专利名称：一种微生态制剂及其制备方法与专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物防治领域中一种防治小麦纹枯病的微生态制剂及其制备方法与专用菌株。
背景技术：
小麦纹枯病是主要由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染所致的病害，分布范围较广。20世纪90年代以来，各冬麦区普遍发生，并逐年加重，成为制约我国小麦生产的主要因子之一。对于该病的防治，部分化学农药虽有一定防效，但存在效果不稳定、污染环境、投入成本高等问题。生物防治是近年来被证明很有成效的新途径，它主要是利用微生物之间的拮抗作用，选择对农产品不造成危害的微生物来抑制病原菌的生长。使用拮抗菌防治农作物病害，可以减少化学农药的用量和在农产品上的残毒，对保护人体健康和防止环境污染都极为重要。
发明创造内容本发明的目的是提供可有效防治小麦纹枯病并具有助长作用的菌株。
可防治小麦纹枯病的菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946，上述二株菌均已于2003年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号分别为CGMCC№1031和CGMCC №1032。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032，均从小麦纹枯病重病田的健康植株分离得到。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031，菌体呈杆状，长4-7微米，宽1.0-1.2微米，革兰氏反应阳性，芽孢中生或近中生，椭圆或柱状，芽孢囊不膨大，能厌氧生长，V.P反应阳性，V.P液pH4.3-5.5；生长温度10-45℃，7％NaCl中生长；pH5.7生长，从葡萄糖、麦芽糖产酸，不从木糖、乳糖、甘露醇产酸，能水解淀粉，利用柠檬酸盐；能还原NO3-和NO2-。与同种其它菌株相比菌体较长。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032，菌体呈杆状，长2-3微米，宽0.8-0.9微米，革兰氏反映阳性，芽孢椭圆或柱状，中生或近中生，孢囊不膨大，原生质中不含有β-羟基丁酸盐颗粒；7％NaCl中生长，石芯牛奶不产酸，pH5.7生长，v.p阳性，水解淀粉，还原NO3-和NO2-，不能厌氧生长，接触酶阳性。与同种其它菌株相比菌体较宽。
本发明的另一个目的是提供一种防治小麦纹枯病的微生态制剂及其制备方法。
本发明所提供的防治小麦纹枯病的微生态制剂，是以蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032中至少一株的菌体为活性成分，所述菌体为营养体和/或芽孢。
所述微生态制剂可为固态或液态，当为固态时，它还包括吸附添加剂，如碳酸钙，草炭，高钙土等，其中碳酸钙颗粒的直径优选为0.09mm，其含菌量为300-700亿个菌体/克微生态制剂，优选为500亿个菌体/克微生态制剂。固态微生态制剂每亩的用量为30-70克，可拌种也可在返青期、拔节期、灌浆期进行喷施。
当微生态制剂为液态时，其含菌量为1.0×106-1.0×1010cfu/ml水，优选为1.0×108cfu/ml水。液态微生态制剂每亩的用量为0.15-5升，可拌种也可在返青期、拔节期、灌浆期进行喷施。
一种制备上述防治小麦纹枯病的微生态制剂的方法，是培养蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032，并对发酵液进行后处理得到的。
所述后处理包括浓缩、添加填充料、压滤、干燥或粉碎等步骤。
本发明针对小麦纹枯病发生的严重性和小麦生产上存在的问题，根据植物微生态学原理，由小麦纹枯病重病田的健康植株体内分离出2株对小麦纹枯病防治效果明显的芽孢杆菌，并将其制成微生态制剂，本发明微生态制剂的防效达70％以上，并且对小麦生长有明显的促进作用，株高、鲜重等指标均有提高。
具体实施例方式
实施例1、内生芽孢杆菌的分离及鉴定1、内生芽孢杆菌的分离(1)分离在小麦纹枯病重病田选择健康植株，用蒸馏水冲洗干净，然后整株用1％NaClO表面消毒10分钟，无菌水冲洗3次，剪碎，加适量无菌水研碎，稀释到10-1，振荡均匀，放入80℃的水中处理10分钟，梯度稀释到10-4，取0.1ml接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，涂布均匀。置于30℃恒温箱中暗培养3d，待单菌落长出后，纯化，转管，保存。
(2)筛选接种病原菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)于PDA平板中央，将待测芽孢杆菌接种于平板四周，每皿在4个方位各接种1株，重复3次，进行初筛；取拮抗性明显的菌株，再进行单株与病原菌对峙培养，采取一边接芽孢杆菌，一边接病原菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，或将中间划线接芽孢杆菌，两边接病原菌的两种对峙培养法进行复筛。结果得到32株对禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)具有拮抗作用的菌株。
