专利名称：葡萄糖脱氢酶的制造方法
技术领域：
本发明涉及葡萄糖脱氢酶的制造方法。由该方法得到的葡萄糖脱氢酶，可以用于葡萄糖传感器中。
背景技术：
使用对于特定底物有特异反应的酶的生物传感器的开发，不分产业领域地正在盛行起来。作为生物传感器的代表，可以举出主要在医疗领域使用的葡萄糖传感器。
葡萄糖传感器是用于构筑含有酶和电子传递物质的反应体系的器件，在利用该葡萄糖传感器的情况下，例如采用电流分析的方法对葡萄糖进行定量测定。作为酶来说，使用葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)(日本国特开2002-65778号公报)。
GOD，因为针对葡萄糖的底物特异性高、热稳定性优异、能够实现酶的批量化生产，所以，与其它酶相比，有生产成本低的优点。其反面，使用GOD的体系，因为容易受到测定样品中的溶解氧的影响，所以有溶解氧对测定结果产生影响的问题。
另一方面，使用GDH的体系不易受到测定样品中的溶解氧的影响。因此，使用GDH的体系，即使在氧分压低的环境下进行测定、对要求氧量多的高浓度样品进行测定时，也可以精度高地测定葡萄糖浓度。其反面是GDH有热稳定性差、底物特异性比GOD差的问题。
从这样的情况出发，摸索着弥补GOD和GDH双方的缺点。如国际公开WO02/36779号公报所公开的那样，作为本发明人之一的早出从温泉附近的土壤中分离出新型菌株(Burkhorderia cepacia KS1株)，由该菌株取得了新的GDH。该GDH是由α、β、γ亚单位构成的(以下称“CyGDH”)，与电子传递物质的反应速度高，在耐热性方面也没有问题，作为葡萄糖传感器用的酶是合适的。
但是，在KS1菌株中，因为CyGDH的生产性差，所以在考虑到工业化应用时，由KS1菌株批量化生产CyGDH是困难的。因此，本发明人等人，将编码α、β、γ亚单位的DNA导入大肠菌中进行表达，高效率地产生GDH。但是，该GDH是由α、γ亚单位构成的，欠缺β亚单位(以下称“αGDH”)。这样，在转化大肠菌的方法中，不能使α、β、γ亚单位全部表达。
本发明人等人，再对αGDH的特性进行了调查，结果是，虽然与CyGDH相比，αGDH与电子传递物质的反应速度小，但是比CyGDH耐热性高，相对于葡萄糖的Km小。即，与CyGDH同样，αGDH是作为葡萄糖传感器用的酶是有用的，这已确认。
目前，在制造这样有用的2种酶时，需要分别进行表达菌株的取得、培养及精制，在制造成本、效率方面是不利的。
发明内容
本发明的目的在于高效率地制造例如在葡萄糖传感器等中能够应用的2种GDH。
本发明的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，将含有编码在序列号1记载的具有葡萄糖脱氢活性的α亚单位和作为电子传递蛋白质的β亚单位的序列的DNA导入属于假单胞菌属的微生物中，形成转化体，培养该转化体，产生含有上述β亚单位的第1葡萄糖脱氢酶和不含上述β亚单位的第2葡萄糖脱氢酶。
上述α亚单位在例如还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约60kDa。另一方面，上述β亚单位，在例如还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约43kDa。
上述DNA也可以含有将在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约14kDa的γ亚单位编码的碱基序列。此时，产生上述第1及第2葡萄糖脱氢酶作为含有上述γ亚单位的产物。
作为属于上述假单胞菌属的微生物来说，可以列举恶臭假单胞菌、萤光假单胞菌、铜绿假单胞菌等，但从重组体的安全性方面考虑，优选使用恶臭假单胞菌。
上述DNA例如是属于Burkhorderia属的微生物，可以从具有产生带有葡萄糖脱氢活性的酶的能力的微生物取得。在本发明中采用的属于Burkhorderia属的微生物，如果是属于具有产生该酶能力的Burkhorderia属的微生物，就没有特别的限制，但优选Burkhorderiacepacia，特别优选Burkhorderia cepacia KS1株(以下简称为“KS1株”)。
该KS1株是早出等人从温泉附近的土壤中分离的新型菌株，从其菌学性质鉴定为Burkhorderia cepacia，被命名为KS1株。该KS1株在平成12年9月25日(2000年9月25日)在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6)以微生物保藏号第FERM BP-7306号保藏。
另外，对于KS1株以外的株，本发明人等人索取了寄存在财团法人发酵研究所(Institute for Fermentation Osaka，IFO)或理化学研究所微生物系统保存设施(Japan Collection of Microorganisms，JCM)的该Burkhorderia cepacia的几个菌株，测定了葡萄糖脱氢活性，结果确认所有的菌株都有活性。因此，作为用于取得本发明中所使用的DNA的微生物来说，可以采用KS1株以外的Burkhorderia cepacia、例如JCM5506、JCM5507、JCM2800、JCM2801、IFO15124、IFO14595。
