能的。从这个角度看，目前的基因输送技术是不理想的。通过应用各种包括腺伴随病毒(AAV)(Fan D，et al.，NeurosciLett.1998；24861-4)、逆转录病毒(Franceschini IA，et al.，J Neurosci Res.2001；65208-19)、腺病毒(Miyaguchi K，Maeda Y，Collin C，Sihag RK.，Brain Res Bull.2000；51195-202.)和单纯疱疹病毒1(Johnson PA，YoshidaK，Gage FH，Friedmann T.，Brain Res Mol Brain Res.1992；1295-102.)的病毒载体可以实现对中枢神经系统(CNS)的基因输送。这些载体体系对于人的基因治疗有着优点和缺点。尽管这些方法对于中枢神经系统的体内基因输送是有效的，但是对于人的基因治疗还有无数的问题例如安全性和产率需要解决。
为了解决这些问题，我们已经发展并使用HVJ(日本血凝病毒＝仙台病毒)包膜载体，如上所述，它是一种新的非病毒载体体系。该载体体系的发展是依据于第一代的利用病毒包膜和脂质体的基于HVJ的基因输送(Yamada K，et al.，Am J Physiol.1996；271R1212-20；Kaneda Y，et al.，ExpCell Res.1987；17356-69.)(HVJ脂质体方法)。对鼠和灵长类的CNS的转染，第一代HVJ载体具有很大的潜能(Yamada K.et al.ibid；Hagihara Y，et al.，Gene Ther.2000；7759-63.)。然而，它有着一些缺陷，如制备载体需要复杂的操作并且难以储存。HVJ-包膜(HVJ-E)，一种新的非病毒的载体体系只用HVJ的包膜来输送外来基因。
(本发明所解决的问题)因此，本领域需要一种体外和体内利用病毒包膜将生物分子有效地输送(例如基因导入)到脑部和中枢神经系统的方法。
此外，可以提高利用病毒包膜输送生物分子的效率。因此，本领域需要发展一种利用病毒包膜的高效输送生物分子的体系和方法。
本发明的目的是提供一种利用病毒包膜将生物分子有效地输送到脑部和中枢神经系统的改进方法。
发明内容
(解决问题的方法)作为多个研究的结果，本发明者已经发现通过往病毒包膜体系中添加糖胺聚糖可以解决上述的问题。
本发明者也已经发现在阻断脑部或颈部动脉后通过使用病毒包膜体系，通过使用病毒包膜可以将生物分子有效地输送到脑部。
因此，下面以各种实施方案的方式提供本发明。
(1)一种用于将生物分子导入细胞内的体系，包括1)一种生物分子；2)一种病毒包膜；以及3)一种糖胺聚糖。
(2)第1项的体系，其中病毒包膜是灭活的。
(3)第1项的体系，其中糖胺聚糖是肝素。
(4)第1项的体系，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
(5)第1项的体系，其中所包括的糖胺聚糖的浓度至少为50U/ml。
(6)第3项的体系，其中所述肝素的分子量为从12,000到15,000kDa。
(7)第3项的体系，其中所述肝素的硫酸化程度是药用可接受的。
(8)第1项的体系，其中病毒包膜是一种RNA病毒的包膜。
(9)第1项的体系，其中病毒包膜是一种属于副粘病毒(Paramixovirus)属的病毒的包膜。
(10)第1项的体系，其中病毒包膜是HVJ的包膜。
(11)第1项的体系，其中生物分子选自由核酸、多肽、脂类、糖及其复合分子所构成的组。
(12)第1项的体系，其中生物分子包括核酸。
(13)第1项的体系，其中生物分子包括多肽。
(14)第1项的体系，其中生物分子是一种编码一种选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的基因的核酸。
(15)第1项的体系，其中生物分子是一种选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的多肽。
(16)第1项的体系，其中肝素、生物分子和病毒包膜被包含于同一组合物中。
(17)第1项的体系，其中肝素被包含于不同于包括生物分子和病毒包膜的组合物的另一组合物中。
(18)第1项的体系，其中生物分子被包含于病毒包膜中。
(19)一种将生物分子导入细胞内的方法，其包括以下步骤
A)将一种包括病毒包膜和生物分子的组合物施用于细胞；B)将糖胺聚糖施用于细胞。
(20)第19项的方法，其中施用糖胺聚糖的步骤与施用组合物的步骤同时实施。
(21)第19项的方法，其中在施用组合物的步骤之前实施施用糖胺聚糖的步骤。
(22)第19项的方法，其中在施用组合物的步骤之后实施施用糖胺聚糖的步骤。
(23)糖胺聚糖在生产用于将生物分子导入细胞内的药物中的用途，其中药物包括A)一种生物分子；B)一种病毒包膜；以及C)一种糖胺聚糖。
(24)一种将生物分子输送到脑部的方法，其包括以下步骤A)短暂阻断头部或颈部的动脉；以及B)在阻断头部或颈部的动脉期间将生物分子导入到脑部。
(25)第24项的方法，其中生物分子选自由核酸、多肽、脂类、糖及其复合分子所构成的组。
(26)第24项的方法，其中生物分子包括核酸。
(27)第24项的方法，其中生物分子是一种编码一种选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的基因的核酸。
(28)第26项的方法，其中通过载体输送核酸。
(29)第24项的方法，其中用病毒包膜导入生物分子。
(30)第29项的方法，其中病毒包膜是灭活的。
(31)第29项的方法，其中病毒包膜是一种RNA病毒的包膜。
(32)第29项的方法，其中病毒包膜是一种属于副粘病毒属的病毒的包膜。
(33)第29项的方法，其中病毒包膜是一种HVJ的包膜。
(34)第24项的方法，其中用糖胺聚糖导入生物分子。
(35)第34项的方法，其中糖胺聚糖是肝素。
(36)第34项的方法，其中糖胺聚糖的分子量至少为10,000kDa。
(37)第34项的方法，其中所含的糖胺聚糖的浓度至少为50U/ml。
(38)第35项的方法，其中所述肝素的分子量为从12,000到15,000kDa。
(39)第35项的方法，其中所述肝素的硫酸化程度是药用可接受的。
(40)第34项的方法，其中同时施用糖胺聚糖与生物分子。
(41)第34项的方法，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
(42)第34项的方法，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
(43)第24项的方法，其中头部或颈部的动脉被阻断1分钟到120分钟。
(44)第24项的方法，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉或颈动脉。
(45)第24项的方法，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉。
(46)第24项的方法，其中生物分子施用到颈动脉、丘脑、脑室内或鞘内。
(47)第24项的方法，其中生物分子被施用到颈动脉。
(48)一种将生物分子输送到脑部的试剂盒，包括A)一种生物分子；以及B)一个说明用于施用生物分子的方法的说明书，其中方法包括a)短暂阻断头部或颈部的动脉；b)在阻断头部或颈部的动脉期间将生物分子施用到脑部。
(49)第48项的试剂盒，其中生物分子选自由核酸、多肽、脂类及其复合分子所构成的组。
(50)第48项的试剂盒，其中生物分子包括核酸。
(51)第48项的试剂盒，其中生物分子是一种编码一种由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的基因的核酸。
(52)第48项的试剂盒，其中用载体输送核酸。
(53)第48项的试剂盒，还包括一种病毒包膜。
(54)第53项的试剂盒，其中病毒包膜是灭活的。
(55)第53项的试剂盒，其中病毒包膜是一种RNA病毒的包膜。
(56)第53项的试剂盒，其中病毒包膜是一种属于副粘病毒属的病毒的包膜。
(57)第53项的试剂盒，其中病毒包膜是一种HVJ的包膜。
(58)第48项的试剂盒，还包括一种糖胺聚糖。
(59)第58项的试剂盒，其中糖胺聚糖是肝素。
(60)第58项的试剂盒，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
(61)第58项的试剂盒，其中所含的糖胺聚糖的浓度至少是50U/ml。
(62)第59项的试剂盒，其中肝素的分子量为从12,000到15,000kDa。
(63)第59项的试剂盒，其中所述肝素的硫酸化程度是药用可接受的。
(64)第58项的试剂盒，其中同时施用糖胺聚糖与生物分子。
(65)第58项的试剂盒，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
(66)第58项的试剂盒，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
(67)第48项的试剂盒，其中头部或颈部的动脉被阻断1分钟到120分钟。
(68)第48项的试剂盒，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉或颈动脉。
(69)第48项的试剂盒，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉。
(70)第48项的试剂盒，其中生物分子被施用到颈动脉、丘脑、脑室内或鞘内。
(71)第48项的试剂盒，其中生物分子被施用到颈动脉。
(72)一种生物分子在生产一种用于将该生物分子输送到脑部的试剂盒的用途，该试剂盒包括A)该生物分子；以及B)一说明用于施用生物分子的方法的说明书，其中方法包括a)短暂阻断头部或颈部的动脉；以及b)在头部或颈部的动脉被阻断期间，将该生物分子导入到脑部。
要知道本领域人员在阅读和理解本说明书后将清楚地认识到本发明的优点和作用。
图1.利用HVJ-E载体用Venus基因所转染的培养的鼠大脑皮质神经元和胶质细胞的典型实例。Venus的激光扫描共聚焦显微镜图像(a、d、g)，MAP2(b)、NeuN(d)、GFAP(h)的免疫荧光染色以及拼接图像(c、f、i)。绝大多数表达Venus的细胞是MAP2和NeuN免疫阳性的(a-f)。试验至少被重复5次。
图2.利用立体定向将EGFP质粒体内基因转移到脑部。一个激光扫描共聚焦显微镜图像的荧光立体显微镜图像。对丘脑的立体定向注射(a、b)显示了在注射部位的限制性表达。对侧脑室的立体定向注射(c、d)发现在脉络丛和室管膜细胞的表达(e、f)。CP，脉络丛；LV，侧脑室；Str，纹状体；Ep，室管膜细胞层。试验至少被重复5次。
图3.通过经小脑延髓池的注射将Venus质粒体内基因转移到脑部。OB，嗅球；FC，额皮质；M，脑膜。试验至少被重复5次。
