专利名称：一株新型杀蝗真菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新型杀蝗真菌菌株，属生物农药领域。用自然筛选方法育出仅对蝗虫类害虫表现高毒力、耐高温、抗污染力强、不影响环境生物、产孢率高的杀蝗新菌株，属绿僵菌属。该菌株液固发酵生产的干孢粉与植物油混合而成的油分散制剂是适用于防治蝗虫类农林害虫的生物杀虫剂，它对人畜无害、产孢率高、抗杂菌污染、性能稳定。要求保护该菌株。
现有技术蝗灾是一种对农业生产具有毁灭性打击的世界性生物灾害，也是我国农牧业安全生产的重大威胁和社会稳定的重要隐患，每年全球因蝗灾造成农作物损失5-18％，经济损失近100亿美元。目前我国控制蝗灾主要应用化学农药，近年来有少量微孢子虫生物制剂进入蝗虫控制领域，但使用面积小，使用效果不够稳定。蝗虫防治中长期大量施用的化学农药既严重污染环境、威胁人民身体健康，还大量杀伤害虫天敌，破坏生态平衡。2001年邱式邦等六位院士建议加大生物治蝗的力度；农业部制定了《全国蝗虫灾害可持续治理方案》，将生物防治技术作为蝗灾可持续控制的主要手段，提出要求十五期间生物防治面积达30％以上。因此蝗虫防治急需安全有效、不杀伤非目标生物的杀蝗生物农药。
真菌是植物害虫、病菌和害草最主要的天敌，在植物病虫草害防治中起着重要作用。对真菌类生物农药的研发国际上已有许多成功的事例。在虫生真菌制剂方面，仅绿僵菌和白僵菌制剂国际上已登记的产品即有20多个，如1995年美国环保署批准Mycotech公司生产球孢白僵菌制剂Mycontrol RWP，用于防治蔬菜害虫；80年代后期国际生防所(英国)研制的绿僵菌油剂，该产品已转让法国和南非两家公司，在非洲对飞蝗和草原蝗虫防效达90％以上。但由于国外所选用的绿僵菌菌株产孢率低，对非目标(环境其它)生物有杀伤作用，用它制得的绿僵菌杀蝗制剂成本高，因此，在我国没有得到广泛利用。
国内对真菌生防制剂的研究始于50年代，其中一些已具有相当的规模，如白僵菌防治松毛虫在我国每年应用面积达几千万亩，我国研制的液固两相真菌孢子生产技术已得到国外同行的认可，但是由于使用的菌株毒力不稳定，抗污染力弱，生产工艺落后以及基础研究差等原因，在本发明之前，尚无一个商品真菌杀虫剂登记注册。目前我国虽有上百家工厂生产白僵菌、绿僵菌，但都不同程度存在产孢效率低，生产周期长的缺陷，不符合工业化规模生产的基本要求，成为真菌生物农药在我国未能商品化的一个重要原因。
综上所述，在蝗虫生物防治的过程中，最关键的问题是要获得对靶害虫有足够杀灭能力，能实现工业化规模生产的微生物菌株。
发明内容
本发明的目的是通过自然筛选的方法，获得一株高毒力、强专化性的新型杀蝗真菌菌株，利用该菌株生产的杀蝗生物农药对环境昆虫和生物无伤害作用。
本发明所述的绿僵菌菌株已在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2003年1月10日，保藏号CGMCC No.0877；具体内容是金龟子绿僵菌CQMA102，Metarhiziumanisopliae.CQMA102，CGMCC No.0877。
本发明技术方案是采集天然感病蝗虫→保湿培养僵虫→分离纯化菌株→低浓度抑菌平板诱导培养→生物学特性比较→生产性状比较→生产菌株确定→液固两相发酵→分离收集干孢子粉→油剂配制→点滴接种蝗虫→菌株毒力测定。经过反复筛选，选出一株抗污杂、高毒力、高产孢的杀蝗金龟子绿僵菌菌株，编号为CQM102菌。现已完成该菌株的内转录基因间区核苷酸序列测定和分析，从中确定了该菌株的分子标记，可以为该菌株的分子验证和诉讼用仲裁法提供鉴定依据。该菌株分类地位；绿僵菌属Metarizium，金龟子绿僵菌Metarizium anisopliae。
菌落培养特征在萨氏培养基上菌落初期白色茸状，产孢时灰绿色至橄榄绿色，由里向外长出成丛的绿色分生孢子堆。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分枝或轮生体。后期培养物菌落呈壳状。菌株可以在SDA上28℃生长一周，直径达3.5cm；在35℃时菌落生长速度变慢，一周菌落直径为2.4cm。
菌株形态特征菌丝具分枝分隔，粗1.4-2.1um。瓶梗型产孢细胞，大小幅度为2.1-2.9×7.1-7.5μm；从瓶梗顶端产生向基成熟的分生孢子链；孢子链连接点倾斜度小；分生孢子单细胞，长椭圆形至卵圆状，两端钝圆形，一端稍细，孢子尺寸变幅较大，1.9-3.1×5.5-9.5um。分生孢子有时亦单生于菌丝分枝孢梗末端。