上述DNA从Burkhorderia cepacia染色体的DNA分离，但其碱基序列及由该碱基序列编码的氨基酸序列很清楚，所以，基于这些序列，也可以通过化学合成取得。
作为上述α亚单位来说，例如可以采用具有序列号3的氨基酸序列、或在序列号3的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一个或多个的氨基酸残基的氨基酸序列的α亚单位。该α亚单位由例如序列号1的碱基序列之中由碱基序号764～2380组成的碱基序列来编码。因此，作为本发明中所使用的DNA来说，优选使用具有上述碱基序列的DNA。
作为上述β亚单位来说，例如可以采用具有序列号5的氨基酸序列、或在序列号5的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一个或多个的氨基酸残基的氨基酸序列的β亚单位。该β亚单位由例如序列号1的碱基序列之中由碱性序号2386～3660组成的碱基序列来编码。因此，作为本发明中所使用的DNA来说，优选使用具有上述碱基序列的DNA。
早出等人确认，与只表达α亚单位的情况相比，若使上述γ亚单位与α亚单位一起表达，则可以得到高的酶活性。因此，从酶活性的观点出发，优选表达γ亚单位，在上述DNA中，编码γ亚单位的碱基序列，优选在编码α亚单位的碱基序列的上游区域含有。如果那样，可以认为，在产生α亚单位时，首先表达γ亚单位，作为蛋白质而存在，由此可以在微生物体内高效率地产生α亚单位。
作为上述γ亚单位来说，例如可以采用具有序列号2的氨基酸序列、或在序列号2的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一个或多个的氨基酸残基的氨基酸序列的γ亚单位。该γ亚单位由例如序列号1的碱序列之中由碱基序号258～761组成的碱基序列来编码。因此，作为本发明中所使用的DNA来说，优选使用具有上述碱基序列的DNA。
序列号1的碱基序列之中，碱基序号2386以后的碱基序列，推定为编码β亚单位，但碱基序号2386～2451的碱基序列，推定为编码β亚单位的信号肽。推定该信号肽的氨基酸序列是序列号4的氨基酸序号1～22的氨基酸序列。
由于信号肽是用核糖体合成的蛋白质通过内膜而在胞质空间分泌时是必要的肽，所以，如果信号肽存在，则在菌体胞质或培养上清液中含有的蛋白质量就增加。因此，作为上述DNA来说，优选使用含有编码上述β亚单位的信号肽的表达的碱基序列的DNA。
图1表示从转化体取得的可溶化部分的Q-Sepharose FF层析法的结果。
图2表示SDS-PAGE的结果。
具体实施例方式
以下，具体地说明本发明的葡萄糖脱氢酶的制造方法。
在本制造方法中，包括取得编码例如α亚单位及β亚单位的表达的DNA的第1工序；将含有该DNA的重组媒介物导入属于假单胞菌属的微生物中形成转化体的第2工序；在培养基上培养该转化体、产生含有β亚单位的葡萄糖脱氢酶(例如CyGDH)和不含β亚单位的葡萄糖脱氢酶(例如αGDH)的第3工序；和，从培养基或微生物中采取葡萄糖脱氢酶的第4工序。
<第1工序(DNA的取得)>
在取得DNA时，首先构筑重组媒介物。重组媒介物通过如下这样来构筑，即，从属于Burkhorderia属的微生物(例如Burkhorderia cepaciaKS1株)分离并精制染色体DNA后、切断该染色体DNA的染色体DNA断片或由PCR等放大的DNA断片与直链的表达媒介物进行结合闭链。
染色体DNA的分离和精制，基于将微生物溶菌而得到的溶菌物来进行。作为溶菌的方法来说，可以列举由例如溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶来处理，除了该处理之外，还可以根据需要现时使用蛋白水解酶、其它的酶和十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂。而且，还可以组合冻结熔解或法式细胞破碎仪(French press)处理等的物理破碎方法。另一方面，DNA从溶菌物中的分离和精制，可以通过适当组合例如苯酚处理或蛋白水解酶处理的除蛋白处理、核糖核酸酶处理、醇沉淀处理等的方法来进行。
染色体DNA的切断，按照通常方法、例如可以使用超声波处理或限制酶处理来进行。作为限制酶来说，可以使用例如在特定核苷酸序列作用的II型限制酶。
染色体DNA断片和表达媒介物的结合，使用例如DNA连接酶来进行。
作为表达媒介物来说，适合在宿主微生物内从能自律地增殖的噬菌体或质粒作为基因重组用而被构筑。作为噬菌体来说，例如在将后述的大肠杆菌作为宿主微生物时，例示Lambda gt10、Lambda gt11等。另一方面，作为质粒来说，例如在将大肠杆菌作为宿主微生物时，例不pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pTrc99A、pBluescript或作为粘粒的SuperCosI等。另外，使用假单胞菌时，例示革兰氏阴性菌用广宿主域媒介物的RSF1010、pBBR122、pCN51等。