图4.在短暂阻断大脑中动脉后经颈动脉的Venus基因转移所产生的荧光。在左侧短暂阻断大脑中动脉60分钟的3天后的冠状切面以及荧光立体显微镜图像。含有Venus基因的HVJ-E载体在再灌注期间被输入到左侧颈动脉。只在受损病灶上发现有基因表达，同时在完好半球内没有发现荧光。试验至少被重复5次。
图5.在短暂阻断大脑中动脉后的基因转移到颈动脉后，受损半球和对侧半球内的萤光素酶活性。在左侧短暂阻断大脑中动脉60分钟的1天后测定萤光素酶活性。含有Venus基因的HVJ-E载体在再灌注期间被输入到左侧颈动脉。每组n＝5。
图6.肝素对萤光素酶活性的作用。在经小脑延髓池转染pGL3萤光素酶基因1天后测定萤光素酶活性。将浓度为0、10、50或100(U/ml)的肝素、浓度为10、50或100(U/ml)的低分子量肝素添加到载体中。**P＜0.01对0、10和100。每组n＝3。
具体实施方案下面将描述本发明。在本说明书的全文中都要明白单数形式包括复数内容，除非文章中有明确的其它提示。也要明白名词在此具有在本领域所常用的定义，除非另有说明。
下面将描述在此所用的具体的名词。
名词“病毒”在此指的是传染性的微小结构，它具有作为它的基因组的DNA或RNA并只在被感染细胞内增殖。病毒包括属于一种选自由逆转录病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、本扬病毒科、弹状病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、杆状病毒科以及肝DNA病毒科所构成的组的一个病毒科的病毒。病毒在此可以优选地是正粘病毒科的流感病毒或仙台病毒。更优选地，病毒在此是仙台病毒。
名词“仙台病毒”或“日本血凝病毒(HVJ)”可互换使用，它指的是一种能与细胞融合的副粘病毒科的副粘病毒属的病毒。M.Kuroya等首先报道了仙台病毒(1953)。它的基因组是具有约15,500个碱基长度的RNA的负链。仙台病毒颗粒包括包膜，它的直径为150nm到300nm(多态性)。仙台病毒含有RNA聚合酶。病毒不能被加热并能引起溶血以及几乎所有类型红细胞的凝集。病毒生长在正发育的鸡蛋的细胞浆内和/或来源于各种动物的肾脏的培养细胞内。当既定的细胞被仙台病毒感染时，可以发生持续的感染。病毒具有融合各种细胞的能力，因此被广泛地用于异核体的形成、杂交细胞的制备等等。
名词“(病毒或病毒的)包膜”在此指的是主要包括包围核壳体的脂质双层的膜结构，它存在于例如仙台病毒等的特殊病毒中。常在从细胞内出芽生成的成熟病毒中观察到有包膜。包膜通常包括宿主来源的脂质以及包括病毒基因编码的突出蛋白的小的突出结构。因此，当将包膜作用为载体时，将它称为“(病毒的)包膜载体”，在此，在适当情况下，它可以与“病毒包膜”互换使用。
名词“糖胺聚糖”在此指的是一种多糖，其中主要成分是氨基己糖。这样的糖胺聚糖包括但不限于透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素及其混合物。“氨基己糖”在此指的是一种己糖，其中一个羟基被氨基酸基团所取代。通常如上述的分类糖胺聚糖，但是已经报道有一些分子难以被明确地分类，例如一个分子的一部分具有硫酸软骨素结构，以及另一部分具有硫酸皮肤素结构等。除了透明质酸是由链球菌(A群)合成并分泌的外，几乎所有的糖胺聚糖是动物细胞(主要是结缔组织的细胞)所生成的蛋白多糖的侧链成分，通过酶处理它的核心蛋白部分可以得到糖胺聚糖，或者对于其中糖胺聚糖是连接于蛋白的丝氨酸或苏氨酸的酯类时可以通过碱法消化蛋白和糖胺聚糖的侧链之间的连接得到糖胺聚糖。具有大分子量糖胺聚糖的阴离子结构可被用于包括大量的水分子。糖胺聚糖在此包括葡糖胺聚糖和半乳糖胺聚糖。半乳糖胺聚糖指的是包括氨基半乳糖的半乳糖胺聚糖，并包括例如硫酸软骨素、硫酸皮肤素等。葡糖胺聚糖指的是包括氨基葡糖的糖胺聚糖，并包括例如肝素、硫酸乙酰肝素等。
名词“肝素”在此指的是一种主要由D-氨基葡糖和D-葡糖醛酸(例如，交互聚合的方式)所构成的糖胺聚糖。硫酸根被结合于几乎所有的氨基葡糖的2，6-氨基，以及它的6号位羟基和2号位糖醛酸。动物的脂肪细胞合成肝素，它具有许多硫酸根和羧基，因此它是具有高分子量的带负电荷的电解质。它对血液凝固具有抑制活性。
名词“硫酸化”在此指的是用硫酸基对取代基(例如，氨基、羟基等)的取代。硫酸化的程度是决定分子的带电程度的重要因素，并且相信细胞膜强度的变化可以影响本发明的病毒包膜的输送效率。因此，在一个优选的实施方案中，所用的硫酸化的程度是药用可接受的。
名词“生物分子”在此指的是与一种有机体相关的分子。“有机体(或“生物的”)”在此指的是生物学的有机体，包括但不限于动物、植物、真菌、病毒等。生物分子包括一种从有机体中提取的分子，但并不受此限定。生物分子可以是任何能影响有机体的分子。因此，生物分子也包括例如通过组合化学所合成的分子，以及能用作为药物的低分子量分子(例如低分子量配体等)，只要它们能影响有机体。这样的生物分子的实例包括，但不限于蛋白、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(例如包括DNA(例如cDNA和基因组DNA)和RNA(例如mRNA))多糖、寡糖、脂类、低分子量分子(例如激素、配体、信号转导物、低分子量有机分子等)、以及它们的复合分子等。生物分子也包括细胞本身、以及组织的一部分或整个组织等，只要它们能与本发明的底物结合。优选地，生物分子包括核酸或蛋白。在一个优选的实施方案中，生物分子是核酸(例如基因组DNA或cNDA，或用PCT等所合成的DNA)。在另一个优选的实施方案中，生物分子可以是蛋白。
名词“生物学活性”在此指的是特定因子(例如病毒、多核苷酸或多肽)在有机体内所具有的活性，包括表现出各种功能的活性。例如，当特定因子是转录因子时，它的生物学活性包括调节转录活性的活性。当特定因子是病毒时，它的生物学活性包括感染活性。作为另一个实例，当特定因子是配体时，它的生物学活性包括与配体所相对应的受体结合。这些生物学活性可以被“灭活”。
名词“灭活”在此与病毒(例如仙台病毒等)相关，说明病毒的基因组被灭活。被灭活的病毒不能复制。用在此所描述的方法例如烷基化等能实现灭活。这样的用于灭活的方法包括但不限于一种包括以下步骤的方法(a)用烷化剂灭活病毒(例如HVJ等)；(b)得到病毒或灭活病毒的浓缩溶液；以及(c)用柱层析法纯化病毒或灭活病毒，然后超滤，以及一种包括相同的步骤但它们的次序可以被重排的方法。
名词“烷基化”在此指的是一种用烷基取代有机化合物的氢原子的作用。名词“烷化剂”指的是提供烷基的化合物。烷化剂的实例包括，但不限于有机金属化合物，例如烷基卤、二烃基、磺酸烃基、烷基铅等。优选的烷化剂的实例包括，但不限于β-丙酸内酯、丁内酯、碘甲烷、碘乙烷、碘丙烷、溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、二甲基硫酸、二乙基硫酸等。
“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在此可替换地用于指包括一系列核苷酸的大分子(聚合物)，除非另有说明。核苷酸指的是其碱基为磷酸酯的核苷。核苷酸的碱基为嘧啶或嘌呤碱基(嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸)。多核苷酸包括DNA或RNA。
“核苷酸”在此指的是任何天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。“衍生核苷酸”指的是不同于天然存在的核苷酸但具有与它的最初的天然存在形式相似功能的核苷酸。这些衍生核苷酸在本领域是熟知的。
名词“片段”在此与核酸相关，指的是其长度比参照核苷酸分子的全长短但足以作为本发明的试剂的多核苷酸。因此，名词“片段”指的是对应于参照多核苷酸(n长度)的全长所具有的序列长度为从1到n-1的多核苷酸。根据目的可以适当地改变片段的长度。例如，片段长度的下限包括5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100或更多核苷酸。在此没有被指定的整数所代表的长度(例如11等)也可以作为下限。用Altschul等(J.Mol.Biol.，215，403-410(1990))所发展的算法通过搜索程序BLAST所测定出的积分可以表示同源性。
名词“蛋白”、“多肽”和“肽”在此可交替用于表示包括一系列氨基酸的大分子。名词“氨基酸”指的是具有与碳原子结合的羧基和氨基的有机分子。优选地，氨基酸在此包括，但不限定于20种天然存在的氨基酸。
名词“基因”在此指的是定义遗传特异性的元件。基因通常以给定的次序排列于染色体上。定义蛋白一级结构的基因被称为结构基因。调节结构基因表达的基因被称为调节基因。名词“基因”在此可以指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”以及“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”。
名词“外来基因”在此指的是导入载体中所包含的来源于非病毒序列来源的核酸序列。在发明的一个方面，外来基因被可操纵地连接到适当的序列(例如，转录所必需的启动子、增强子、终止子和聚A信号、以及转译所必需的核糖体结合位点、起始密码子和终止密码子等)上以表达通过基因导入载体所导入的基因。在另一个方面，外来基因不包括用于表达外来基因的调节序列。在另一方面，外来基因是寡核苷酸或诱饵核酸。
名词“基因库”在此指的是核酸库，包括天然分离的核酸序列、或合成的核酸序列。天然分离的核酸的来源包括，但不限于来自真核细胞、原核细胞或病毒的基因组序列或cDNA序列。在本发明的基因库的定义中也包括其中任意序列(例如信号、标记序列等)被添加到天然分离序列中的文库。在一个实施方案中，基因库包括有助于核酸的转录和/或转译的序列例如启动子等。
名词“筛选”在此指的是从例如基因库的文库中选择或检测出具有所需活性或功能的成员。这样的筛选方法在本领域是已知的。
名词“基因导入”在此指的是体内或体外将所需的、天然的、合成的或重组的基因或基因片段以保持导入基因的功能的方式导入到靶细胞内。在本发明中所导入的基因或基因片段包括具有特异序列的DNA、RNA、或它们的合成的同类物。另外，基因导入在此可以与名词“转染”和“转染”替换使用。
“基因导入活性”在此指的是载体的“基因导入”的活性，通过所导入基因的功能(例如当使用表达载体时，其所编码的蛋白的表达和/或活性)可以测定出该活性。
名词多核苷酸、多肽等的“表达”在此表示通过预定的作用实现将基因等转化为另一种形式。优选地，名词“表达”表示基因、多核苷酸等被转录或转译成多肽。另外，经转录生成mRNA可以是“表达”的另一个方面。更优选地，这样的多肽可以具有经转译后处理所修饰的一种形式。与基因表达相关的名词“调节”在此指的是，但不限定于基因表达的增强、减弱、诱导、消除、减速、加速等。