利用本发明所述菌株生产的杀蝗生物农药不仅具有对蝗虫类害虫毒力高、对非靶标生物无害、耐高温、抗污染力强、产孢率高等优良特性，而且能在低环境湿度条件下有效防治蝗虫，并且能稳定贮存1年以上。
绿僵菌菌株生物学特性测定一、CQMA102菌株的杀虫毒力和寄主范围收集液固双相发酵生产的绿僵菌CQMA102的干孢子粉(含水量5％以下)，用色拉油分散，配置成终浓度为1×107spores/ml的油孢子悬浮液，接种日龄基本一致的各种供试蝗虫。将油孢子液点滴在供试蝗虫前胸背板下(5ul/头)，每种蝗虫接种50头，接种后放入60cm×60cm×40cm的饲养箱中人工饲养，调节室温至30℃、湿度40～50％，光、暗周期16h/8h。各处理设一空白对照，对照处理中用食用油代替绿僵菌孢子接种。每天定时观察，更换饲料(麦麸∶酵母粉＝4∶1)和新鲜麦苗。每天记录死亡虫数，经DPS2000软件统计分析得到LT50(致死中时)、LT90(致死终时)。
表1CQMA102对不同蝗虫的毒力蝗虫LT50(P＝0.05)LT90(P＝0.05)东亚飞蝗3.66±0.12 4.88+0.19黄脊竹蝗3.32±0.15 4.23±0.13中华稻蝗3.45±0.11 4.72±0.24中华蚱蜢3.27±0.16 4.76±0.20棉蝗4.25±0.22 5.87±0.27亚洲小车蝗 3.02±0.15 403±0.13从表1可以看出CQMA102对东亚飞蝗、黄脊竹蝗、中华稻蝗、中华蚱蜢、亚洲小车蝗和棉蝗等6种蝗虫具有明显的防治效果，几种蝗虫的LT90均小于6天，4、5天为死亡高峰期(棉蝗因虫体大，死亡高峰期为5-6天)。
二、CQMA102菌株对杀菌剂的耐受性在分别含10、30、50ppm苯菌灵的1/4SDA(10％葡萄糖、2.5％蛋白胨、5％酵母浸膏)固体培养基上，接种5×106/mL的CQMA102孢子悬浮液，均匀地涂布在上述培养基平板上，25±1℃恒温箱中培养，每天观察生长与产孢情况。产孢后用直径9mm打孔器随机打取菌块(3个/皿)，放入装有20mL0.05％吐温-80的50ml三角瓶中，在磁力搅拌器上充分搅匀后用血球计数板测定绿僵菌含孢量。设制不加杀菌剂的1/4 SDA培养基为对照。从图1可以看出低浓度如10ppm苯菌灵对CQMA102菌株生长和产孢无明显的抑制作用，同对照相比，10ppm杀菌剂的处理与对照平板的产孢率无明显差异。而在30ppm以上浓度菌株成长和产孢可受到不同程度的抑制，表现为菌丝稀疏或产孢量明显下降。由此可见，CQM102菌株对杀菌剂有一定的耐受能力。
三、CQMA102菌株耐热性将CQMA102和对照菌株ME1干孢子粉分别混合成于色拉油中，配置成1×1010个/ml浓度的油剂，放置于25±1℃ 16小时后，分装于微量离心管中，在设置为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的梯度PCR仪中，分别保温1h、2h、4h后取出，涂抹在放有直径为9mm玻璃纸圆片的1/4SDAY平板上，每3h取一片玻璃纸圆片用棉蓝染色后镜检，计数200-300个孢子，记录萌发的孢子数，计算萌发率。每一处理设三次重复。
从图2中可以看出CQMA102菌株在60℃以下处理后萌发率没有显著变化，60℃以上温度处理孢子萌发率急剧下降，70℃处理后的萌发率分为16％，略优于ME1菌株的孢子萌发率。其它温度下两菌株24小时萌发率没有显著差异。表明CQMA102菌株孢子的高温耐受能力优于对照菌株。
四、CQMA102菌株总蛋白酶活性根据真菌菌株总蛋白酶活性与菌株致病力呈正相关的原理，通过简易快速的总蛋白酶活性初筛方法测定菌株毒力。将孢子浓度108个/ml的CQM102菌株同其它对照绿僵菌菌株接种液，分别接种于含蟑螂体壁粉的诱导培养液中，26℃振荡(150转/min)培养48h，6 000g离心10min，取上清液备用。取30ml 0.5％酪蛋白溶液，与70ml 0.05mol/L，pH7.5的磷酸缓冲液混匀，再加入1g琼脂粉，溶化后倒入直径为6cm塑料培养皿中，6mL/皿。以直径4mm的打孔器在培养基中打孔，取10μl诱导培养的不同菌株上清液加入孔中，26℃保湿过夜，向培养皿中加5ml 20％三氯醋酸液，总蛋白酶活性圈将表现为透明圈，以透明圈大小来判定菌株总蛋白酶的活性，透明圈越大，总蛋白酶活性或菌株毒力亦愈强。检测结果以看出，同对照菌株相比CQMA102菌株的透明圈最大，表明该菌株的总酶活性高于供试的其它菌株。