(3)盆栽防病试验将具有拮抗性的菌株(32株)进行盆栽试验，菌株活化后接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃摇床培养30小时，检测菌液含菌量，无菌水稀释到1.0×108cfu/ml。
小麦种子经1％NaClO表面消毒10分钟，无菌水反复冲洗5次，25℃下催芽。将出芽的种子用上述配制好的菌液浸种2小时后，在装有250克混合土(自然土∶草炭土＝2∶1)的花盆内播种，每盆15粒种子，待小麦出苗4-5天后，小麦长1-2片叶子时，用打孔器将长有纹枯病菌平板打孔，取病原菌贴于小麦苗基部，并覆少量混合土，保持25℃左右的温度和较高湿度，待发病后统计病情指数，计算防效。以清水处理为对照。
病情分级标准0级全株无病；1级叶鞘发病，茎杆无病斑；2级茎杆上病斑宽度小于茎杆的1/2；3级茎杆上病斑宽度大于茎杆的1/2；小于周长3/4，茎杆不软化；4级茎杆上病斑宽度大于茎杆周长的3/4，茎杆软化，形成白穗。
将32株对禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)具有拮抗作用的菌株，经过三批盆栽测定，结果如表1所示，表明有2株芽孢杆菌B932和B946表现较高的防治效果，且均在70％以上。
表1芽孢杆菌防治小麦纹枯病盆栽试验结果菌株病情指数 病情指数 防效I IIIII 平均值 ％B9327.3 7.6 6.7 7.2 71.0B9466.5 6.8 7.4 6.9 72.2对照23.526.7 24.2 24.8 -2、内生芽孢杆菌B932和B946的鉴定经鉴定，B932为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，B946为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例2、微生态制剂的制备
1.生产工艺为经液体深层发酵法制成粉剂，工艺主要环节为原菌种活化→菌种扩大培养→种子罐培养→发酵罐培养→添加填充料→压滤→干燥→粉碎→粉剂质量检测→包装→产品检测。
2.技术指标各种技术指标如表2所示。
表2技术指标
3.菌种生产操作规程培养基制备按如下配方制备培养基牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.5％，琼脂2％。将琼脂加热溶化后用NaOH或Hcl调pH值至7.0-7.5，然后分装克氏瓶或试管，置于灭菌锅内，在0.11MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用。
菌种活化与扩大培养用培养基在无菌条件下从原菌种斜面上挑取少许菌苔，置放试管斜面内进行划线，然后置28-30℃温箱内培养24h，经检查无杂菌、菌体生长整齐，再置28-30℃温箱内培养24-28h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片、染色检查无杂菌，芽孢大小一致的，可放冰箱中存放备用(4℃左右为宜)。
4.种子罐培养(1)培养基种子罐培养基配方豆饼粉0.5％、鱼粉0.3％、玉米粉0.5％、葡萄糖0.3％，豆油0.2％-0.3％(或泡敌0.3％)，pH值7.0-7.5。
(2)空发酵罐灭菌发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.14MPa压力下，灭菌30min。
(3)种子罐装料参考(1)的配方比例装料，投料量不得超过罐容积70％。
(4)种子罐灭菌装好料后，在0.11MPa压力下灭菌30min，冷却至30℃后即可接种。
(5)悬浮液制备在无菌条件下将每个克氏瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10亿个菌体/ml，并在80℃恒温水锅中处理20min。
(6)接种将制好的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946的菌悬液，按1％的比例接种于冷却至30℃的种子罐内进行培养。
(7)种子罐培养条件控制接种后在温度为28-30℃，压力0.05MPa通气量1∶1.3(每min体积比)和220转/min搅拌条件下，培养8-10h。
5.发酵罐发酵(1)发酵罐培养基豆饼粉2％，鱼粉0.5％，玉米浆1.8％，淀粉0.4％，硫酸镁0.06％，碳酸钙0.5％，磷酸二氢钾0.03％，豆油0.1％或泡敌0.05％，用NaOH或HCl调PH值7.0-7.5左右，装置为罐容积的70％。