被处理的基因的实例包括，但不限定于编码酶、激素、淋巴因子、受体、生长因子、调节蛋白、影响免疫系统的多肽、免疫调节因子、抗体等的基因。具体地，这些基因包括但不限于编码人生长激素、胰岛素、白介素-2、肿瘤坏死因子、神经生长因子(NGF)、上皮生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、因子VIIIC、降钙素、胸苷肌酶、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、促红细胞生成素(EPO)、肝细胞生长因子(HGF)等的基因。在本发明的药物中，这些基因可以以核酸或多肽的形式存在。
当指向为基因时，名词“载体”在此指的是能将相关的多核苷酸序列转移到相关细胞内的载体。这样的载体的实例包括一种能在例如单个动物的宿主细胞内自主复制的载体、或在合适的位点具有用于转录本发明的多核苷酸的启动子的载体，该载体能结合于宿主的染色体内。载体在此可以是质粒。
名词“表达载体”在此指的是一种核酸序列，其中结构基因、调节结构基因表达的启动子、以及各种调节元件被可操纵地连接于宿主细胞内。这样的调节元件优选地可以包括终止子、选择标记物例如耐药基因、以及增强子。本领域人员熟知，例如动物的有机体的表达载体的类型以及调节元件的种属根据其在此所用的宿主细胞或有机体可以不同。对人而言，本发明所用的表达载体可以包括pCAGGS(Niwa H.et al.，Gene；108193-9(1991))。
名词“重组载体”在此指的是能将相关的多核苷酸序列转移到相关细胞内的载体。这样的载体的实例包括一种能自主复制或能结合到例如个体动物的宿主细胞内的染色体内并在适合的位点具有用于转录本发明的多核苷酸的启动子的载体。
动物细胞的“重组载体”的实例包括但不限于pcDNAI/Amp、pcDNAI、pCDM8(所有的都可从Funakoshi中购得)、pAGE107[Japanese Laid-OpenPublication No.3-229，79，Cytotechnology，3，133(1990)]、pREP4(Invitrogen)、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pAMo、pAMoA[J.Biol.Chem.，268，22782-22787(1993)]、pCAGGS(Niwa，H.，et al.，Gene；108，193-199(1991)，等等。
名词“终止子”在此指的是定位于基因的蛋白编码区的下游的序列，当DNA被转录为mRNA时，该序列参与了聚A序列的添加以及转录的终止。已知终止子促进了mRNA的稳定性并影响基因表达的量。终止子包括，但不限于哺乳动物的终止子、以及CaMV35S终止子、胆脂碱合酶基因终止子(Tnos)、烟草PR1a基因终止子等。
名词“启动子”在此指的是决定基因的转录起始位点的碱基序列，它是一种定位于直接调节转录频率的DNA内的区域。通过RNA聚合酶与启动子的结合启动转录。因此，具有启动子功能的基因的一部分在此指的是“启动子基序”。启动子区域一般都定位于推定的蛋白编码区的第一个外显子的约2kbp上游。因此，通过利用DNA分析软件推测基因组碱基序列内的蛋白编码区估测启动子区域是有可能的。所推定的启动子区域常定位于结构基因的上游，但这依赖于结构基因，所推定的启动子区有可能定位于结构基因的下游。优选地，所推定的启动子区域是定位于第一个外显子的转译起始位点的2kbp上游。
当指向为基因的表达时，名词“位点特异性”在此常指的是基因表达在有机体(例如动物)的部位(例如可以是动物的心脏、心肌细胞等)内的特异性。名词“时间特异性”指的是基因表达的特异性依赖于有机体的特异阶段(例如，在中风的时候等等)。
在此用作为药物的疫苗的实例包括，但不限于肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、麻疹、单纯疱疹等的疫苗。在本发明的药物中，这些疫苗可以以核酸或肽的形式存在。
本发明提供了一种包括单个上述的包膜或联合有一种稳定化合物、稀释剂、携带剂或其它的成分和药用试剂的药用组合物或药物。优选地，本发明可以是疫苗的形式或是适合用于基因治疗的其它形式。
所用的本发明的药用组合物和药物可以是能容许其包膜进入到感染位点的细胞或相关组织的细胞内的形式。
可以用任何无菌的生物兼容的药用载体施用本发明的药用组合物和药物，载体包括但不限于生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖和水等。在药用的组合物内，与合适的赋形剂、佐剂和/或药用可接受的载体混和的这些分子的任何一种分子都可以被单独地或与其它的药用试剂联合地施用于患者。在本发明的特定的实施方案中，药用可接受的载体是无药用活性的。
口服或肠外施用本发明的药用组合物和药物。肠外给药方法的实例包括，但不限定于局部给药、动脉内(例如经颈动脉或等等)、肌肉内、皮下、髓内、蛛网膜下、脑室内、静脉内、腹腔内和鼻内给药等等。在本发明中，可以使用任何一种可以给药到治疗部位的途径。
名词“头部”在此指的是身体的一部分，包括颅骨、它的内容物和相关结构。名词“头部”在此包括脑部。
名词“颈部”在此指的是头部和上肢之间的区域。头颈(头和颈)部或颅颈部在此可以指颈及其上的部位。
名词“短暂地”在此指的是当进行治疗时，这样的治疗持续一段特定的时间。因此，在治疗停止后，治疗的作用将消失或减弱。
名词“动脉”在此指的是将血液从心脏输送到身体的每个部位的血管。因此，名词“脑动脉”指的是存在于脑部的动脉。
名词“阻断”动脉或血管在此指的是处理同一个血管使得血流比未进行处理时明显减少或终止。优选地，当进行阻断时不引起出血是优选的。阻断动脉或血管的方法包括，但不限于球囊导管、夹子等等。
将生物分子“导入”一个位置(例如“细胞内(细胞内地)”)指的是将这样的生物分子从不同的位置转移到相关的位置。可以用任何方法进行这样的导入，它可以是主动导入或被动导入。
名词“体系”在此指的是由多种成分构成的产品，包括药物、农药、组合物(例如药用组合物)、疫苗或试剂盒等。
为了制备赋形剂或可药用组合物，除了包膜以外这些药用组合物和药用试剂还可以包括含有促进包膜加工的其它化合物的可药用载体。例如在最新版的日本药典和它的最新附录、最新版的“REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES”(Maack Publishing Co.，Easton，PA)等中描述了处方和给药的更多细节。
用本领域所熟知的可药用载体可以制备出以适合于给药的形式用于口服给药的药用组合物。这些载体可以被制备为片剂、丸剂、糖包被制剂、胶囊、液体、胶、糖浆、膏剂、混悬液等等，通过这些载体患者适合于服用药物组合物。
可以用以下的方法获得用于口服的药用组合物活性化合物与固体赋形剂混和，如需要将所得到的化合物粉末化，如需要再添加适当的化合物以获得片剂或糖包被制剂的核，加工颗粒化的混合物。合适的赋形剂可以是糖或蛋白充填剂，包括但不限于下面的包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖醇的糖；玉米、小麦、大米、马铃薯或其它植物来源的淀粉；纤维素例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、或羧甲基纤维素钠；和包括阿拉伯胶和西黄蓍胶的胶；和蛋白例如明胶和胶原。如需要可以使用崩解剂或增溶剂例如交互连接的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或它的盐(例如海藻酸钠)。
给糖包被制剂的核提供一种合适的涂层，例如浓缩糖溶液。糖包被制剂的核也可以包含阿拉伯胶、滑石粉、聚丙烯吡咯烷酮、Carbopolygel、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液、以及合适的有机溶剂或混和的溶剂溶液。为了鉴定产物，或表示活性成分的量(即剂量)，可以将染料或色素加入到片剂或糖包被制剂中。
可以口服服用的药用组合物可以包括例如由胶囊、明胶和涂层(例如甘油或山梨糖醇)构成的软的密封胶囊。胶囊可以含有与填充剂或结合剂例如乳糖或淀粉、润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁、以及任意一种稳定剂混和的活性成分。在软胶囊中，可以将诱饵化合物溶解或悬浮于一种合适的溶液中，例如脂肪酸、液体石蜡、或液体聚乙二醇，有或无稳定剂。
肠外给药的药用组合物包括活性化合物的水溶液。对于注射的目的，制备水溶液的本发明的药用组合物，优选地是Hank溶液、林格溶液或生理适合的缓冲液例如缓冲生理盐水。用于注射的水混悬液可以包括用于增加混悬液的粘度的物质(例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇、或葡聚糖)。另外，可以将活性化合物的混悬液制备为适合的油性混悬液。适合的亲脂溶剂或载体包括脂肪酸例如麻油、合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。混悬液可以包括容许高浓度溶液产品的稳定剂，或如需要可以包括用于增加化合物的溶解度的合适的药用试剂或反应物。
用一种与本领域已知方法(例如常规的混和、分解、颗粒化、糖包被制剂的制备、淘洗、乳化、包囊化、包裹或冷冻干燥)相似的方法生产本发明的药用组合物。
本发明的药用组合物包括含有有效量的能实现诱饵化合物的预定目的的本发明的包膜的组合物。“治疗有效量”和“药用有效量”是本领域人员熟知的名词，它们指的是能有效地生成预定的药用疗效的药用试剂的量。因此，治疗有效量是能有效地减少被治疗疾病的表现的量。用于确定预定应用的有效量的有用的检测法是测定靶疾病的恢复程度。实际给药的量依赖于被治疗的个人。量被优选地最佳化为能实现所需的疗效且没有明显的副作用。本领域人员有能力确定出治疗有效剂量。
首先或利用细胞培养检测或利用任何适合的动物模型可以估测出任何化合物的治疗有效剂量。用动物模型得到所需的浓度范围以及给药途径。此后，可用这些信息确定出施用于人体的剂量及可用途径。
与包膜相关的名词“治疗有效量”指的是能消除疾病的症状或病变的量。通过细胞培养或实验动物的标准的药用方法(例如，ED50，对50％种群治疗有效的剂量；以及LD50，对50％种群致死的剂量)可以测定出包膜的治疗疗效和毒性。治疗疗效和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，可以表示为ED50/LD50比。具有高治疗指数的药用组合物是优选的。可以用从细胞培养检测和动物研究中所获得的数据设计出用于人体的剂量范围。这些化合物的剂量优选地在包括ED50但只有很少或无毒性的循环浓度的范围内。在这个范围内，这样的剂量可以不同，依赖于所采用的剂量、患者的敏感性以及给药途径。举例，所适当选择的包膜剂量依赖于患者的年龄和其它条件、疾病的类型、所采用的包膜类型等等。
