专利名称：猪α－干扰素的基因合成、表达载体构建及产物的制法的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药中的基因工程生产多肽药物技术领域，特别涉及一种猪α-干扰素的生产方法。
背景技术：
干扰素(Interferor，IFN)是动物机体产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子。根据来源细胞和自身理化性质的不同，主要分为α、β和γ-干扰素。α-干扰素因具有显著的抗病毒功能而被广泛应用于人类病毒性疾病的预防和治疗。随着动物保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种动物用α-干扰素的生产方法成为近年来的研究热点。
猪α-干扰素(porcine interferon alpha，PoIFNα)可分为2个亚型，至少有17个基因拷贝，分布于猪1号染色体，目前只有部分被测序和表达。Lefevre等首先克隆了PoIFN-α1基因并将PoIFN-α1成熟蛋白基因在大肠杆菌中进行了表达，具有较高抗病毒活性。但国内未见有PoIFN-α单纯表达及重组猪α-干扰素在猪病防治中应用的公开报道。
猪α-干扰素具有高效抗病毒和免疫调节功能，可用于猪传染病的预防和治疗。目前国内利用猪血白细胞诱导生产的白细胞干扰素，其中的猪α干扰素含量很低。同时还存在单位体积活性效价低和存在猪血潜在病毒污染的问题。而基因工程猪α-干扰素当前存在生产成本高的问题，其主要原因是表达水平偏低，干扰素蛋白表达的只占菌体蛋白的4-7％；干扰素成品的获得需经历多重复杂的工艺流程，回收率只有10％～20％。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪α-干扰素的基因合成、表达载体构建及产物的制法，以求在大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的优良产品。
鉴于密码子的兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的喜好不同，本发明设计合成了含大肠杆菌喜好密码子的能生产猪α-干扰素的基因，但不改变产物的氨基酸组成和排列顺序，从而提高基因的表达水平。这种人工合成的编码猪α-干扰素的基因，含有如下核苷酸序列ATG TGT GAC CTG CCG CAG ACC CAC AGC CTG GCT CAC ACCCGT GCT CTG CGT CTG CTG GCA CAG ATG CGC CGT ATC TCT CCGTTC TCC TGC CTG GAC CAC CGC CGT GAC TTC GGT TCC CCGCAC GAA GCT TTC GGT GGC AAC CAG GTT CAG AAA GCT CAGGCT ATG GCT CTG GTT CAT GAA ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAGCTG TTC AGC ACC GAA GGC TCT GCT GCT GCT TGG AAC GAAAGC CTG CTG CAC CAG TTC TAC ACT GGT CTG GAT CAG CAGCTG CGT GAC CTG GAA GCA TGT GTT ATG CAG GAA GCG GGTCTG GAA GGT ACC CCG CTG CTG GAA GAG GAC TCC ATC CGTGCT GTT CGC AAA TAC TTC CAC CGT CTG ACC CTG TAC CTG CAAGAG AAG AGC TAC AGC CCG TGT GCT TGG GAG ATC GTA CGTGCA GAA GTA ATG CGT TCC TTC TCT TCC TCC CGC AAC CTG CAGGAC CGT CTG CGTAAG AAA GAG TAA将含有如上所述核苷酸序列的基因猪α-干扰素基因克隆入大肠杆菌构建猪α-干扰素基因的表达载体，转化大肠杆菌，获得可表达猪α-干扰素的基因工程大肠杆菌。
可将上述猪α-干扰素基因克隆入带有pL、pR启动子、Cits温控阻抑蛋白的基因和两个人工设计核糖体结合位点序列的双顺反子表达载体pRLC中，构建成猪α-干扰素表达质粒pRLC-poIFN-α，转化大肠杆菌后，猪α-干扰素获得高效表达。