五、CQMA102菌株对紫外线的耐受能力根据绿僵菌不同菌株对环境条件如高温、紫外线辐射等的耐受能力的差异性，将分别用ME1和CQMA102制成的1×1010/mL绿僵菌油剂的油孢子与稀释剂按1∶1混合均匀后，26℃恒温箱过夜，用接种环分别涂抹在直径9mm玻璃纸圆片的1/4SDAY平板上，置于距30w的紫外灯35cm的地方垂直照射60S、120S、240S后，取出放入26℃恒温箱内进行培养24h后，取一片玻璃纸圆片用棉蓝染色后镜检，数200～300个孢子，记录萌发的孢子数，计算萌发率。
从表2可看出，CQMA102菌株和ME1对紫外线抵抗能力较强，24h萌发率都达到90％以上，与未处理对照无显著差异。表明CQMA102菌株对紫外线照射的耐受能力与标准菌株一致。
表2.紫外线照射对绿僵菌孢子萌发的影响照射时间(s) ME1 CQMA10260 96％ 97％120 95％ 96％240 94％ 95％CK 98％ 99％六、CQMA102菌株的产孢率将培养物料大米在含有2％酵母粉、5％硝酸钠和铜、硼、锌等微量元素的营养液中浸泡2h后装入透气抗菌复合固体发酵袋中(二次利用时，按发酵物料∶营养液为2∶1的比例加入4％酵母粉、8％硝酸钠和铜、硼、锌等微量元素的营养液)，拌匀后121℃高压湿热灭菌30min，自然冷却后按培养物料与菌液＝10～15∶1的比例，接种绿僵菌CQMA102菌液并拌匀均匀，置于26±1℃的发酵室中静止发酵10～12天后升温干燥(30℃～34℃)至物料含水量低于5％。随机抽取物料发酵样品，混匀后取5g左右的样品，放入装有20mL 0.05％Tween-80的50ml三角瓶中，充分混匀后用血球计数板测定产品的含孢量。第二次发酵按500×108个/g与大米第一次用后损失15％换算出固体发酵产孢率。两次发酵后培养料总产孢率＞5％。
七、CQMA102菌株对环境中非靶标生物的影响将蜜蜂放入装有蜂蜜的直径25cm，高30cm的塑料网兜中，每网兜100。只；60只蚂蚁放入盆口四周涂有凡士林的40cm×50cm×30cm塑料盆中；蝌蚪、鲫鱼放入盛有10升水的塑料盆中(55只蝌蚪/盆、15条鲫鱼/盆)，河虾放入塑料盆(20只虾/盆)内，盆内用充氧器充氧；小鸡、小鸭放入40cm×50cm的塑料盆，每盆10只，饲料250g。按1∶2比例将20％杀蝗绿僵菌油剂与真菌农药稀释剂(已申请专利，申请号02134002.1)混合后，放入26～28℃的室内环境中，每天投放饲料(小鸡、小鸭用喷药后的饲料饲养)，并分别记录供试生物死亡数。每一供试生物设3个重复，设一空白对照。将桑叶用以上方法喷撒绿僵菌油剂后，分别饲喂家蚕2-5龄幼虫(每处理各30头，设3次重复，一个对照)，逐日记载幼虫死亡率。
表3绿僵菌油剂对非靶标生物的影响测定 表4绿僵菌油剂对家蚕的影响测定 从表3、4可以看出绿僵菌油剂处理后蜜蜂、蚂蚁、蝌蚪、鲫鱼、河虾、小鸡、小鸭和家蚕死亡率与对照无明显差异，说明绿僵菌处理后的各种生物死亡属于自然死亡，绿僵菌CQMA102菌株对以上非靶标生物没有不良影响。
图1是CQMA102菌株对杀菌剂的耐受性图。
图2是菌株CQMA102与ME1菌株的耐热性比较(24h)图。
具体实施例方式
最佳实现方式菌种活化—一级种子发酵—二级种子发酵—液体发酵—接种物料—静止发酵—孢子干燥—质量检测—包装封存(—制剂加工—产品)。
权利要求
1.一株新型杀蝗真菌菌株，其特征是该菌株属于绿僵菌属，金龟子绿僵菌CQMA102，Metarhizium anisopliae.CQMA102，CGMCC No.0877。
全文摘要
本发明是一株新型杀蝗真菌菌株，属于绿僵菌属，种名为金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae CQMA102，保藏号CGMCC No.0877。利用该菌株生产的生物农药与其它杀蝗农药相比具有毒力高、只对蝗虫类害虫有效、对非靶标生物无害、耐高温、抗污染力强、产孢率高等优良特性。
文档编号C12N1/14GK1542123SQ20031011090
公开日2004年11月3日 申请日期2003年11月7日 优先权日2003年11月7日
发明者王中康, 殷幼平, 夏玉先, 彭国雄, 曾德玉 申请人:重庆大学, 重庆重大生物技术发展有限公司