当本发明的包膜载体被施用于人时，每人可以施用从400HAU到400,000HAU包膜载体，优选的是从1,200HAU到120,000HAU，以及更优选的是从4,000HAU到40,00HAU。所施用的包膜中所含的外来基因的量可以是每人从2μg到2,000μg，优选的是每人从6μg到600μg，以及更优选的从20μg到200μg。
名词“HAU”在此指的是能凝集0.5％鸡红细胞的病毒活性的量。1HAU对应为24,000,000病毒颗粒(Okada Y.et al.，Biken Journal，4，209-213，1961)。例如可以每天一次到每天数次施用上述的量。
每个医师根据被治疗的患者可以选择确切的剂量。调整剂量和给药以提供有效水平的活性或保持所需的作用。还要考虑的其它因素包括疾病状态的严重性(例如，肿瘤的大小和位置；患者的年龄、体重和性别；饮食调整；给药的持续时间和频率；药物的组合；反应敏感性；以及对治疗的耐受/反应)。根据特殊剂型的半衰期和它的清除率，可以每3到4天、每周或每周两次施用持续释放的药用组合物。在本领域已知的文献中提供了特殊剂量和转移方式的指南。
本发明也可以包括作为组合物和药物的生物兼容材料。生物兼容材料可以包括至少一种从由硅氧烷、胶原、明胶、乙醇酸/乳酸共聚物、乙烯/乙烯乙酸酯共聚物、聚氨酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯构成的组的材料。硅氧烷是优选的，因为它容易成型。生物可降解大分子的实例包括，但不限定于聚合物、共聚物或它们的混合物，它们可以由至少一种选自由胶原、明胶、α-羟基羧酸(例如，羟基乙酸、乳酸、羟丁酸等)、羟基二羧酸(例如，苹果酸等)、羟基三羧酸(例如，柠檬酸等)、多酸酐(例如，聚-α-氰基丙烯酸酯)、聚氨基酸(例如，聚-γ-苄基-L-谷氨酸等)、基于马来酸酐的共聚物(例如，苯乙烯/马来酸共聚物等)等等所构成的组的物质的非催化水合作用合成。聚合的方式可以是任何的随机的、嵌段和接枝聚合。当α-羟基羧酸、羟基二羧酸、或羟基三羧酸在分子内具有任意的活性中心时，可以使用任何D-异构体、L-异构体、以及DL-异构体。优选地，可以使用羟基乙酸/乳酸共聚物。
可以提供持续释放形式的本发明的组合物和药物。本发明可以使用任何的持续释放的剂量形式。持续释放的剂量形式的实例包括，但不限定于杆状剂型(例如，丸状、圆柱状、针头状剂型等)、片剂剂型、盘状剂型、球状剂型、板状剂型等等。制备持续释放剂量形式的方法在本领域是熟知的，例如在日本药典、美国药典、和其它国家的药典等所描述的一样。用于生产持续释放药物的方法的实例包括，但不限定于利用从复合物中崩解出药物的方法、制备液体药物的水性混悬液的方法、用于制备油状注射溶液或油状悬浮注射溶液的方法、用于制备乳化注射溶液(o/w或w/o型乳化注射溶液等)的方法等等。
如果经在本发明所应用的国家的法律和当局认可，本发明的组合物和药物的使用通常要在医师的监督或无医师的监督下进行。
也可以以疫苗的形式提供本发明。疫苗的意思是用于预防(或治疗)特定类型的疾病(例如接触性传染病、感染疾病等)的任何一种不同形式的抗原(例如，蛋白、DNA等)。根据感染、传播、流行等类型，使用减弱的活病原体(活疫苗)、无活性的病原体(或它的一部分)、病原体的代谢物(毒素、无活性的毒素(即类毒素)等)、DNA疫苗等。疫苗造成有机体体内的免疫力的主动发展(体液免疫、细胞免疫、或两者)并预防病原体所引起的感染、传播、流行等等。
本发明的疫苗并不特别地限定于任何一种剂量形式，根据本领域已知的方法制备疫苗。另外，本发明的疫苗可以是含有各种佐剂的乳剂形式。当使用比单独地使用上述的HSV基因重组体更小的剂量时，佐剂有助于维持高水平的免疫力。佐剂实例包括Freund佐剂(完全或不完全)、佐剂65(包括花生油、二缩甘露醇和单硬脂酸铅)、和氢氧化铝、磷酸铝或矿物胶例如明矾。对于用作为食物来源的人体或动物的疫苗，佐剂65是优选的。对于用于商业化动物的疫苗，矿物胶是优选的。
除了上述的佐剂，本发明的疫苗可以包括一个或多个用于制备的添加剂，选自稀释剂、芳香化学试剂、防腐剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、表面活性剂、增塑剂等等。
本发明的疫苗的给药途径没有被特别地限定，但肠外给药是优选的。例如，肠外施用疫苗(例如，静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内或腹腔内)。优选地，可以经颈动脉施用本发明的疫苗。
根据各种条件可以选择本发明的疫苗的剂量预期施用的疫苗、感染是否是初次或反复感染、年龄和体重、患者的病变；疾病严重性等等。当预期治疗反复感染所引起的疾病时，本发明的疫苗的剂量优选的是每公斤体重约0.01ng到10mg，以及更优选的是每公斤体重约0.1ng到1mg。
本发明的疫苗的给药次数的不同依赖于上述的条件，并且不一定必须是由相同的方式所决定的。然而，优选地，在数天或数周的间隔内反复施用疫苗。具体地，进行数次给药，或优选的在约2到4周的间隔内给药约1到2次。优选地根据症状学或测定主要抗体滴度的同时监测疾病的病变决定给药的次数(给药次数)。
组合物在此用于治疗或预防病原体感染(例如，病毒(例如，HIV、流感病毒、轮状病毒等)、或细菌)。这些组合物包括病原体的至少一种基因或蛋白。外来基因优选的是全长的基因，但可以是部分序列，只要它至少含有能触发免疫力的抗原决定簇。名词“抗原决定簇”在此指的是一种其结构已经被阐明的抗原决定部分。用于确定抗原决定簇的方法在本领域是已知的。一旦提供了蛋白的原始核酸或氨基酸序列，利用这样一种已知的常规技术可以确定出这些抗原决定簇。有用的抗原决定簇可以至少有3个氨基酸长度，优选的至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、或至少25个氨基酸。
名词“中和抗体”在此指的是一种参与中和抗原例如酶、毒素、细菌、病毒等的生物学活性的反应的抗体。名词“中和反应”指的是其中抗原与中和抗体结合的反应，使得抗原和抗体的活性被消除或减弱。如果施用疫苗，可以产生中和抗体并清除病原体。
名词“基因治疗”或“基因治疗方法”在此指的是通过往患者中导入健康或修饰核酸(例如DNA)治疗受损(或缺陷)基因所引起的疾病的方法。尽管经常使用载体，但一些基因治疗使用注射裸核酸的步骤。本发明的病毒包膜可用作为这样的载体。
本发明可以提供包括组合物和药物的试剂盒的形式。试剂盒包括本发明的组合物和药物；以及提供指导施用组合物和药物的说明书。说明书描述了说明施用本发明的组合物或药物的适当方法的陈述。根据本发明所实践国家的当局(例如，日本的卫生、劳动和福利部、美国的食品与药物管理局(FDA)等)所定义的格式制备说明书，明确地说明说明书是经当局认可的。说明书是所谓的药品说明书，并常是纸件的形式。说明书不受此限定并可以是电子媒介的形式(例如，因特网所提供的网站、电子邮件等)。
参照于使用目的、靶向疾病(类型、严重性等)、患者的年龄、体重、性别、病史、细胞生物活性物质的形式或类型等，本领域人员可以容易地确定出在本发明的方法中所用的组合物和药物的量。
根据使用目的、靶向疾病(类型、严重性等)、患者的年龄、体重、性别和病史、治疗的进展等，本领域人员也能确定出应用于对象(或患者)的本发明的治疗方法的频率。频率的实例包括每天一次到数月一次(例如每周一次到每月一次)。优选地，根据进展，进行每周到每月一次的给药。
本发明的组合物和药物包括一种导入到宿主内的材料或药用成分。这样的材料或药用成分可以是生物学大分子。优选地，这样的生物学大分子是选自由核酸、多肽、糖、脂质以及它们的复合分子所构成的组。优选地，这样的药用成分可以是编码在导入成分的宿主中表达的多肽的核酸。
本发明的组合物和药物可以包括一种或多种附加的药用成分。这样的一种药用成分可以包含于药用组合物中。这样的药用成分的实例包括，但不限定于下面所描述的成分中枢神经系统药物(例如，全身麻醉药、镇静催眠药、抗焦虑药、抗癫痫药、抗炎药、中枢神经兴奋药、抗眠药、抗帕金森药、抗精神病药、复合感冒药等)；周围神经药物(例如，局部麻醉药、骨骼肌松弛剂、自主神经药、解痉药等)；感觉器官药物(例如，眼科药、耳鼻喉科药、抗眩晕药等)；循环器官药物(例如，强心剂、抗心律失常药、利尿剂、抗高血压药、血管收缩剂、血管扩张剂、抗高血脂药等)；呼吸器官药物(例如，呼吸兴奋剂、止咳药、祛痰药、止咳祛痰药、支气管扩张剂、嗽口水等)；消化器官药物(例如，收敛剂、消胀剂、消化性溃疡药、健胃药、抗酸剂、泻药、灌肠剂、利胆剂等)；激素药(例如，垂体激素药、唾液腺激素药、甲状腺激素药、副甲状腺激素药、促蛋白合成类固醇、肾上腺激素药、雄激素药、雌激素药、孕酮药、混和激素药等)；泌尿生殖器官和肛门药物(例如，泌尿器官药、生殖器官药、子宫收缩剂、痔疮药等)；皮肤药物(例如，皮肤消毒剂、伤口保护剂、化脓性病药、镇痛药、止痒剂、收敛剂、消炎药、抗寄生虫皮肤病药、润滑剂、毛发药物等)；牙科和口腔药物；其它器官的药物；维生素药物(例如，维生素A药、维生素D药、维生素B药、维生素C药、维生素E药、维生素K药、混和维生素药等)；营养药(例如，钙剂、无机药剂、糖剂、蛋白氨基酸药剂、有机药剂、婴儿药剂等)；血液和体液药(例如，血液代用品、止血药、抗凝药等)；透析药物(例如，肾脏透析药、腹膜透析药等)；其它代谢药物(例如，器官疾病药、解毒剂、安塔布司、抗通风药、酶药剂、糖尿病药和其它药物)；细胞活化剂(例如，叶绿素、色素药等)；肿瘤药(例如，烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素药剂、抗肿瘤植物提取药剂等)；放射性药物；过敏药物(例如，抗组胺药、刺激治疗药物、非特异性免疫原药剂、和其它过敏药物、天然药物以及基于中药的药物、天然药物、中药药剂、药剂其它基于天然药物和中药剂型的药剂)；抗生素药(例如，作用于革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性支原体、革兰氏阴性支原体、革兰氏阳性立克氏体、革兰氏阴性立克氏体、抗酸细菌、霉菌等)；化疗药(例如，磺胺药物、抗结核药、合成的抗微生物药、抗病毒药等)；生物制品(例如，疫苗、类毒素、抗毒素、钩端螺旋体抗血清、血液制品、生物测定制品、以及其它生物制品、和抗原虫药、驱虫药等)。
在此可以随意应用本领域熟知的分子生物学技术、生物化学技术和微生物技术。在例如Ausubel F.A.等编(1988)，″Current Protocols inMolecular Biology″，Wiley，New York，NY；Sambrook J.等(1987)，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2nd Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Bessatsu Jikken Igaku，″Idenshi-Donyu&Hatsugen-Kaiseki-Jikkenho″[Experimantal Medicine，Special Issue，″Experimental Methods for Gene Introduction&Expression Analysis″，Yodo-sha，1997等中描述了这些方法。
