专利名称：用于癌症诊断和治疗的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及癌症的诊断，特别是通过检测miR15和miR16拷贝数目，突变情况，或基因表达来诊断慢性淋巴性白血病或前列腺癌。本发明还涉及癌症的治疗，包括miR15或miR16基因表达的减少或缺失，特别是通过施用miR15或miR16基因产物治疗慢性淋巴性白血病或前列腺癌。
背景技术：
在美国和全世界癌症都是死亡和发病的一个重要原因。特别是慢性淋巴性白血病(“CLL”)和前列腺癌在临床上是重要的成人肿瘤病。CLL是西方世界是最普遍的一种成人白血病形式。而且在美国的男人中，前列腺癌的年龄校正发病率目前超过了所有其它癌症，仅次于肺癌，是该国家所有男性癌症死亡的第二大原因。
在多于一半的报道CLL病例中都会发生13q14的半合子丢失和/或纯合子丢失，这构成了CLL中最频繁的染色体异常。CLL患者的组织样品的染色体组型相对具有较少的染色体异常，这表明所观察到的13q14缺失的特异性和频率具有病理学重要性。除此之外，60％的前列腺癌中也具有13q14缺失，表明CLL和前列腺癌的发病机理涉及位于13q14的一种或多种肿瘤抑制基因。
CLL和前列腺癌中同时存在克隆性纯合和杂合性缺失，以及非常高的13q4丢失频率，表明该区域的缺失与特定癌症类型的病因有关。对几种基因进行位置克隆以鉴别缺失部位的基因。至今从突发性CLL和遗传性CLL的13q14的缺失区域共鉴别了八个基因，并检测了其DNA和/或RNA水平的改变Leu1(BCMS或EST70/Leu1)，Leu2(ALT1或1B4/Leu2)，Leu5(CAR)，CLLD6，KPNA3，CLLD7，LOC51131(推测的锌指蛋白NY-REN-34抗原)和CLLD8。但是，详细的基因分析，包括大范围的杂合性丢失(LOH)，突变和表达研究，却没能证明任何这些基因与致癌作用的关系。
小分子RNA(miRNA)存在于超过一百种不同的生物体中，包括果蝇，线虫和人。认为在这些生物体中在多种发育调节过程中都涉及到miRNA，miRNA典型地是通过60到70个核苷酸的反馈RNA前体结构的处理得到的，该反馈RNA前体结构是由miRNA基因转录而来的。RNA前体或处理的miRNA产物很容易检测，缺少这些分子表明相应miRNA基因的缺失或功能丢失。
目前CLL的治疗典型地包括化学疗法，单独施用或与自体同源骨髓移植一起进行。所使用的化学治疗剂通常对患者具有毒性，在大部分患者中都只是达到部分缓解的效果。前列腺癌和其它癌症治疗的疗法也包括化学疗法，通常是在外科手术切除肿瘤以后。但是，对于CLL，化学治疗剂(与外科手术一起进行或不与其一起进行)的治疗受到限制。
前列腺癌也可以用外部射线照射或近距离放射疗法(例如使用具有放射活性的“种子”)治疗，也是单独使用或与外科手术一起使用。这种治疗的危险是将患者的正常组织暴露在放射线之中，以及可能不是完全有效。
CLL或前列腺癌需要有快速，经济和准确的诊断性检测。对于癌症还需要有经济和有效的并且对患者没有显著的负面影响的治疗，特别是CLL或前列腺癌。
发明简述现已发现在人中，miR15或miR16基因位于13q14，而在很大一部分CLL或前列腺癌患者中13q14区域都缺失。还发现miR15或miR16基因的RNA产物抑制CLL和前列腺癌细胞的赘生物或肿瘤生长。这些RNA产物可以用于癌症治疗，对miR15或miR16基因进行负调控。
miR15和miR16小分子RNA基因位于13q14，在CLL和前列腺癌丢失的30kb区域中，在大部分CLL和前列腺癌中这两个基因都缺失或受到负调控。因此，本发明提供了一种CLL或前列腺癌的诊断性检测，包括检测这些基因的基因产物，检测miR15或miR16基因的拷贝数，或测定其突变情况。
在一个实施方案中，所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离RNA，用miR15或miR16前体或处理过的miRNA的探针用Northern blot杂交检测miR15或miR16基因产物，其中miR15或miR16前体或处理过的miRNA与正常样品对照相比有所减少则诊断为CLL或前列腺癌。
在另一个实施方案中，所述诊断检测包括从怀疑患有miR15或miR16介导的癌症例如CLL或前列腺癌的患者中分离DNA，用miR15或miR16基因序列的探针用Southern blot杂交检测miR15或miR16基因拷贝数，其中基因拷贝数减少到1或0则诊断为CLL或前列腺癌。
