专利名称：染色体异常质控细胞的制备及质控方法
技术领域：
本发明涉及染色体异常质控细胞的制备及质控方法，主要用于各医疗单位细胞遗传实验室或产前诊断实验室作染色体鉴定时的质量控制或作相关实验之用。
染色体鉴定就是对染色体的结构和数目有否异常进行分析。染色体由DNA、组蛋白和RNA组成，而DNA由带有遗传信息的基因组成。人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定男女性别的性染色体，任何人体如果染色体数目增多或减少，或某染色体有缺失或结构改变，均会发生相应的染色体病，临床表现为智力低下、发育障碍、性异常、死胎流产等异常妊娠、不育不孕、原发或继发闭经等染色体病特征。染色体常位于细胞核内，经细胞培养、制片、染色后，可在显微镜下分析染色体有无数目和结构异常，作为胎儿产前染色体病的诊断指标，或出生后染色体病的诊断指标。某些实验项目的质量控制就是由各医疗或科研机构的主管部门将已知某种物质(含量)的质控品定期分发给受控实验室检测，根据受控实验室对质控品的测定值，通过与质控品实际值的比较处理，可知实验测定值与质控品实际值的差距，从而全面系统地考核受控实验室的仪器、器材、试剂等实验条件及实验人员的技术水平，对质控试验不合格的实验室，要求其作出整改措施，这就是实验项目的质量控制。但目前尚未见国内外文献报道以及有相关实验室用染色体异常质控细胞对染色体鉴定作系统的质量控制。
本发明的目的是要提供染色体异常质控细胞的制备方法并建立保存各类染色体异常细胞系或细胞株的细胞库以及如何用这些细胞系(株)来控制相关染色体鉴定的质量或作相关实验之用。
本发明的目的是这样实现的取已确诊的各类染色体病患者的外周血淋巴细胞、骨髓细胞或羊水胎儿脱落细胞，按常规细胞培养方法接种于含培养液的细胞培养瓶内，待细胞生长到对数期时，用新鲜培养液清洗并用胰酶消化收获活细胞，用细胞培养液配制成约105/ml的细胞悬液，以1ml接种于4ml细胞培养夜的比例，重复细胞传代培养至所需细胞数量和质量的细胞系，收获细胞配成105/ml细胞悬液分装后冻存在-196℃液氮中作为备用的染色体异常质控细胞，用时复苏该质控细胞，分发给受控实验室，作细胞培养及染色体制片核型分析，受控实验室将实验结果反馈给质控管理机构评价，以判断受控实验室是否准确地鉴定出质控细胞的异常染色体。
本发明由已确诊的染色体结构或数目异常的临床病例包括21三体型、18三体型、13三体型、5P部分单体、45XO、X三体综合症、47XXY、47XYY、各类嵌合体、染色体易位、缺失、倒位、环状以及等臂染色体等染色体病患者外周血淋巴细胞、骨髓细胞或羊水胎儿细胞作为原代细胞，套用常规细胞培养基及改良的其他细胞的细胞培养、传代(增多细胞数)、冻存和复苏方法，来制备染色体鉴定专用的质控细胞系(株)，冻存备用，经实验证实，细胞在传代培养中(一般在10代以内)染色体数目与结构不会发生改变。即使有所改变，也刚好用来考核受控实验室鉴别核型改变染色体的水平(参考实验室与受控实验室同时做)。且可建立核型异常染色体细胞库，为其他相关科研提供异常染色体的细胞系(株)。该方法可行且有重要意义。
本发明的细胞培养液(基)选用RPMI1640培养基，其配方是称取市售RPMI1640培养基粉末10.4g，溶于1000ml的双蒸水中，40℃保存，有效期为1至2个月，存放-20℃可较长期保存，也可选用市售的TC199、Eagle、Ham’s F10、F12、MEM等培养基。
本发明按以下具体方法制备染色体异常质控细胞并进行质量控制。
外周血淋巴细胞染色体异常质控细胞的制备方法取已确诊为相关染色体病患者的静脉血5-10ml，肝素抗凝，放无菌试管中静置1～2h，或400～500r/min离心数分钟，取血浆及其与红细胞层之间的白细胞层，混匀，以每0.5ml接种于4ml培养基中，37℃72h，培养液倒入无菌离心管中，1000r/min 10min，弃上清液，沉淀细胞加培养液约5ml混匀，重复上述步骤离心沉淀，弃上清液，沉淀细胞加培养液，配成105/ml，每瓶(4ml)培养基中加上述105/ml细胞悬液1ml置37℃72h，传代培养，重复上述步骤，进行连续传代培养，每一代均取一份培养物做染色体核型分析，观察有无染色体核型变化，根据所需要的质控细胞的数量与质量进行传代，一般10代以内即可达到所需的质控细胞的量，然后配成105/ml细胞悬液，加10％DMSO后，以每安瓶1ml分装于冻存管中，将盖拧紧，标明质控细胞名称、代数、冻存日期、操作人等。外包棉花，入70℃冰箱过夜后，直接入-196℃液氮罐中保存。此即为染色体异常质控细胞，实质上属于染色体异常细胞系，如果通过选择法，从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志的培养物即为细胞株。需用本质控细胞来做质控时，将质控细胞复苏，方法是取出冻存管，迅速入37℃水浴，不断震摇，尽快融化，然后离心去上清液，用新鲜培养液清洗细胞悬液一次，用培养液适当释放后装入培养瓶，37℃培养，次日更换培养液，以后按常规培养、制片、染色、作染色体核型鉴定。如果要将质控细胞系运送到较远的实验室，可用液氮或干冰保存运送法作短期运输效果较好，或选生长状态较好的细胞，待细胞生长达80％-90％汇合时，去掉旧培养液换入新培养液达到瓶的颈部，保留小许空间运输，到达后倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代培养，制片、染色、作染色体鉴定。骨髓染色体异常质控细胞的制备方法同外周血淋巴细胞染色体异常质控细胞的制备方法。