接着，在重组媒介物上实施标记，将该重组媒介物移入宿主微生物中，形成转化体。从该转化体，以媒介物的标记和酶活性的表达为指标进行筛选，得到保持含有将GDH编码的基因的重组媒介物的基因给予微生物。
作为宿主微生物来说，只要重组媒介物是稳定的、且能自律地增殖、可以表达外来性基因，就没有特别的限制。一般地，可以使用大肠杆菌DH5α、XL-1Blue MR等。作为在宿主微生物中移入重组媒介物的方法，例如在宿主微生物是大肠杆菌时，可以使用由钙处理的感受态细胞法和电蚀孔法等。
培养基因给予微生物，再从该微生物分离和精制重组媒介物后，从重组媒介物中采集将GDH编码的基因(克隆化断片)。该克隆化断片的采集可以用与采集染色体DNA同样的方法进行。
该克隆化断片，具有编码含葡萄糖脱氢活性的α亚单位和作为电子传递蛋白质的β亚单位的碱基序列。在从Burkhorderia cepacia KS1株得到目标DNA时，克隆化断片，除了编码α亚单位和β亚单位(包括β亚单位的信号肽)的碱基序列以外，还得到作为含有编码γ亚单位的碱基序列的克隆化断片。另外，可以通过如下这样确认，克隆化断片编码α亚单位和β亚单位或者编码γ亚单位，可以用通常的方法解读该克隆化断片的碱基序列。
<第2工序(转化体的形成)>
含有作为目标的DNA的转化体，将在第1工序得到的克隆化断片组入媒介物中后，通过导入属于假单胞菌属的微生物就可以形成。作为属于假单胞菌属的微生物来说，优选使用例如恶臭假单胞菌。向宿主微生物中导入重组媒介物的导入方法，可以用与第1工序中筛选时形成转化体同样的方法进行。
<第3工序(转化体的培养和GDH的产生)>
在第2工序中得到的转化体，为了产生GDH而进行培养。从该转化体同时产生含有β亚单位的GDH和不含β亚单位的GDH。例如，从Burkhorderia cepacia KS1株得到作为目标的DNA时，同时产生具有α、β、γ亚单位的CyGDH和具有α、γ亚单位的αGDH。
转化体的培养形态，考虑宿主的营养生理性质、选择培养条件就可以，多数情况下进行液体培养。工业上进行通气搅拌培养是有利的。
作为培养基的营养源来说，在微生物培养中通常所使用的就可以广泛使用。作为碳源来说，如果是可供应的碳化合物就可以，例如使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。作为氮源来说，可供应的氮化合物就可以，例如使用胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆粕提取物等。其它，根据需要可使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。
培养温度，可以在转化体生长发育、转化体产生GDH的范围内适当变化，但优选是20～42℃左右。预计GDH达到最高产量时、在适当时间结束培养就可以，通常培养时间设为12～72小时。培养基的pH，可以在转化体生长发育、转化体产生GDH的范围内适当变化，但优选是pH为5.0～9.0左右的范围。
<第4工序(GDH的采集)>
GDH的采集，一般按照通常方法，从培养液或转化体中分离含有GDH的溶液后，精制该含有GDH的溶液。
含有GDH的溶液，在GDH存在于菌体内时，通过过滤或离心分离等手段从培养液中采集菌体之后，以机械方法或溶菌酶等酶方法破坏该菌体，根据需要添加EDTA等螯合剂和表面活性剂，使GDH成为可溶化，从而可以得到。另一方面，GDH存在于菌体外(培养液中)时，可以由过滤或离心分离等手段分离培养液和菌体而得到。
含有GDH的溶液的精制，可以从该溶液直接进行，但也可以浓缩该溶液中的GDH之后进行。就浓缩来说，可以由例如减压浓缩、膜浓缩、盐析处理或由亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮)进行分别沉淀来进行。在GDH的浓缩中，加热处理或等电点处理也是有效的精制手段。浓缩液的精制，可以通过适当组合例如过滤、吸附层析法、离子交换层析法、亲和层析法来进行。由此，可以分别地得到含有β亚单位的GDH和不含β亚单位的GDH。
这样得到的精制酶，可以由例如冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥而粉末化，在市场上流通。
实施例以下，对上述制造方法的具体例子进行说明，同时，由该例实际证明可以得到2种GDH。
<源自Burkhorderia cepacia KS1株的染色体DNA的调制>