通常可以使用通过将种子病毒接种于受精的鸡蛋内并在其中扩增的病毒(例如HVJ)。同样的，可以使用在猴的或人的培养细胞或组织的持续感染株中扩增的病毒(培养基中添加有水解酶，例如胰蛋白酶等)。同样的，本发明可以使用在被能诱发持续感染的克隆的病毒基因组所感染的培养细胞内所扩增的病毒。本发明也可以使用这些突变株。另外，也可以使用通过其它方法所获得的病毒(例如，HVJ等)。可以使用重组HVJ(Hasan M.K.et al.，Journal of General Virology，78，2813 to 2830，1997；或Yonemitsu Y.et al.，Nature Biotechnology，18，970to 973，2000)。可以使用任何一种HVJ。Z株(例如编号No.ATCC VA 2388或从查尔斯河SPAFAS购得的病毒株)或Cantell株(例如，Johnston M.D.，J.Gen.Virol.，56，175-184，1981或从查尔斯河SPAFAS购得的病毒株)是更合乎要求的。
发明的最佳实施方案在一个方面，本发明提供了一种将生物分子导入细胞内的体系。该体系包括1)一种生物分子；2)一种病毒包膜；以及3)一种糖胺聚糖。本发明发现了糖胺聚糖(例如肝素)通过用病毒包膜提高生物分子导入细胞内的作用。尽管不希望受到任何理论的约束，现在相信添加糖胺聚糖实现了改变或减弱细胞强度的作用，因此增强将生物分子导入细胞内。因此，所用的糖胺聚糖分子可以是任何一种糖胺聚糖，以及优选地使用具有葡糖胺残基的糖胺聚糖，以及更优选地可以使用肝素。尽管不希望受到任何理论的约束，现在相信糖胺聚糖是优选的，因为它具有作为残基的葡聚糖，它具有促进通过血脑屏障的作用。在所用的肝素中，具有高分子量(例如，10,000kDa或更高，更优选地，11,000kDa或更高，仍更优选地，12,000kDa或更高)的肝素是优选的，以及更优选地，使用具有12,000到15,000kDa平均分子量的肝素。然而，可以使用具有比这些分子量更低分子量的肝素。硫酸化程度对输送的效率具有一些影响。因此，所用的优选的肝素是具有药用可接受的硫酸化程度的肝素。如上所述，可以使用非肝素的分子。这些分子包括但不限于例如，透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、以及它们的混合物和聚合物。尽管不希望受到任何理论的约束，相信这些分子具有硫酸残基，因此促进输送到体内。在本发明的体系中所包括的这些糖胺聚糖的单位常为1U/ml。在本应用的体系中优选地包括至少5U/ml糖胺聚糖，更优选地包括至少10U/ml，仍更优选地包括至少50U/ml，最优选地包括至少100U/ml。
在一个实施方案中，本发明所用的病毒包膜是灭活的。这样的灭活包括但不限于通过紫外线照射、烷基化等的灭活。
在一个实施方案中，本发明所用的病毒包膜可以是RNA病毒的包膜。优选地，这样的病毒包膜可以是属于副粘病毒(Paramixovirus)属的病毒(例如HVJ、流感病毒)的包膜，优选的是HVJ包膜。
通过本发明的体系所导入的生物分子可以是在上文中所描述的任何分子，以及常包括选自由核酸、多肽、脂类、糖、及其复合分子所构成的组的分子。优选地，这样的生物分子包括核酸和多肽。在一个实施方案中，这样的生物分子包括核酸。在另一个实施方案中，这样的生物分子包括多肽。
在一个特定的实施方案中，本发明所导入的生物分子是编码选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)构成的组的基因的核酸。
在另一个实施方案中，本发明所导入的分子是选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)构成的组的多肽。
在一个优选的实施方案中，糖胺聚糖(例如肝素)、生物分子和病毒包膜可以包括于同一组合物中。在这种情况中，组合物中的同质性是没有问题的。
在另一个优选的实施方案中，糖胺聚糖(例如肝素)、生物分子和病毒包膜可以包括于不同的组合物中。在这种情况中，可以同时或分别施用两种组合物。优选地，生物分子被包括于病毒包膜中，使得生物分子被有效地输送。
在另一方面，本发明提供了一种将生物分子导入细胞内的方法，包括步骤1)将包括病毒包膜和生物分子的组合物施用于细胞；以及2)将糖胺聚糖施用于细胞。在上文中描述了本发明所用的生物分子(例如核酸或多肽)和糖胺聚糖(例如肝素)的优选的实施方案。
在本发明中，施用糖胺聚糖(例如肝素)步骤可以与施用包括病毒包膜和生物分子的组合物步骤一起、之前或之后进行。优选地，在施用组合物的同时或仅仅之前，施用糖胺聚糖。更优选地，同时施用组合物和糖胺聚糖。当进行同时给药时，糖胺聚糖可以包含或不包含于组合物中。
在另一个方面，本发明提供了糖胺聚糖在生产用于将生物分子导入细胞内的药物的用途。在该用法中，所权利要求的药物包括1)一种生物分子；2)一种病毒包膜；和3)一种糖胺聚糖。在上文中描述了生物分子(例如核酸和多肽)、病毒包膜(例如HVJ包膜)和糖胺聚糖(例如肝素)的优选的实施方案。
在另一个方面，本发明提供了将生物分子输送到脑部的方法。该方法包括步骤1)短暂地阻断头部或颈部动脉；以及2)在阻断头部或颈部动脉期间，将生物分子导入到脑内。在此短暂地阻断动脉有着意想不到的效果，它可以高效地(例如两倍或更高)将生物分子导入到脑部，因为认为血脑屏障(BBB)所造成的血管和脑部之间的明确界限使得生物分子不能被导入到脑部。短暂阻断动脉的方法包括球囊导管、夹子、生理阻断的脑梗死等。优选地使用球囊导管和夹子。“短暂”在此指的是有效地施用生物分子的一段时间(例如，至少1分钟、5分钟等)，以及优选的是1-120分钟。
在一个实施方案中，生物分子可以是上述的任何一种分子，以及优选地选自由核酸、多肽、脂类、糖、和它的复合分子构成的组。在优选的实施方案中，生物分子包括核酸。
在一个优选的实施方案中，生物分子是编码选自由血管化因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、HIF-1、DEL-1等；抗凋亡剂例如Bcl-2等；脑保护剂例如BDNF等；或抗氧化剂例如Mn-SOD等所构成的组的基因的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，通过载体输送所导入的核酸。这样的载体可以随意地包括转录调节序列例如启动子、增强子等。优选地，载体可以是一种表达载体。构建载体在本领域是熟知的。
在一个实施方案中，用病毒包膜导入生物分子。优选地，本发明所用的病毒包膜是灭活的。灭活减少了不必要的毒性等。可以通过包括但不限于UV照射、应用烷化剂等的任何方法实现灭活。
在另一个实施方案中，病毒包膜可以是RNA病毒的包膜。优选地，所用的病毒包膜是属于副粘病毒属的病毒(例如HVJ、流感病毒)的包膜。最优选地，所用的病毒包膜是HVJ的包膜。
在一个优选的实施方案中，可以将生物分子和糖胺聚糖一起导入到脑部。糖胺聚糖可以是任何一种分子，以及优选的是肝素。可以使用任何一种糖胺聚糖，以及优选的糖胺聚糖的分子量是至少10,000kDa，更优选的是至少11,000kDa，更优选的是至少12,000kDa。在一个优选的实施方案红，肝素的分子量是12,000到15,000kDa。
在一个实施方案中，至少包括50U/ml糖胺聚糖。
在此优选的是糖胺聚糖(例如肝素)的硫酸化的程度是药用可接受的。
在一个实施方案中，可以与施用生物分子同时、之前或之后施用糖胺聚糖。优选地，同时施用糖胺聚糖和生物分子。
在一个优选的实施方案中，阻断头部或颈部动脉1分钟到120分钟。
在一个实施方案中，头部或颈部的动脉是大脑中动脉或颈动脉。在一个优选的实施方案中，头部或颈部的动脉是大脑中动脉。
在一个实施方案中，生物分子被施用到颈动脉、丘脑内、脑室内或鞘内。
在一个优选的实施方案中，将生物分子施用到颈动脉。颈动脉是优选的，因为它给大范围的脑实质供应血。
在另一方面，本发明提供了将生物分子输送到脑部的试剂盒。试剂盒包括1)一种生物分子；以及2)说明施用生物分子的方法的说明书，方法包括A)短暂阻断头部或颈部动脉；以及B)在阻断头部或颈部动脉期间，将生物分子导入到脑内。在上文中描述了短暂阻断的方法。
试剂盒中所含的生物分子可以是任何一种分子，但优选地是选自由核酸、多肽、脂类、糖及其复合分子的组。优选地，生物分子包括核酸。
优选的生物分子在此是编码选自由血管化因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、HIF-1、DEL-1等；抗凋亡剂例如Bcl-2等；脑保护剂例如BDNF等；或抗氧化剂例如Mn-SOD等所构成的组的基因的核酸分子。
通过载体输送试剂盒中所含的核酸。载体在此可以是任何一种载体，只要载体可以表达这样的核酸。优选地，使用能在哺乳动物(优选是人)内有效地表达核酸的载体。
在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包括病毒包膜。
优选地灭活病毒包膜，使得可以避免它们的副作用。
优选地，病毒包膜可以是RNA病毒的包膜。
更优选地，病毒包膜是属于副粘病毒属的病毒(例如HVJ、流感病毒等)的包膜。
最优选地，病毒包膜是HVJ包膜。
本发明的试剂盒还可以包括糖胺聚糖。
所用的糖胺聚糖在此优选地但不限定于肝素。
在一个实施方案中，所用的糖胺聚糖的分子量是至少10,000kDa，更优选地是至少11,000kDa，更优选地是至少12,000kDa。更优选地，肝素的分子量是12,000-15,000kDa。
在一个实施方案中，至少包括50U/ml在本发明的试剂盒中所含的糖胺聚糖。
在一个优选的实施方案中，糖胺聚糖(例如肝素)的硫酸化的程度是药用可接受的。
在一个优选的实施方案中，可以与施用生物分子同时、之前或之后施用糖胺聚糖。更优选地，同时施用糖胺聚糖和生物分子。
在本发明的试剂盒的一个优选的实施方案中，阻断头部或颈部动脉1分钟到120分钟。在一个优选的实施方案中，头部或颈部的动脉是大脑中动脉或颈动脉。另外，头部或颈部的动脉是大脑中动脉。
在本发明的试剂盒的一个优选的实施方案中，生物分子被施用到颈动脉、丘脑、脑室内或鞘内，但本发明并不限于此。
在本发明的试剂盒的一个优选的实施方案中，生物分子被施用到颈动脉。
在另一方面，本发明提供了生物分子用于生产将生物分子输送到脑内的试剂盒的用法。试剂盒包括A)一种生物分子；以及B)说明施用生物分子的方法的说明书，方法包括a)短暂阻断头部或颈部动脉；以及b)在阻断头部或颈部动脉期间，将生物分子导入到脑内。
照此，本发明者已经研究了用本发明的病毒包膜(例如，HVJ-E载体)体外或体内将基因输送到CNS内的可能性。如下面的实施例所证实的一样，当使用Venus报道基因时，能在鼠的大脑皮层神经元和胶质细胞中测定到荧光。通过将基因直接注射到丘脑、脑室内或鞘内，报道基因(Venus或EGFP)被成功地转染到鼠脑部，且不诱发免疫反应。在经颈总动脉的动脉内注射后，没有观察到基因表达，但是，当在短暂阻断后将载体注射到大脑中动脉内后，只在受损半球内检测到EGFP或萤光素酶活性。最后，为了增加转染效率，测定了肝素的作用。加入50U/ml肝素显著地增加了萤光素酶活性(p＜0.05)。