羊水胎儿脱落细胞染色体异常质控细胞的制备方法取已确诊的染色体病患儿羊水以无菌操作分装入若干个试管内，每管10-15ml，1000r/min离心10min，去上清液，留约1.5ml，轻轻混匀后，将细胞悬液均匀铺在培养瓶内，加入4ml培养液，放置在5％CO2、37℃培养箱内培养6天，镜下观察细胞生长情况，细胞贴壁生长汇合率达80-95％(对数生长期)时，吸去培养瓶内陈旧液体，用新鲜培养液洗1～2次，加入1ml胰酶和EDTA混合液，盖好盖，置37℃温育2～4min，轻轻吸去消化液，用培养基小心清洗1次后，加入培养液1～2ml，用吸管反复轻轻吹打贴壁细胞，使其形成细胞悬液，配成105/ml细胞悬液，接种于培养瓶中，重复上述步骤进行传代培养到所需细胞质与量后，按外周血淋巴细胞染色体异常质控细胞的制备方法进行分装、冻存、复苏、运输，按需分发给受控实验室作细胞培养、制片及染色体鉴定。
染色体鉴定质控方法由质控主管机构、学术机构、参考(标准)实验室及各受控实验室组成质控网络，由参考实验室定期选择数种染色体结构或数目异常的质控细胞发放给各受控实验室，由受控实验室将质控细胞与被检细胞在同等条件下作细胞培养、制片、分带及染色体鉴定，结果通过计算机网络等方式反馈给参考实验室；由参考实验室核对其结果是否准确。
染色体鉴定质控结果评价方法可根据实际情况评分，如细胞培养质量指标包括培养后细胞总数、推成规定数量的细胞玻片后平均每高倍视野细胞数，染色体分裂像质量指标包括染色体分裂像分散度质量指标如计数100个分裂像以观察46条染色体分布在油镜视野的个数、染色体相交、相接的数量及染色体分裂像总数指标包括全部细胞片子可计算、可分析分裂像数目，染色体带纹是否清晰显示，特别是质控细胞系中的异常染色体是否都被正确地鉴定出来等。
权利要求
1.一种用于医疗领域的染色体异常质控细胞的制备及质控方法，其主要特征是采集已由临床确诊的各类染色体病患者的外周血淋巴细胞、骨髓细胞或羊水胎儿脱落细胞作为原代细胞，接种于专用细胞培养基中，在37℃5％CO2条件下，经体外细胞传代培养到细胞对数生长期时消化收集活细胞，用培养液配成105/ml细胞悬液后以1ml接种于4ml新鲜培养基的比例继续传代培养，重复传代培养数代至数十代，达到所需细胞数量和质量的细胞系后，再用培养液配成105/ml的细胞悬液，分装后冻存于-196℃液氮中作为备用的染色体异常质控细胞，如由单一细胞培养获得并有特定的生物学标志即为细胞株，用时复苏质控细胞作实验之用或分发给各受控实验室作细胞培养及染色体鉴定，各受控实验室将染色体鉴定结果反馈给质控主管者评价，从而可判断各受控实验室是否准确地鉴定出质控细胞中的各类异常染色体，达到考核各受控实验室质量的目的。
2.根据权利要求1所述的染色体异常质控细胞的制备及质控方法，其特征是染色体病包含了所有染色体结构和数目异常的疾病。
3.根据权利要求1所述的染色体异常质控细胞的制备及质控方法，其特征是质控细胞是由各种染色体核型异常的细胞制成的细胞系或细胞株。
4.根据权利要求1所述的染色体异常质控细胞的制备及质控方法，其特征是专用细胞培养基包含了RPMI1640、TC199、Eagle、Ham’sF10、F12、MEM培养基。
5.根据权利要求1、3所述的染色体异常质控细胞的制备及质控方法，其特征是质控细胞冻存于液氮中其实质就是建立一种以细胞系或细胞株形式保存各类异常染色体核型细胞的细胞库。
6.根据权利要求1所述的染色体异常质控细胞的制备及质控方法，其特征是质控方法包含了由质控主管者、参考实验室及受控实验室组成并由计算机进行网上会诊的染色体鉴定质控网络。
全文摘要
本发明提供了一种用于医疗领域的染色体异常质控细胞的制备及质控方法，其主要特征是采集已由临床确诊的各类染色体病患者的外周血淋巴细胞、骨髓细胞或羊水胎儿脱落细胞作为原代细胞，接种于RPMI1640专用细胞培养基中，在37℃、5％CO
文档编号C12N5/071GK1609194SQ20031010372
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月25日 优先权日2003年10月25日
发明者翁炳焕 申请人:翁炳焕