源自Burkhorderia cepacia KS1株的染色体DNA，根据通常的方法来调制。即，首先，使用TL液体培养液(聚蛋白胨＝10g、酵母提取液＝1g、NaCl＝5g、KH2PO4＝2g、葡萄糖＝5g、总量为1L、pH7.2)，在34℃温度下，振荡KS1株一个晚上。用离心分离机回收增殖的菌体。在含有10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5％SDS、100μg/mL的蛋白酶K的溶液中悬浊该菌体，在50℃处理6小时。在该悬浊液中加入等量的苯酚-氯仿，在室温下搅拌10分钟后，用离心分离机回收上清液。在其中加入醋酸钠，使最终浓度为0.3M，将2倍量的乙醇成为双层，使染色体DNA在中间层析出。用玻璃棒捞出析出物，用70％乙醇洗净后，使之溶解在适当量的TE缓冲液中，成为染色体DNA溶液。
<转化体的形成>
以先前得到的染色体DNA为模型，用PCR法放大编码GDH的基因全长。就引物来说，使用了GDH的γ亚单位的N末端部分的序列和GDH的β亚单位的C末端部分的序列。调整在位于各引物的端部的限制酶识别部位切断该DNA断片而得到的断片以及含有trc启动子的DNA断片，与广宿主域媒介物RSF1010结合后，导入大肠杆菌JM109中，用含有50μg/ml链霉素的LB琼脂培养基形成菌落。由所产生的菌落调整质粒，以此为模型，通过使用上述PCR引物的PCR，选择约3.4kb的断片被放大的克隆，通过将其导入恶臭假单胞菌ATCC47054株中，得到作为目标的转化体(GDH表达菌株)。
<转化体的培养和GDH的产生>
转化体的培养，在有氧的培养条件下进行。更具体地说，转化体的培养，使用每1升培养液的组成如表1所示那样调整的7L培养基、在34℃下进行8小时。以9000×g(4℃、10分钟)离心分离该培养液7L而得到了菌体。
表1培养基组成
<GDH的精制>
在10mM的磷酸钾缓冲液(pH6.0)使所得到的菌体分散的状态下，用法式细胞破碎仪(大竹制作所 东京 日本)施加1,500Kg/cm2的压力差进行破坏。以8000×g、10分钟离心分离此时所得到的细胞提取液，除去细胞固形物，得到了粗酶溶液。
粗酶溶液，添加Triton-X100，使最终浓度成为1％。然后，在4℃下缓慢搅拌一个晚上。接着，在超离心(4℃、69800×g、90分钟)后，再离心(4℃、15000×g、15分钟)，作为上清液，得到了可溶化部分。
用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)透析该可溶化部分后，将此溶液供给至用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)等量化过的Q-Sepharose FF柱(22mmID×20cmAmershambiosciences)。使蛋白质以直线性梯度来洗脱，使得10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的NaCl的浓度成为0～500mM。其流速为5mL/min。
对于洗脱液，测定每部分GDH活性。图1示意性地表示了该结果。如图1所示的那样，在梯度范围内确认了2个大峰。
GDH的活性测定，基于葡萄糖的脱氢化，通过追踪电子接收体的还原反应来进行。作为电子接收体，使用了2，6-二氯靛酚(DCIP)和菲双甲氧硫酸盐(PMS)。反应在聚乙烯管内以规定的温度来实施。
首先，在20μL的含有0.75mM PMS和0.75mM DCIP的25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.0)中添加5μL酶溶液，准备混合液。该混合液在事前定温放置1分钟。在混合液中加入1μL的2M葡萄糖(最终浓度77mM)，使反应开始，定温放置2分钟。接着，加入100μL的冰冷蒸馏水或120μL的7.5M尿素，将试样冷却。对于该试样，使用超微量测量用比色皿(100μL)和可以用其测量的分光光度计(UV160岛津制作所 京都 日本)，随着时间推移地测量基于DCIP还原的退色。测定波长设定为DCIP吸收波长600nm。DCIP的摩尔吸收系数为22.23mM×cm-1。1单位酶(U)定义为，在标准检测条件下，每1分钟氧化1μM葡萄糖的量。蛋白浓度以半限注法测定。
其次，对于2个GDH活性的峰，分别收集部分(fraction)，用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0、4℃)透析一夜，调整了2种GDH溶液。
对于各自的GDH调整溶液，使用DEAE-5PW柱(8.0mmID×7.5cm东ソ一、东京)，进行个别的精制。柱预先用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)平衡化。蛋白质用直线性梯度、流速为1mL/min来洗脱，使得10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的NaCl浓度为0-400mM。收集各个层析法中的GDH活性最高的部分，用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)脱盐一夜，得到了2种精制酶(以下，为了方便，称为“第1精制酶”和“第2精制酶”)。
<精制酶的亚单位的特定>