生产重组猪α-干扰素的方法包括用大肠杆菌偏嗜密码子合成的猪α-干扰素基因、构建高效表达载体并获得高效表达菌株，工程菌发酵、包涵体的分离纯化与裂解、蛋白质的复性与纯化工艺及表达产物的生物活性测定方法。所构建的工程菌在30℃进行基础培养，其最佳诱导表达时间为细菌密度OD600＝0.4～0.6时，42℃诱导发酵3～5小时。包涵体洗涤液为1％TritonX-100、50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、0.15MNaCl；包涵体裂解液为6mol/L GmdCl、30mmol/L DTT、100mmol/LTris-HCl(pH8.5)、2mmol/L EDTA；复性液为3mmol/L GSSH、1mmol/LGSSG、50mmol/L Tris-HCl(pH8.5)、0.2mmol/L EDTA、0.15mol/L NaCl)；采用SephacrylS-200层析柱分离纯化。
所生产的重组猪α-干扰素，其分子量为18kD，且在体外能有效保护PK-15细胞和MDBK细胞免遭水泡性口炎病毒的攻击。
本发明通过计算机软件分析并人工设计合成了大肠杆菌偏嗜密码子组成的猪α-干扰素基因，构建了带有该基因的高效表达载体，实现了猪α-干扰素在大肠杆菌中的高效表达，表达量占菌体总蛋白的26％。同时本发明也提供了一整套工程菌诱导表达、包涵体分离和裂解、蛋白纯化和复性工艺。这为大规模工业化生产重组猪α-干扰素应用于养猪业奠定了坚实的基础。
图1是本发明实施例猪α-干扰素cDNA序列中与天然猪α-干扰素中核苷酸序列对照2是本发明实施例猪α-干扰素基因的序列测定3是本发明实施例猪α-干扰素表达质粒的构建示意4是本发明实施例猪α-干扰素的酶切鉴定及PCR的扩增和鉴定5是本发明实施例工程菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定6是本发明实施例重组猪α-干扰素在大肠杆菌中存在形式的鉴定7是本发明实施例分离纯化的重组猪α-干扰素SDS-PAG电泳检定图具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明本发明实施例选用了大肠杆菌偏爱的密码子，并用计算机软件模拟计算了翻译起始区和猪α-干扰素基因5′端二级结构最小生成自由能，综合考虑上述两个因素设计了全合成猪α-干扰素基因，5`和3`分别加上EcoRI和SalI酶切位点，克隆入pGEM-T质粒，构建pGEM-T-poIFN-α。设计合成的猪α-干扰素基因序列、其与天然猪α-干扰素的比较及测序结果分别如下表及图1、图2所示。
参考附图4，本发明实施例用EcoRI和SalI从pGEM-T-poIFN-α中切出poIFN-α基因克隆到pRLC中得到表达质粒pRLC-poIFN-α。
参考附图5，本发明实施例将pRLC-poIFN-α表达质粒转化大肠杆菌，宿主菌为大肠杆菌DH5α，质粒pRLC-poIFN-α，转化采用氯化钙转化法。转化菌的筛选从新鲜转化平板上挑取转化菌落，分别接种于含有氨苄青霉素的选择培养基，37℃振荡培养过夜，收集菌体，提取质粒酶切鉴定与pRLC-poIFN-α表达质粒的情况一致。图5中1poIFN-α基因，2pRLC-poIFN-α EcoRI PstI酶切产物，M标准分子量对照。经过筛选得到高效表达菌株，表达水平可达菌体总蛋白的26％。
参考附图6，本发明实施例将猪α-干扰素工程菌接种于含氨苄青霉素浓度为50ug/mL的LB培养液，30℃培养过夜。次日将2％的菌液接种于2×YT培养液，30℃培养至OD600约为0.5，迅速升温到42℃，继续诱导培养4h。分别取开始诱导前以及诱导1～4h的菌体作SDS-PAGE电泳鉴定。，在电泳图谱上出现一条约18kD的新带。光密度扫描结果显示诱导表达4小时的工程菌18kD的条带占细菌总蛋白的26％。图6中，1～4分别为诱导表达1～4小时的工程菌，M标准分子量对照。
参考附图7，本发明实施例用离心法收集发酵的菌体，经生理盐水洗涤后超声波裂解，离心后上清和沉定作SDS-PAGE电泳鉴定，结果表明表达的猪α-干扰素以包涵体的形式存在。图7中1超声破碎上清，2，3包涵体洗涤上清，4初制猪干扰素-α包涵体，5标准分子量对照。