在另一个实施方案中，所述诊断检测包括通过评价D13S273和D13S272标记的杂合性丢失检测miR15或miR16基因拷贝数的减少，其中有这些标记的杂合性丢失诊断为CLL或前列腺癌。
在另一个实施方案中，所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离DNA，用PCR扩增miR15或miR16基因片段检测miR15或miR16基因的缺失或突变并将该扩增片段与正常样品对照的扩增片段相比较，其中在miR15或miR16基因的一个或多个拷贝中检测到突变则诊断为CLL或前列腺癌。可以用单链构象多态性方法比较扩增片段。在一方面，所述突变为miR15或miR16基因序列的部分缺失。
在另一个实施方案中，所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离RNA，检测到miR15或miR16基因产物的突变则诊断为CLL或前列腺癌。
在另一个实施方案中，所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离RNA，用逆转录酶-聚合酶链式反应扩增miR15或miR16前体或处理过的miRNA从而检测miR15或miR16基因产物的水平，其中miR15或miR16前体或处理过的miRNA与内对照的扩增RNA相比有所减少则诊断为CLL或前列腺癌。
本发明还提供了一种在需要治疗的患者中治疗miR15或miR16介导的癌症的方法，包括将有效量的miR15或miR16基因产物给予患者，由此癌细胞的增殖受到抑制。
本发明还提供了一种在需要治疗的患者中治疗miR15或miR16介导的癌症的方法，其中分离患者的细胞并在离体条件下用有效量的含有编码miR15或miR16基因产物的序列的核酸转染。然后将这些细胞重新植入到患者体内，由此患者的癌细胞的增殖受到抑制。
本发明进一步提供了一种在患者中抑制miR15或miR16介导的癌症的增殖的方法，包括向细胞递送有效量的miR15或miR16基因产物。
本发明进一步还提供了一种治疗患有miR15或miR16介导的癌症的患者的药物组合物，包括分离的miR15或miR16基因产物，或编码miR15或miR16基因产物的核酸，以及药学可接收的载体。
附图简述
图1A和图1B分别是预测的miR15和miR16前体RNA的二级结构的示意图。用“mfold”程序，3.1版，Matthews et al.(1999)，J.Mol.Biol.288911-940进行RNA二级结构预测，人工修饰以使螺旋区段内包含G/U摆动碱基对。处理的miR15和miR16miRNA以下划线表示。根据Lagos-Quintana et al.(2001)，Science294853-858进行了修改。
图2A是CLL中13q14肿瘤抑制子位点内的基因图谱，显示出miR15/16基因簇的定位。其中显示了遗传标记和基因在图谱上的位置。
图2B是已报道过的13q14缺失图谱，用水平条框标记。
图2C是D13S1150和D13S272标记之间的位点图谱。在此位点上每个基因的方向都在基因名称下方用箭头标出，彩色的垂直条表示每个基因相应外显子的位置。
图2D是Alu 18和D13S272标记之间的位点图谱。条和框表示LEU2/ALT1和LEU1外显子的位置。短垂直箭头表示miR15或miR16基因的位置。圆点表示用于筛选衍生自两种独立的白血病细胞(CLL-A和CLL-B)的融合细胞的体细胞杂交克隆的PCR引物的位置。填充框表示杂交体中的染色体13的部分。“←～31.4kb→”表示在来自患有具有t(2；13)(q12；q13)移位的CLL，两边眼癌，溃疡性结肠炎的患者的克隆CLL-A中大约31.4kb的缺失区域。长垂直箭头表示具有t(2；13)(q32；q14)移位的克隆CLL-B的断点位置，“←～29kb→”表示该克隆中大约29kb的缺失区域。
图3A是正常人肾，前列腺，肝脏，骨骼肌(“Sk肌”)，睾丸，CD5+B细胞(CD5+)，白血病细胞(“Per Bl Leuk”)和骨髓(“BM”)中miR15和miR16基因表达的Northern blot分析。
图3B是在18个CLL患者中微卫星标记D13S272和D13S273的杂合丢失(“LOH”)分析。用来自正常人CD5+细胞的DNA作为对照。样品的LOH状态用“+/+杂合”，“+/-LOH”，“-/-纯合缺失”，“NI”(无意义)，“？”(没有足够材料)和“ND”(未实施)。用溴化乙锭染色的Northern凝胶作为归一化对照。