用SDS-PAGE对各精制酶液进行电泳，特定亚单位的分子量。就SDS-PAGE来说，使用Tris-Tricline缓冲液，在8～25％聚丙烯酰胺的梯度凝胶中实施。该凝胶的蛋白质进行科麦西染料染色。通过PhastSystem(Pharmacia)，自动地进行分离和展开。由标准蛋白的相对移动度测定了分子质量。
图2表示SDS-PAGE电泳的结果。在图2中，路线1表示分子量标准标记蛋白质的科麦西染料染色，路线2表示第1精制酶的科麦西染料染色，路线3表示第2精制酶的科麦西染料染色。由该图中可以看出，第1精制酶分离为分子量约60kDa、约43kDa和约14kDa的蛋白质。因此，显示出第1精制酶是分子量约60kDa的α亚单位、分子量约43kDa的β亚单位和分子量约14kDa的γ亚单位结合在一起。第2精制酶分离为分子量约60kDa和约14kDa的蛋白质。因此，显示出第2精制酶是分子量约60kDa的α亚单位和分子量约14kDa的γ亚单位结合在一起。SDS-PAGE电泳的结果显示出，第1精制酶和第2精制酶是不同的GDH，同时生成2种GDH。
分别切取由电泳得到的含有α亚单位、β亚单位的带，复制到聚偏氟乙烯膜之后，由氨基酸定序器(岛津制作所、PPSQ-10)解读氨基酸序列。
对于α亚单位来说，确认了在序列号3的氨基酸序列中含有由氨基酸序号2～12组成的11残基构成的肽序列。另一方面，对于β亚单位来说，可以确认序列号5所示的N末端的16残基的氨基酸序列。
<重组媒介物的分析>
从具有GDH活性的恶臭假单胞菌的转化体中提取目标重组媒介物。对于该重组媒介物的插入DNA断片，由通常方法决定碱基序列。其结果是，含有序列号258～3660的碱基序列。
如国际公开WO02/36779号公报等公开的那样，编码α亚单位的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号764～2380的碱基序列，编码β亚单位的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号2386～3660的碱基序列，编码γ亚单位的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号258～761的碱基序列，编码β亚单位的信号肽的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号2386～2451的碱基序列。
因此，确认了目标重组媒介物含有编码α亚单位、β亚单位(包含β亚单位的信号肽)、γ亚单位的碱基序列。另外，对应于各碱基序列的氨基酸序列，对于α亚单位来说，示于序列号3，对于β亚单位来说，示于序列号5，对于γ亚单位来说，示于序列号2，对于β亚单位的信号肽来说，示于序列号4的氨基酸序列中的氨基酸序号1～22。
由以上可以清楚，在本发明中，例如αGDH和CyGDH那样，可以同时而且高效率地制造2种GDH。
序列表<110>早出广司；爱科来株式会社<120>葡萄糖脱氢酶的制造方法<130>WO-AR2003-7<150>JP 2002/253752<151>2002-8-30<160>5<210>1<211>3706<212>DNA<213>Burkhorderia cepacia<220>
<221>CDS<222>(258)..(761)<220>
<221>CDS<222>(764)..(2380)<220>
<221>CDS
<222>(2386)..(3660)<400>1aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc290Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg1 5 10cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln15 20 25ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu30 35 40cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg 434Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met45 50 55acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile60 65 70 75ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala80 85 90gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg 578Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr95 100 105cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626