本发明实施例重组猪α-干扰素的提取和变性离心收集发酵的菌体，用生理盐水洗涤后超声波裂解，取上清液离心收集沉淀即初制干扰素包涵体。将初制包涵体用洗涤液(0.5％Triton X-100、50mmol/L Tris-HCl(pH8.5)、10mmol/L EDTA、0.15mol/L NaCl)搅拌洗涤两次，每次1h，得到初步纯化的包涵体，加入变性液(6mol/L GmdCl、30mmol/L DTT、100mmol/L Tris-HCl(pH8.5)、2mmol/L EDTA)包涵体，置摇床中30℃、120转/min反应2h，离心取上清液。
本发明实施例重组猪α-干扰素的复性在冰浴条件下，将包含体裂解液分三次间隔1h注入搅动的含适量盐酸胍的复性液(3mmol/L GSSH、1mmol/L GSSG、50mmol/L Tris-HCl(pH8.5)、0.2mmol/L EDTA、0.15mol/LNaCl)至蛋白质终浓度约为0.2mg/mL，4℃静置过夜。
本发明实施例重组猪α-干扰素的纯化将复性产物过Hiprep 26/10Desalting柱脱盐，洗脱液为20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.2mmol/LEDTA，冷冻浓缩后用SephacrylS-200层析柱分离纯化干扰素，洗脱液为PBS(PH7.4)，收集主峰。SDS-PAGE电泳鉴定鉴定纯化的重组猪α-干扰素(参考附图8)，其纯度大于95％。图8中，1纯化的重组猪干扰素-α，M标准分子量对照。
本发明实施例重组猪α-干扰素的活性测定微量细胞病变抑制法测定干扰素抗病毒活性，采用牛肾细胞MDBK/VSV系统测定。将抑制50％细胞病变(CPE)的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位(U)。多次活性检测结果表明，复性后的重组蛋白在MDBK细胞上表现出较高的抗病毒活性，能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用。复性后重组猪α-干扰素的生物学活性为7.35×105U/mg。凝胶层析纯化后的重组猪α-干扰素的的生物学活性为6.4×106U/mg。
猪α-干扰素基因及相应的氨基酸序列表ATG TGT GAC CTG CCG CAG ACC CAC AGC CTG GCT CAC ACC CGT GCT CTG CGTM C D L P QT H S L A H TR A L RCTG CTG GCA CAG ATG CGC CGT ATC TCT CCG TTC TCC TGC CTG GAC CAC CGCL L A Q M RR I S P F S CL D H RCGT GAC TTC GGT TCC CCG CAC GAA GCT TTC GGT GGC AAC CAG GTT CAG AAAR D F G S PH E A F G G NQ V Q KGCT CAG GCT ATG GCT CTG GTT CAT GAA ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTGA Q A M A LV H E M L Q QT F Q LTTC AGC ACC GAA GGC TCT GCT GCT GCT TGG AAC GAA AGC CTG CTG CAC CAGF S T E G SA A A W N E SL L H QTTC TAC ACT GGT CTG GAT CAG CAG CTG CGT GAC CTG GAA GCA TGT GTT ATGF Y T G L DQ Q L R D L EA C V MCAG GAA GCG GGT CTG GAA GGT ACC CCG CTG CTG GAA GAG GAC TCC ATC CGTQ E A G L EG T P L L E ED S I RGCT GTT CGC AAA TAC TTC CAC CGT CTG ACC CTG TAC CTG CAA GAG AAG AGCA V R K Y FH R L T L Y LQ E K STAC AGC CCG TGT GCT TGG GAG ATC GTA CGT GCA GAA GTA ATG CGT TCC TTCY S P C A WE I V R A E VM R S FTCT TCC TCC CGC AAC CTG CAG GAC CGT CTG CGT AAG AAA GAG TAAS SS RN LQ DR L RK KE