(2)发酵培养条件搅拌速度180-200转/min，罐压0.05MPa；通气量移种后4h内通气量有10.7-0.8(每分钟进出体积之比)，以后逐淅增大至1∶1.3。一般发酵培养周期为12-18小时，在芽孢70％形成，个别芽孢开始脱落时，即可放罐，这时杂菌污染＜0.3％含菌量＞100亿个菌体/ml。
6.后处理(1)设备搅拌机、板框、干燥机(装置)、超细度粉碎机等。
(2)吸附剂一般采用的粒度为0.09mm的轻质碳酸钙为吸附添加剂，加入量按下列公式计算 (3)压滤按(2)规定向步骤5得到的发酵液中加入吸附剂后，机械搅拌3-6h，使芽孢全部被吸附，然后再用板框压滤。
(4)干燥将板框压滤后的滤饼捣碎后。置于烘干机或烘干装置内进行烘干。烘干时的温度不超过65℃(为了防止菌体死亡)，要不断翻动，使受热均匀。当含水率≤5％时，即可进行粉碎、包装。
(5)粉碎利用高细度粉碎机粉碎，100％通过0.09mm孔径筛。
7.成品检验含水率用干燥失重法(重量法)测定，含水率≤5％为合格，细度采用湿筛法测定，100％通过0.09mm筛为合格，具体方法按HG2-896标准的湿筛法测定。
8.包装用编制袋(内有塑料袋)25Kg包装，于干燥通风处贮存，保存期3年。
实施例3、微生态制剂的田间防病效果1、田间防病试验(1)微生态制剂的制备按照实施例2的工艺，由蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946按含菌量比为1∶1混合制备含菌量为每克500亿个菌体的防治小麦纹枯病微生态制剂。
(2)小区设置选择往年小麦纹枯病发病均匀地块，每处理为一个小区，重复四次，小区面积为67m2，随机排列，以清水为对照。
(3)处理方法播种时，微生态制剂每亩的用量为50克，根据小区所需种子量将微生态制剂加适量水稀释后进行拌种，稍凉干后即可播种。然后在返青期、拔节期、灌浆期各进行1次喷雾，每亩用量50克，根据小区所需水量将微生态制剂溶解后喷洒。
(4)调查方法及结果采用五点取样法，对各处理区和对照区进行取样调查。拔节期以前按株取样，每点取50株；拔节期以后按茎取样，每点取50个茎杆。分级调查，病情分级标准同前，计算防效。
小麦纹枯病在苗期就开始发病，该微生态制剂在苗期的防病效果如表3所示，表明该微生态制剂通过拌种对小麦纹枯病有明显控制效果，防病效果达到80％以上，且在a＝0.05水平差异显著。
表3防治小麦纹枯病微生态制剂苗期防病效果处理 发病率(％) 病指 防效(％)
防病微生态制剂2.401.25 80.4CK9.006.40 -该微生态制剂在拔节期的防病效果如表4所示，表明通过拌种+喷雾1次处理，在拔节期调查，防效超过70％，达75.1％，且在a＝0.05水平差异显著。
表4防治小麦纹枯病微生态制剂拔节期防病效果处理 发病率(％) 病指防效(％)防病微生态制剂7.152.1075.1CK27.36 8.43-该微生态制剂在灌浆期的防病效果如表5所示，表明通过拌种+喷雾2次处理，灌浆期调查，该微生态制剂对小麦纹枯病均有较高的控制效果，防效超过70％，且在a＝0.05水平差异显著。
表5防治小麦纹枯病微生态制剂灌浆期防病效果处理 发病率(％) 病指 防效(％)防病微生态制剂30.18 10.38 73.0CK60.70 38.40 -----实施例4、微生态制剂在防止小麦纹枯病发生同时的促长增产试验(1)蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932微生态制剂和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946微生态制剂的温室促长测定将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946分别活化后分别接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃摇床培养30小时，检测菌液含菌量，无菌水稀释到1.0×108cfu/ml，分别得到蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)B932微生态制剂和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946微生态制剂。
小麦种子经1％NaClO表面消毒10分钟，无菌水反复冲洗5次，25℃下催芽。将出芽的种子分为三组对照组、B932组和B946组，对照组用水、B932组和B946组分别用上述配制好的微生态制剂浸种2小时后，在装有250克混合土(自然土∶草炭土＝2∶1)的花盆内播种，每盆15粒种子，待小麦出苗4-5天后，小麦长1-2片叶子时，用打孔器将长有纹枯病菌平板打孔，取病原菌贴于小麦苗基部，并覆少量混合土，保持25℃左右的温度和较高湿度，对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932微生态制剂和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946微生态制剂进行促进生长效果测定，调查株高、鲜重等指标。