发明详述本文给出的所有核酸序列都是5’到3’方向的。此外，核酸序列中的所有脱氧核糖核苷酸都用大写字母表示(例如，脱氧胸腺嘧啶为“T”)，核酸序列中的核糖核苷酸用小写字母表示(例如尿嘧啶为“u”)。
CLL或前列腺癌可以通过检测miR15或miR16基因拷贝数的减少，或者通过检测miR15或miR16基因的一个或多个拷贝的突变来诊断。miR15或miR16基因拷贝数从双倍减少为单倍，或者减少到没有拷贝，则诊断为CLL或前列腺癌。同样地，miR15或miR16基因的一个或多个拷贝的突变表示基因功能的丢失，则诊断为CLL或前列腺癌。
这里所用的“CLL细胞”是来自患有或怀疑患有CLL的患者的淋巴细胞，其中淋巴细胞的“CLL分数”至少为4，这是根据Matutes et al.(1994)，Leukemia 8(10)1640-1645所述的评分系统确定的，在此引入其全文作为参考。这里所用的“前列腺癌细胞”是来源于的前列腺的赘生物或肿瘤细胞，不管其是否位于前列腺中。本领域技术人员可以容易地鉴别CLL或前列腺癌细胞。
miR15/miR16基因簇的位置在13q14。这些基因的核酸序列包含在克隆317g11中，其核苷酸序列的GenBank记录号是AC069475。在此引入该记录的全部内容作为参考。可以通过测定怀疑患有CLL或前列腺癌的患者组织中的这些基因的结构或序列，并将其与该患者的未受影响的组织样品中，或正常对照组织的样品中的这些基因的结构或序列进行比较，从而检测miR15或miR16基因的缺失或突变。可以用任何适当的方法进行这种比较。
根据本发明，要诊断miR15或miR16介导的癌症，要从患者中获取组织样品。然后制备样品并测定miR15或miR16基因产物的表达或miR15或miR16基因的缺失或突变。组织样品包括感兴趣的活组织，以及血液和体液样品。
这里所说的“miR15或miR16介导的癌症”是指在至少一部分与该癌症相关的肿瘤细胞或赘生物细胞中miR15或miR16基因减少或缺失的任何癌症。miR15或miR16介导的癌症的实例包括CLL和前列腺癌。
miR15或miR16缺失或突变的存在可以通过患者基因组DNA的Southern blot杂交来检测，使用miR15或miR16基因的探针，例如如下所述的。另外，可以从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中获取血液样品，分离白细胞进行DNA提取。优选血液或组织样品是从还没有开始放射疗法或化学疗法的患者中获得的。作为对照的相应的组织或血液样品可以从该患者的未受影响的组织中，或者从正常的人个体中获得。
Southern blot杂交技术是本领域技术人员公知的。例如将从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者的组织或血液中分离的基因组DNA用限制性内切酶消化。消化产生基因组DNA的限制性片段，可以用电泳，例如琼脂糖电泳分离。然后将限制性片段点样在杂交膜(例如硝酸纤维素或尼龙)上，并与miR15或miR16基因特异的标记探针进行杂交。与该患者的DNA样品进行了相同处理的对照DNA样品相比，杂交膜上限制性片段类型的改变表示这些基因发生缺失或突变。本领域普通技术人员可以容易地确定适合于检测miR15或miR16基因拷贝数或突变的探针标记和杂交条件。这里所用的术语“缺失”是指基因的部分缺失或全部基因缺失。
用于Southern blot杂交的miR15和miR16核酸探针可以根据公开的miR15和miR16小分子RNA的序列用Lagos-Quintana etal.(2001)，Science 294853-858所述的方法设计，在此引入其全文作为参考。miR15小分子RNA的核苷酸序列是uagcagcacauaaugguuugug(SEQ ID NO3)。miR16小分子RNA的核苷酸序列是uagcagcacguaaauauuggcg(SEQ ID NO4)。检测miR15和miR16 DNA的合适探针分别是CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQ ID NO5)GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQ ID NO6)SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的互补序列也可以用作miR15和miR16 DNA的探针。