权利要求
1.一种人工合成的编码猪α-干扰素的基因，其特征为它含有如下核苷酸序列ATG TGT GAC CTG CCG CAG ACC CAC AGC CTG GCT CAC ACCCGT GCT CTG CGT CTG CTG GCA CAG ATG CGC CGT ATC TCT CCGTTC TCC TGC CTG GAC CAC CGC CGT GAC TTC GGT TCC CCGCAC GAA GCT TTC GGT GGC AAC CAG GTT CAG AAA GCT CAGGCT ATG GCT CTG GTT CAT GAA ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAGCTG TTC AGC ACC GAA GGC TCT GCT GCT GCT TGG AAC GAAAGC CTG CTG CAC CAG TTC TAC ACT GGT CTG GAT CAG CAGCTG CGT GAC CTG GAA GCA TGT GTT ATG CAG GAA GCG GGTCTG GAA GGT ACC CCG CTG CTG GAA GAG GAC TCC ATC CGTGCT GTT CGC AAA TAC TTC CAC CGT CTG ACC CTG TAC CTG CAAGAG AAG AGC TAC AGC CCG TGT GCT TGG GAG ATC GTA CGTGCA GAA GTA ATG CGT TCC TTC TCT TCC TCC CGC AAC CTG CAGGAC CGT CTG CGT AAG AAA GAG TAA
2.一种猪α-干扰素基因的表达载体，其特征为含有如权利要求1所述的核苷酸序列。
3.含权利要求1中猪α-干扰素基因的表达载体，其特征为使用了质粒载体pRLC，它含有pL、pR启动子、Cits温控阻抑蛋白的基因和两个人工设计核糖体结合位点序列的双顺反子以及猪α-干扰素基因，所构建的载体成为高效表达载体。
4.一种大肠杆菌，其特征为由权利要求2所述的基因表达载体转化而来。
5.一种生产重组猪α-干扰素的方法，它包括用大肠杆菌偏嗜密码子合成的猪α-干扰素基因、构建高效表达载体并获得高效表达菌株，工程菌发酵、包涵体的分离纯化与裂解、蛋白质的复性与纯化工艺及表达产物的生物活性测定方法，其特征为对工程菌进行30℃基础培养，其最佳诱导表达时间为细菌密度OD600＝0.4～0.6时，42℃诱导发酵3～5小时；包涵体洗涤液为1％TritonX-100、50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、0.15M NaCl；包涵体裂解液为6mol/L GmdCl、30mmol/L DTT、100mmol/L Tris-HCl(pH8.5)、2mmol/L EDTA；复性液为3mmol/L GSSH、1mmol/L GSSG、50mmol/L Tris-HCl(pH8.5)、0.2mmol/L EDTA、0.15mol/L NaCl)；采用SephacrylS-200层析柱分离纯化。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征为所生产的重组猪α-干扰素，其分子量为18kD，且在体外能有效保护PK-15细胞和MDBK细胞免遭水泡性口炎病毒的攻击。
全文摘要
一种猪α－干扰素的基因合成、表达载体构建及产物的制法，主要包括设计合成了大肠杆菌偏嗜密码子组成的猪α－干扰素基因，并构建了带有该基因的高效表达载体，实现了猪α－干扰素在大肠杆菌中的高效表达，表达量占菌体总蛋白的26％。同时也提供了一整套工程菌诱导表达、包涵体分离和裂解、蛋白复性和纯化工艺。猪α－干扰素具有高效抗病毒和免疫调节功能，可用于猪传染病的预防和治疗。本发明能够生产高效、安全、价廉的猪α－干扰素，所生产的猪α－干扰素单位体积活性效价高，无潜在病毒污染。这为工业化大量生产重组猪α－干扰素应用于我国养猪业奠定了坚实的基础。
文档编号C12N15/63GK1611604SQ200310109820
公开日2005年5月4日 申请日期2003年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者陈溥言, 曹瑞兵, 蒋贻海, 张存 申请人:青岛宝依特生物技术研究所