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1.一种葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于将含有编码在序列号1记载的具有葡萄糖脱氢活性的α亚单位及作为电子传递蛋白质的β亚单位的序列的DNA导入属于假单胞菌属的微生物中，形成转化体，培养该转化体，产生含有所述β亚单位的第1葡萄糖脱氢酶和不含所述β亚单位的第2葡萄糖脱氢酶。
2.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述α亚单位在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为60kDa，所述β亚单位在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为43kDa。
3.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有编码在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为14kDa的γ亚单位的碱基序列，所述第1及第2葡萄糖脱氢酶，作为含有所述γ亚单位的酶来产生。
4.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述属于假单胞菌属的微生物是恶臭假单胞菌。
5.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述DNA是属于Burkhorderia属的微生物，从具有产生葡萄糖脱氢酶能力的微生物取得。
6.如权利要求5所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于属于所述Burkhorderia属的微生物是Burkhorderia cepacia KS1株(FERMBP-7306)。
7.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述α亚单位具有序列号3的氨基酸序列或在序列号3的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有在序列号1的碱基序列之中、编码由碱基序号764～2380组成的α亚单位的碱基序列。
9.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述β亚单位具有序列号5的氨基酸序列或在序列号5的氨基酸序列之中取代、空缺、插入或加成一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有在序列号1的碱基序列之中、编码由碱基序号2386～3660组成的β亚单位的碱基序列。
11.如权利要求3所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述γ亚单位具有序列号2的氨基酸序列或在序列号2的氨基酸序列之中取代、空缺、插入或加成一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有在序列号1的碱基序列之中、编码由碱基序号258～761组成的γ亚单位的碱基序列。
13.如权利要求12所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述DNA，在编码α亚单位的碱基序列的上游区域含有编码γ亚单位的碱基序列。
14.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有编码所述β亚单位的信号肽的碱基序列。
15.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述信号肽具有序列号4的氨基酸序列之中的氨基酸序号1～22的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于所述信号肽由序列号1的碱基序列之中的碱基序号2386～2451的碱基序列来编码。
全文摘要
本发明涉及葡萄糖脱氢酶的制造方法。该制造方法是，将含有编码在序列号1记载的具有葡萄糖脱氢活性的α亚单位及作为电子传递蛋白质的β亚单位的序列的DNA导入属于假单胞菌属的微生物中，形成转化体，培养该转化体，产生含有上述β亚单位的第1葡萄糖脱氢酶和不含上述β亚单位的第2葡萄糖脱氢酶。所述α亚单位在例如还原条件下的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为60kDa，所述β亚单位在例如还原条件下的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为43kDa。
文档编号C12N9/04GK1753997SQ03824735
公开日2006年3月29日 申请日期2003年8月20日 优先权日2002年8月30日
发明者早出广司, 山冈秀亮, 星岛光博, 黑坂啓介, 川瀬至道 申请人:早出广司, 爱科来株式会社