总而言之，HVJ-E载体能高度有效地将基因转染到CNS内，且无任何明显的毒性。HVJ-E可用于测定大量基因的作用以及用于治疗脑血管疾病。
在下文中，根据实施例描述本发明。以下的实施例只用作为举例说明的目的。因此，本发明的范围不局限于上面的描述以及下面的实施例，而只受所附录的权利要求书的限定。
实施例实施例1使用HVJ的方法材料和方法HVJ-包膜载体将导入HVJ(Z株)(10,000血凝单位)与质粒DNA(200μg)和0.3％Triton-X混和。用平衡盐溶液(BSS；137mM NaCl；5.4mM KCl和10mMTris-HCl，pH7.6)洗涤混合物。然后重悬于10μl(用于经脑给药)、100μl(用于经鞘内或经动脉给药)、或400μl(用于培养细胞)的磷酸缓冲液(PBS，pH7.5)中。对于体外研究，在用载体处理之前，加入鱼精蛋白(Nakalai tesque，日本)以增强转染效率。对于共注射肝素(Aventis，日本)，低分子量肝素(Fragmin，Kissei，日本)，或阿加曲班(Argatroban)(Slonnon，Daiichi，日本)的情况，将它们与PBS混和并加入到载体中。
质粒DNApEGFP-C1购自Clontech(CA，USA)。通过将pGL3-启动子载体(Promega，Madison，WI，USA)的萤光素酶基因克隆到pcDNA3(5.4kb)(Invitrogen，San Diego，CA，USA)的HindIII和BamHI位点构建出pCMV-萤光素酶-GL3(pcLuc-GL37.4kb)。用Qiagen质粒分离试剂盒(Hilden，德国)纯化质粒。通过将pSV-β-半乳糖苷酶的HindIII-BamHI片段插入到pcDNA3可以构建出pCMV-LacZ(9.2kb)。
Venus/pCS2由Nagai博士(Laboratory for Cell Function and Dynamics，Advanced Technology Development Center，Brain Science Institute，RIKEN，Japan)惠赠。
(测定Venus的荧光)在注射后96个小时，在荧光立体显微镜下观察Venus的表达。用共聚焦激光显微镜(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)得到更精确的图像。
(检测萤光素酶活性)在转染后24个小时，麻醉下处死被萤光素酶基因转染的大鼠。收集器官(脑、肺、脾和肝)并分别放置在FALCON 50ml管中。如前所述进行萤光素酶活性检测[Brewer GJ，Torricelli JR，Evege EK，Price PJ.，JNeurosci Res.1993；35567-76.]。通过测定组织提取物的蛋白浓度将萤光素酶水平标准化[Brewer GJ，Torricelli JR，Evege EK，Price PJ.，J NeurosciRes.1993；35567-76.]。用每克组织蛋白的相对光单位(RLU)表示萤光素酶单位。
(体外基因转移)从怀孕19天的妊娠Wistar大鼠(Charles River Japan，Atsugi，Japan)中取得鼠胚胎的大脑皮层神经元并培养[Belayev L，et al.，Stroke.1996；271616-22；discussion 1623FF09]。简单地，切下大脑皮层并通过木瓜蛋白酶的处理分离出单个细胞，并将细胞碾碎于Leibovitz s L-15培养基(Invitrogen，CA，USA)中。在37℃、95％空气-5％CO2的潮湿大气下，将细胞培养于加有DMEM(Invitrogen)/B-27(Invitrogen)的聚合-D-赖氨酸包被的24孔塑料培养皿中。在第1天和第4天更换培养基。第7天的MAP2(微管相关蛋白)免疫阳性细胞比例为92.9％。在转染前，将培养基更换为每孔500μl新鲜DMEM。将含有Venus基因的HVJ-E载体(250HAU)加入到每个孔中并在37℃下保持10分钟。在转染后，将培养基更换为新鲜DMEM/B-27，并将培养皿孵育在37℃。在转染2天后，用激光扫描共聚焦显微镜成像观察Venus的表达。转染效率(％)计算为(表达Venus的细胞数目/NeuN免疫反应细胞的数目)×100。为了平均效率，随机选择5个视野并计数细胞数目。
(免疫组化)用4％多聚甲醛在37℃固定体外培养细胞15分钟，并用0.5％TritonX-100处理细胞10分钟。用含有2％山羊血清、牛血清白蛋白(5mg/ml)和甘油(50mM)的PBS封闭细胞。然后，将细胞与抗MAP2的鼠单克隆抗体(1:1000，Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)或者抗GFAP的鼠单克隆抗体(Glial Fibrillary Acidic Protein，1:1000，Sigma-Aldrich)在4℃孵育过夜。在用PBS洗涤后，加入作为第二抗体的Alexa Fluor 546-偶联的山羊抗鼠IgG(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)，并将培养皿在室温下孵育1个小时。用共聚焦激光显微镜分析图像。
(正常鼠的体内基因转移)本发明使用Wistar雄性大鼠(270-300g；Charles River Japan，Atsugi，Japan)。根据大阪大学指南进行所有操作。用氯胺酮(三共，日本)将鼠麻醉并将鼠放置于立体支架(Narishige Scientific Instrument Laboratory，Tokyo，Japan)上，暴露出头颅。将带有特殊设计的Teflon连接器的不锈钢套管(30号，Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)导入到丘脑(前囟后3.8mm，中线外侧2.4mm，以及头颅表面下5.0mm)或侧脑室(前囟前0.48mm，中线外侧0.8mm以及头颅表面下3.8mm)。以1.0μl/min的速度注射含有Venus基因或EGFP基因的HVJ-E载体。在输注后，取出输注套管。在所有的动物中没有观察到任何的行为改变例如惊厥或肢体的异常活动。
对于蛛网膜下腔的输注，将每个动物的头固定在俯卧位，并通过枕颈中线切口暴露出环枕膜。将不锈钢套管(27号；Becton-Dickinson)导入到小脑延髓池(蛛网膜下腔)内。在取出100μl CSF后，以50μl/min的速度输注含有萤光素酶或Venus基因的HVJ-E载体(100μl)，然后将动物头低位放置30分钟。对于颈总动脉的输注，在手术显微镜(Konan，日本)下，经中线切口分离出左颈总动脉、左颈外动脉和左颈内动脉。暂时结扎左颈总动脉和颈内动脉，并将PE-50导管(Clay Adams，Parsippany，NY，USA)经左颈外动脉的切口导入到左颈总动脉内。以25μl/min的速度注射含有EGFP或萤光素酶基因的HVJ-E载体(100μl)。注射后，取出套管并解开结扎处以恢复颈总动脉内的血流。在每个方法中，在转染4天后观察EGFP或Venus以及在转染1天后测定萤光素酶活性。也在经鞘内注射1天后测定脾、肺和肝脏的萤光素酶活性。所有的鼠在给药后没有出现体重减轻或活性缺失。为了明确注射载体后的组织学改变，在经脑室和经鞘内注射14天后进行冠状切面的HE染色。从前囟的+1.0mm、-13.30mm、-5.30mm、-11.30mm和-14.60mm生成冠状切面。
(短暂阻断大脑中动脉后的体内基因转移)为了制成大脑中动脉阻断模型，如前所述的[Belayev L et al.，Stroke27，1616-1622(1996)]，通过在MCA的起始部放置聚L-赖氨酸涂层的4-0尼龙以阻断左侧大脑中动脉。简单的，利用面罩用氟烷(1-3.5％的70％N2O和30％O2混合物)麻醉动物。在整个手术操作中用反馈调节的加热板将直肠温度保持在37±1℃。在手术显微镜下，经中线切口分离出左颈总动脉、左颈外动脉和左颈内动脉。短暂地结扎颈总动脉和颈内动脉60分钟后，取出4-0尼龙并再灌注10分钟。然后再短暂地结扎颈总动脉和颈内动脉。如上所述，从颈外静脉将PE-50导管放置在颈总动脉，在解开结扎后以10μl/min的速度注射载体。注射后，取出PE-50导管并用6-0尼龙结扎颈外动脉。在输注后1天或3天观察萤光素酶或EGFP的表达。
(结果)(对培养的大鼠大脑皮层细胞的转染)为了发展一种将基因转移到CNS内的有效方法，我们将报道基因(Venus基因)转染到培养的大鼠大脑皮层细胞(E19)内，因为Venus报道基因已经被报道为一种容易检测的转染方法。报道了Venus可用作容许可靠并容易检测到脑切片中的荧光信号的受体的[Nagai T，et al.，NatBiotechnol.2002；2087-90.]。在转染2天后，培养的鼠大脑皮层细胞证实培养细胞具有容易检测的荧光(图1a、1d和1g)。利用免疫组化染色，细胞是MAP2(微管相关蛋白2；神经元标记物)、NeuN(神经元核抗原；神经元标记物)或GFAP(神经胶质酸性蛋白；神经胶质和星状细胞标记物)免疫阳性的(图1c、1f和1i)。从Venus阳性细胞数目/NeuN阳性细胞数目所计算得到的神经元细胞转染效率是26.7～6.4％，同时在用对照载体转染的细胞中没有测定到阳性细胞。在用HVJ-E载体转染后，没有观察到细胞死亡。
(脑部的体内基因转移)之后，我们测定了Venus基因的脑部转染。首先，我们将含有强化绿色荧光蛋白(EGFP)基因的HVJ-E载体注射到丘脑和侧脑室内。对丘脑的EGFP基因的立体定位注射显示在注射部位的有限的表达(图2a)。在对侧脑室的立体定位注射后，可以在脉络丛和室管膜细胞上检测到荧光(图2b和2c)。意想不到的是，在神经元上没有检测到荧光信号。另一方面，在用对照载体转染的脑部或在未转染的脑部没有检测到荧光的阳性染色。之后，我们将基因注射到蛛网膜下腔。在这个实验中，我们用Venus报道基因代替EGFP，因为应用Venus报道基因是一种容易检测的转染方法。经小脑延髓池对脑脊液的注射造成了Venus在脑膜上的广泛表达，但是在脉络丛或神经元上只有很少量的表达(图3a和3b)。重要的是，经鞘内注射3天后的冠状切面的HE染色显示没有炎性改变。