株高、鲜重结果如表6、表7所示，表明通过浸种处理，蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)B932微生态制剂和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946微生态制剂具有促进生长作用，株高增加17.9-25.6％，鲜重增加27.5-34.1％，且在a＝0.01水平上差异显著。
表6芽孢杆菌对小麦株高的影响株高(cm) 株高平均值(cm) 增高率(％)菌株I II IIIB932 30.430.026.7 29.0b 17.9B946 32.929.528.8 30.4a 23.6对照 25.423.724.7 24.6c -表7芽孢杆菌对小麦鲜重的影响菌株 鲜重(g/100株) 鲜重平均值(g/100株) 增重率(％)I II IIIB9328.211.816.7 12.2b 34.1B94611.5 11.611.5 11.6a 27.5对照7.09.0 11.2 9.1c-(2)微生态制剂的增产效果测定本实施例中的微生态制剂为实施例3中的微生态制剂。
选择往年小麦纹枯病发病均匀地块，每处理为一个小区，重复四次，小区面积为67m2，随机排列，以清水为对照。
播种时，微生态制剂每亩的用量为50克，根据小区所需种子量将微生态制剂加适量水稀释后进行拌种，稍凉干后即可播种。然后在返青期、拔节期、灌浆期各进行1次喷雾，每亩用量50克，根据小区所需水量将微生态制剂溶解后喷洒。
在小麦收获期，每小区五点，每点取1平方米测定亩穗数、穗粒数和千粒重，计算产量。另外，各小区进行实打实收测定实际产量，计算增产效果。该微生态制剂增产效果如表8所示，表明该微生态制剂具有增产效果，可使小苗亩增产10.86％。
表8防治小麦纹枯病微生态制剂增产效果测定处理 测定产量 增产率实际产量 增产率(Kg/亩)(％) (Kg/亩)(％)防病微生态制剂579.85 10.89 539.75 10.86CK522.92 ----- 486.87 -----
权利要求
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032。
2.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031。
3.一种防治小麦纹枯病的微生态制剂，是以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032中至少一株的菌体为活性成分，所述菌体为营养体和/或芽孢。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂为固态。
5.根据权利要求4所述的微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂还包括吸附添加剂。
6.根据权利要求5所述的微生态制剂，其特征在于所述吸附添加剂为碳酸钙。
7.根据权利要求6所述的微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂的含菌量为300-700亿个菌体/克微生态制剂。
8.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂为液态。
9.根据权利要求8所述的微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂的含菌量为1.0×106-1.0×1010cfu/ml水。
10.一种制备权利要求3所述的防治小麦纹枯病的微生态制剂的方法，是培养蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和/或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B946 CGMCC №1032，并对发酵液进行后处理得到的。
全文摘要
本发明公开了一种微生态制剂及其制备方法与专用菌株，其目的是提供一种可有效防治小麦纹枯病的菌株，利用该菌株制备的防治小麦纹枯病的微生态制剂及其制备方法。本发明所提供的防治小麦纹枯病的菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031。本发明所提供的防治小麦纹枯病的微生态制剂，以蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B946 CGMCC №1032中至少一株的菌体为活性成分，所述菌体为营养体和/或芽孢。本发明微生态制剂的防效达70％以上，并且对小麦生长有明显的促进作用，施用后作物的株高、鲜重等指标均有提高。
文档编号C12N1/20GK1544617SQ20031011373
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月24日 优先权日2003年11月24日
发明者王 琦, 梅汝鸿, 王 琦 申请人:中国农业大学