(短暂阻断大脑中动脉后的CNS的基因转染)考虑到临床单位内的脑缺血性疾病的治疗，似乎最好采用蛛网膜下腔输注而不采用利用立体定位支架对侧脑室的注射。为了进一步探讨利用HVJ-E载体的基因治疗在脑缺血上的可行性，我们测定了经颈动脉的CNS的基因转移。然而，在注射后3和7天，对颈动脉的动脉内输注造成了转基因在脑部和微血管内皮细胞上的少量表达。为了克服这个问题，我们假设脑缺血后的基因转移可以表现出CNS的不同的转染效率，因为脑缺血造成了血脑屏障的改变[Belayev L，Busto R，Zhao W，GinsbergMD.，Brain Res.1996；73988-96.；Kuroiwa T，Ting P，Martinez H，Klatzo I.，Acta Neuropathol.1985；68122-9.；and Neuann-Haefelin T，et al.，Stroke.2000；311965-72；discussion 1972-3.]。因此，我们在短暂阻断大脑中动脉60分钟后，将含有Venus基因的HVJ-E载体输注到颈动脉内。有趣的是，在短暂阻断3天后，在梗死的大脑皮层可以检测出Venus的荧光(图4)。使用萤光素酶基因的实验证实了CNS转染的可行性。在注射后24小时，在梗死半球内的萤光素酶活性要比对侧半球的活性高(图5，P＜0.05)。另一方面，在脾、肺和肝脏没有检测到萤光素酶活性。
最后，我们研究了共施用肝素是否能增加转染效率。在制成含有萤光素酶基因的HVJ-E载体后，将10、50或100U/ml浓度的肝素加入到载体中。将HVJ-E载体经小脑延髓池注射到CSF中。如图6所示，加入50U/ml肝素戏剧性地增加了萤光素酶活性(P＜0.05)。为了阐明用肝素增加转染效率的机制，我们测定了1、5、10、50、100或200U/ml低分子量肝素(LMWH)，或0.1或0.2mg/ml阿加曲班的作用。然而，低分子量肝素和阿加曲班都不影响萤光素酶活性。
(讨论)过去，我们报道了HVJ-脂质体转染方法对鼠和灵长类的CNS的转染效率[Yamada K，et al.，Am J Physiol.1996；271R1212-20.；Hagihara Y，et al.，Gene Ther，2000；7759-63.；and Hayashi K，et al.，Gene Ther.2001；81167-73.]。HVJ-脂质体方法利用脂质体和来源于HVJ包膜的蛋白[Kaneda Y，Saeki Y，Morishita R.，Mol Med Today.1999；5298-303.]对各种细胞及组织的融合活性的组合。但是，制作HVJ-脂质体囊泡的方法是费时及复杂的。另外，长期的储存是不可能的。这些问题可以影响HVJ-脂质体复合物在人基因治疗上的应用。为了克服这些问题，我们最近发展出了第二代HVJ载体，也称为HVJ-包膜(HVJ-E)载体。为了生成这个HVJ-E载体，在HVJ的病毒基因组已经被完全断裂后，将转基因插入到HVJ的包膜中。与HVJ-脂质体载体比较，HVJ-E载体的优点是(1)容易制作；(2)生成不需要太多时间(少于90分钟)；以及(3)HVJ-E可以长期储存(至少6个月)。在本发明中，我们证实了利用HVJ-E载体体内和体外对CNS的基因转移的可能性。在这个体外研究中，报道基因被成功地表达于神经元(MAP2阳性细胞或NeuN阳性细胞)和星状胶质细胞(GFAP阳性细胞)中，且没有诱导细胞死亡。而如果用非病毒载体，有丝分裂细胞可以被很好地转染，但对例如静止(G0)神经元的非有丝分裂细胞的转染很差[Berry M，et al.，Curr Opin Mol Ther.2001；3338-49.]。但是，在本发明中，用HVJ-E载体将报道基因成功地转染到非有丝分裂细胞内。因为抗富含于神经元细胞表面的唾液酸的病毒报道子的存在，所以可以获得有效的转染。
重要的是，对于体内基因转移，使用HVJ-E载体的基因表达的分布不同于用HVJ-脂质体的分布。经鞘内注射的HVJ-脂质体方法可以在脑实质中观察到β-半乳糖苷酶基因的表达[Hagihara Y，et al.，Gene Ther.2000；7759-63.；and Hayashi K，et al.，Gene Ther.2001；81167-73.]，而用HVJ-E只在脑膜和动脉的外膜细胞中检测到基因的表达。另外，经脑室内阳离子脂质体介导的(HVJ阳离子脂质体介导的)基因转移表明基因在脑实质内的表达[Zou LL，et al.，Gene Ther.1999；6994-1005.]，而HVJ-E载体介导的基因转染发现只在脉络丛和室管膜细胞上有基因表达。考虑到将HVJ-E载体直接注射到丘脑内造成基因成功地转染到脑实质内的事实，脂质体的存在对于跨越脑膜或室管膜细胞是重要的。本发明者以及其他的发明者已经报道一些用于利用立体定位框架的侧脑室内给药的高转染效率的基因转移方法(Yoshimura S，et al.，Hypertension.2002；391028-34.；and Yukawa H，et al.，Gene Ther.2000；7942-9.)，但是这些技术具有相当大的创伤性。幸运的是，本发明者已经发现在输注到小脑延髓池后，观察到了脑膜表面上的转基因的表达。另外，本发明清楚地证实在短暂阻断大脑中动脉后，重新开放动脉并经动脉内注射HVJ-E载体将基因转移到CNS内是有可能的。血脑屏障阻断的破坏是有争议的[Belayev L，Busto R，Zhao W，Ginsberg MD.，Brain Res.1996；73988-96.；Kuroiwa T，Tinc P，Martinez H，Klatzo I.，Acta Neuropathol.1985；68122-9.；and Neumann-Haefelin T，et al.，Stroke.2000；311965-72；discussion1972-3.]。Kuroiwa等证实血脑屏障在短暂阻断大脑中动脉1小时后的双相开放，首先出现在解除阻断后15分钟，然后出现在再灌注后5和72小时(Kuroiwa T，Ting P，Martinez H，Klatzo I.，Acta Neuropathol.1985；68122-9.)。在这段有限时间内输注HVJ-E载体将容许我们将治疗基因经动脉内方式转染到脑实质中。应当注意到共施用肝素将增加HVJ-E载体转染的效率。这些结果与共输注肝素和AVV载体诱导了更高和更多的同源基因的表达的报道是相似的[Mastakov MY，Baer K，Kotin RM，DuringMJ.，Mol Ther.2002；5371-80.29.；and Nguyen JB，Sanchez-Pernaute R，Cunningham J，Bankiewicz KS.，Neuroreport.2001；121961-4.]。预计肝素影响了2，3交联的唾液酸teoglyacid(一种病毒结合受体)并增强转染效率，或肝素与病毒受体结合以限制与细胞表面的HSPG的相互作用。为了阐明这个机制，我们测定了低分子量肝素(LMWH)和相似物质例如阿加曲班的作用。然而，用这些物质没有观察到转染效率的增加。传统肝素(12,000-15,000kDa)和LMWH(5000kDa)之间的区别仅仅在于分子大小和硫酸化程度的不同[Ishai-Michaeli R，et al.，Biochemistry.1992；312080-8.]。这些因素似乎是影响着HVJ-E载体和靶细胞表面之间的相互作用。
在此本发明证实了体内和体外利用HVJ-E载体转染CNS的显著的转染效率并且没有明显的毒性，同时在不同的给药途径之间有着不同的基因表达的部位。短暂的动脉阻断后的经动脉内注射的成功的基因转染提供了一种治疗脑缺血的有希望的方法。另外，根据我们的认识，没有证据显示HVJ具有可使人体致病的副作用[Okada Y.，Methods Enzymol1993；2211，18-41.；and Okada Y，Tadokoro J.，Exp Cell Res 1962；26，108-118.]，并且HVJ可被合适的化学修饰完全灭活且不丢失融合活性。在本发明中，经鞘内或脑室内给药表明无体重丢失、无神经缺陷以及无炎性改变。另外，经鞘内注射后在任何其他的器官都没有观察到萤光素酶活性。因此，HVJ-E用于转染脑部似乎是安全的。对于免疫原性，用HVJ-脂质体方法反复施用质粒DNA和反义诱饵DNA寡核苷酸(ODN)5次没有造成任何生物学作用的丢失或抗HVJ抗体的生成(Morishita R，Gibbons GH，Kaneda Y，Ogihara T，Dzau VJ.，Biochem Biophys ResCommun 2000；273666-674；and Hirano T，et al.，Gene Ther 1998；5459-464.)。据此，HVJ-E载体可以是一种用于治疗脑血管疾病的合适的基因转移方法。
实施例2利用其他病毒载体的输送(流感病毒的制备)从受精的鸡蛋中获得属于正粘病毒科的流感病毒，并主要根据WO96/05294将其繁殖。简言之，按如下进行需要仔细地选择并从特别安全的健康农场中得到受精蛋。将蛋放置于37.8℃的孵育箱中9天到12天。在将流感病毒接种到尿囊中之前，将蛋放到烛光中观察胚胎的生长或存活。
此后，为了在最优化的条件下用病毒感染蛋，将蛋在具有可控温度和湿度的培养孵育箱中培养2天到3天。根据所用的流感病毒的株和类型，条件有所不同。培养物被快速地冷却到5±3℃以阻断病毒的扩增。此后，从受感染的蛋中收集到含有大量病毒颗粒的尿囊液。需要快速地纯化所得到的含有流感病毒的尿囊液以去除杂质例如蛋白(例如卵清蛋白等)、卵磷脂、细菌等等。为了实现这一点，离心所收集的物质并去除上清，随后在纯化病毒前将物质超滤浓缩20倍。
(烷基化过程)在使用前即刻，将0.01％β-丙酸内酯制备于10mM KH2PO4中。在低温下快速进行此操作。
将β-丙酸内酯加入到上述获得的流感病毒浓缩溶液中，随后在冰中孵育60分钟。此后，在37℃进行孵育2小时。将所得到的溶液分散到埃彭道夫管中，随后在15,000rpm离心15分钟。将沉淀物储存在-20℃。任选的，该流感病毒可被超滤。
用利用500KMWCO(A/G Technology，Needham，Massachusetts)的超滤将绒毛尿囊液浓缩约10倍。将50mM NaCl、1mM MgCl2、2％甘露醇、20mM Tris(pH7.5)用作为缓冲液。用HA检测得到流感病毒包膜的回收率接近100％。这是一个极好的结果。
利用Q-SepharoseFF(Amersham Pharmacia Biotech K.K.，Tokyo)(缓冲液20mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，NaCl从0.2M到1M)进行柱层析以纯化流感病毒包膜。结果是，回收率为从40％到50％，以及纯度是99％或更高。
照此，从含有绒毛尿囊液的流感病毒中制备得到灭活的流感病毒包膜。
研究了利用流感病毒包膜对脑部的输送。和实施例1一样，我们已经研究了体外和体内用流感病毒包膜对CNS的基因转移的可能性。当使用Venus报道基因时，可以在大鼠的大脑皮层神经元和胶质细胞中检测到荧光。在体内试验中，通过直接注射到丘脑内、经脑室内注射或经鞘内注射，报道基因(Venus或EGFP)被成功地转染到鼠脑中且没有诱发免疫改变。在经颈总动脉的动脉内注射后，没有观察到基因表达，但是当载体被注射到被短暂阻断的大脑中动脉时，只在受损半球中检测到EGFP或萤光素酶活性。最后，测定了肝素对增加转染效率的作用。加入50U/ml肝素显著地增加了萤光素酶活性。
照此，证实了不仅HVJ-E载体而且来源于HVJ-E载体的载体在短暂阻断脑动脉后都显著地增加了对脑部的基因转移的效率，以及加入肝素增加了流感病毒包膜输送生物分子的效率。
实施例3使用腺伴随病毒的方法下面，用腺伴随病毒进行与实施例1和2相似的试验。将AVVHelper-Free体系(Stratagene)用作为腺伴随病毒。
如实施例2所描述的一样进行烷基化过程。
研究了利用腺伴随病毒包膜对脑部的输送。和实施例1一样，我们已经研究了体外和体内用腺伴随病毒包膜对CNS的基因转移的可能性。当使用Venus报道基因时，可以在鼠的大脑皮层神经元和胶质细胞中检测到荧光。在体内试验中，通过直接注射到丘脑内、经脑室内注射或经鞘内注射，报道基因(Venus或EGFP)被成功地转染到鼠脑中且没有诱发免疫改变。在经颈总动脉的动脉内注射后，没有观察到基因表达，但是当载体被注射到被短暂阻断的大脑中动脉时，只在受损半球中检测到EGFP或萤光素酶活性。最后，测定了肝素对增加转染效率的作用。加入50U/ml肝素显著地增加了萤光素酶活性。
实施例4硫酸肝素用硫酸肝素(购自SEIKAGAKU INDUSTRY INC.，和Sigma-AldrichJapan)取代实施例1-3的肝素以其证实对使用HVJ、流感病毒载体和腺伴随病毒载体的相似作用。
结果是，当使用硫酸肝素时，证实增强了对脑部的基因输送效率。因此，一般的糖胺聚糖在本发明中都是有效的。
实施例5硫酸软骨素用硫酸软骨素(购自SEIKAGAKU INDUSTRY INC.，和Sigma-Aldrich Japan)取代实施例1-3的肝素以其证实对使用HVJ、流感病毒载体和腺伴随病毒载体的相似作用。
结果是，当使用硫酸软骨素时，证实增强了对脑部的基因输送效率。因此，证明一般的糖胺聚糖包括葡糖胺聚糖和半乳糖胺聚糖在本发明中都是有效的。
尽管在此描述了特定优选的实施方案，但是并不是说这些实施方案可以被解释为对发明范围的限定，除在附录的权利要求书中所设定的发明范围外。应当明白在此所引用的全部专利、出版的文献和出版物在此一同将其全部内容并入参考。
工业实用性本发明提供了一种体外和体内用病毒包膜将生物分子有效地输送到脑部和中枢神经系统(CNS)内的方法。另外，提供了利用病毒包膜高效地输送生物分子的体系和方法。因此，本发明提供了一种用于有效地将生物分子施用到神经系统内的技术，它提供了工业可应用性，其中这个技术可被用于施用各种药物。
不仅医生还有例如药师等等都可以制备本发明的组合物。相信本发明是完全工业可应用的或具有充分的用处。本发明也是工业可应用的，因为它除了用作为纯医疗目的的治疗方法外，可用作为商业目的的临床试验。另外，以间接或直接方式进行的本发明的治疗方法被认为可能用于医疗服务相关的商业，因此本发明是工业可应用的或有用的。
权利要求
1.一种将生物分子导入细胞内的体系，包括1)一种生物分子；2)一种病毒包膜；以及3)一种糖胺聚糖。
2.权利要求1的体系，其中病毒包膜是灭活的。
3.权利要求1的体系，其中糖胺聚糖是肝素。
4.权利要求1的体系，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
5.权利要求1的体系，其中所包括的糖胺聚糖的浓度至少为50U/ml。
6.权利要求3的体系，其中所述肝素的分子量为从12,000到15,000kDa。
7.权利要求3的体系，其中所述肝素的硫酸化程度是药用可接受的。
8.权利要求1的体系，其中病毒包膜是一种RNA病毒的包膜。
9.权利要求1的体系，其中病毒包膜是一种属于副粘病毒属(Paramixovirus genus)的病毒的包膜。
10.权利要求1的体系，其中病毒包膜是HVJ的包膜。
11.权利要求1的体系，其中生物分子选自由核酸、多肽、脂类、糖及其复合分子所构成的组。
12.权利要求1的体系，其中生物分子包括核酸。
13.权利要求1的体系，其中生物分子包括多肽。
14.权利要求1的体系，其中生物分子是一种编码一种选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的基因的核酸。
15.权利要求1的体系，其中生物分子是一种选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的多肽。
16.权利要求1的体系，其中肝素、生物分子和病毒包膜被包含于同一组合物中。
17.权利要求1的体系，其中肝素被包含于不同于包括生物分子和病毒包膜的组合物的另一组合物中。
18.权利要求1的体系，其中生物分子被包含于病毒包膜中。
19.一种将生物分子导入细胞内的方法，其包括以下步骤A)将一种包括病毒包膜和生物分子的组合物施用于细胞；和B)将糖胺聚糖施用于细胞。
20.权利要求19的方法，其中施用糖胺聚糖的步骤与施用组合物的步骤同时实施。
21.权利要求19的方法，其中在施用组合物的步骤之前实施施用糖胺聚糖的步骤。
22.权利要求19的方法，其中在施用组合物的步骤之后实施施用糖胺聚糖的步骤。
23.糖胺聚糖在生产用于将生物分子导入细胞内的药物中的用途，其中药物包括A)一种生物分子；B)一种病毒包膜；以及C)一种糖胺聚糖。
24.一种将生物分子输送到脑部的方法，其包括以下步骤A)短暂阻断头部或颈部的动脉；以及B)在阻断头部或颈部的动脉期间将生物分子导入脑部。
25.权利要求24的方法，其中生物分子选自由核酸、多肽、脂类、糖及其复合分子所构成的组。
26.权利要求24的方法，其中生物分子是核酸。
27.权利要求24的方法，其中生物分子是一种编码一种选自由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的基因的核酸。
28.权利要求26的方法，其中用载体输送核酸。
29.权利要求26的方法，其中用病毒包膜导入生物分子。
30.权利要求29的方法，其中病毒包膜是灭活的。
31.权利要求29的方法，其中病毒包膜是一种RNA病毒的包膜。
32.权利要求29的方法，其中病毒包膜是一种属于副粘病毒属的病毒的包膜。
33.权利要求29的方法，其中病毒包膜是一种HVJ的包膜。
34.权利要求24的方法，其中用糖胺聚糖导入生物分子。
35.权利要求34的方法，其中糖胺聚糖是肝素。
36.权利要求34的方法，其中糖胺聚糖的分子量至少为10,000kDa。
37.权利要求34的方法，其中所含的糖胺聚糖的浓度至少为50U/ml。
38.权利要求35的方法，其中所述肝素的分子量为从12,000到15,000kDa。
39.权利要求35的方法，其中所述肝素的硫酸化程度是药用可接受的。
40.权利要求34的方法，其中同时施用糖胺聚糖与生物分子。
41.权利要求34的方法，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
42.权利要求34的方法，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
43.权利要求24的方法，其中头部或颈部的动脉被阻断1分钟到120分钟。
44.权利要求24的方法，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉或颈动脉。
45.权利要求24的方法，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉。
46.权利要求24的方法，其中生物分子被施用到颈动脉、丘脑内、脑室或鞘内。
47.权利要求24的方法，其中生物分子被施用到颈动脉。
48.一种将生物分子输送到脑部的试剂盒，包括A)一种生物分子；以及B)一个说明用于施用生物分子的方法的说明书，其中方法包括1)短暂阻断头部或颈部的动脉；2)在阻断头部或颈部的动脉期间将生物分子施用到脑部。
49.权利要求48的试剂盒，其中生物分子选自由核酸、多肽、脂类及其复合分子所构成的组。
50.权利要求48的试剂盒，其中生物分子包括核酸。
51.权利要求48的试剂盒，其中生物分子是一种编码一种由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所构成的组的基因的核酸。
52.权利要求48的试剂盒，其中核酸经一种载体输送。
53.权利要求48的试剂盒，还包括一种病毒包膜。
54.权利要求53的试剂盒，其中病毒包膜是灭活的。
55.权利要求53的试剂盒，其中病毒包膜是一种RNA病毒的包膜。
56.权利要求53的试剂盒，其中病毒包膜是一种属于副粘病毒属的病毒的包膜。
57.权利要求53的试剂盒，其中病毒包膜是一种HVJ的包膜。
58.权利要求48的试剂盒，还包括一种糖胺聚糖。
59.权利要求58的试剂盒，其中糖胺聚糖是肝素。
60.权利要求58的试剂盒，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
61.权利要求58的试剂盒，其中所含的糖胺聚糖的浓度至少是50U/ml。
62.权利要求59的试剂盒，其中肝素的分子量为12,000到15,000kDa。
63.权利要求59的试剂盒，其中所述肝素的硫酸化程度是药用可接受的。
64.权利要求58的试剂盒，其中同时施用糖胺聚糖与生物分子。
65.权利要求58的试剂盒，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
66.权利要求58的试剂盒，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
67.权利要求48的试剂盒，其中头部或颈部的动脉被阻断1分钟到120分钟。
68.权利要求48的试剂盒，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉或颈动脉。
69.权利要求48的试剂盒，其中头部或颈部的动脉是大脑中动脉。
70.权利要求48的试剂盒，其中生物分子被施用到颈动脉、丘脑、脑室内或鞘内。
71.权利要求48的试剂盒，其中生物分子被施用到颈动脉。
72.一种生物分子在生产一种用于将该生物分子输送到脑部的试剂盒中的用途，该试剂盒包括A)该生物分子；以及B)一说明用于施用该生物分子的方法的说明书，其中方法包括a)短暂阻断头部或颈部的动脉；以及b)在头部或颈部的动脉被阻断期间，将该生物分子导入到脑部。
全文摘要
本发明的目的是提供一种对脑部和中枢神经系统的有效输送方法，并提供使用病毒包膜的有效输送方法。本发明提供了一种用于将生物分子导入细胞内的体系，包括A)一种生物分子；B)一种病毒包膜；以及C)糖胺聚糖。另外，本发明提供了一种将生物分子输送到脑部的方法，其包括以下步骤A)短暂地阻断头部或颈部的动脉；以及B)在阻断头部或颈部的动脉期间将生物分子导入到脑部。
文档编号C12N15/87GK1697879SQ03824690
公开日2005年11月16日 申请日期2003年8月22日 优先权日2002年8月27日
发明者金田安史, 森下龙一, 岛村宗尚 申请人:安琪士多摩奇株式会社