制备标记的DNA和RNA探针的方法，以及与靶核苷酸序列杂交的条件如Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook et al.，eds.，2nd edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，Chapters 10 and 11所述，在此引入作为参考。
例如，核酸探针可以用例如放射性核素如3H，32P，33P，14C或35S；重金属；或者能与标记的配体特异性结合的配体(例如生物素，抗生物素蛋白或抗体)，荧光分子，化学发光分子，酶等物质进行标记。
可以用Rigby et al.(1977)，J.Mol.Biol.113237-251所述的缺口平移法或Fienberg et al.(1983)，Anal.Biochem.1326-13所述的随机引物法获得高比活性的标记探针，在此引入其全文作为参考。后者则是从单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记的探针的方法。例如，根据缺口平移法，通过用具有高放射活性的核苷酸替换已存在的核苷酸，可以制备得具有超过108cpm/mg的比活性的32P标记的核酸探针。然后将杂交膜曝光在胶片上，进行放射自显影检测。对杂交膜曝光的胶片进行光密度扫描，得到miR15或miR16基因拷贝数的精确测量结果。而且miR15或miR16基因拷贝数还可以用计算机成像系统，例如AmershamBiosciences，Piscataway，NJ的Molecular Dynamics 400-B 2DPhosphorimager进行定量分析。
如果无法用放射性核素对DNA或RNA探针进行标记，可以使用随机引物法将dTTP类似物5-(N-(N-生物素基--氨基己酸基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿嘧啶三磷酸盐引入到探针分子中。生物素化的探针寡核苷酸可以通过与与荧光染色或能产生颜色反应的酶偶连的生物素结合蛋白如抗生物素蛋白，抗生物素蛋白链菌素，或抗生物素抗体反应来检测。
miR15或miR16基因的缺失或突变还可以通过用聚合酶链式反应(PCR)扩增这些基因的片段，用测序或电泳分析扩增的片段以确定患者DNA样品的扩增片段的序列和/或长度是否和对照DNA样品有所不同来检测。本领域普通技术人员可以容易地确定DNA片段的PCR扩增的合适反应和循环条件。如下所述的实施例中使用的方法给出了典型的PCR反应和循环条件。
miR15或miR16介导的癌症的诊断可以通过检测不同染色体标记，例如图1A，1B，和2A-2D中所示的各标记之间13q14的缺失来进行。例如，在含有miR15或miR16的微卫星标记D13S272和D13S273之间的13q14区域的缺失表明存在miR15或miR16介导的癌症。另外，如果13q14的缺失是在微卫星标记D13S1150和D13S273之间或是在Alu18位点和微卫星标记D13S273之间，其中miR15或miR16缺失，则表明存在miR15或miR16介导的癌症。
另外一种确定组织样品中每个二倍体基因组的miR15或miR16基因数目的方法是基于miR15/miR16基因簇位于13q14并且与标记D13S272和D13S273相连的事实。在与D13S272和D13S273标记相连的位点杂合的个体的miR15或miR16基因拷贝的丢失可以从这些标记杂合的丢失推知。确定染色体标记杂合丢失的方法是本领域技术人员公知的。下述实施例3中给出了杂合丢失研究的实例。
另一种确定怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中miR15或miR16基因是否突变的方法是单链构象多肽性(SSCP)，例如Orita et al.(1989)，Genomics 5874-879和Hayashi(1991)，PCRMethods and Applic.134-38中所述的，在此引入其全文作为参考。SSCP方法包括通过PCR扩增感兴趣的基因片段，使片段变性并在非变性条件下用两条变性单链进行电泳。单链呈现复杂的依赖于序列的链内二级结构，影响链的电泳迁移率。
miR15或miR16基因中一个或全部的缺失或突变还会引起miR15或miR16基因表达的减少。因此，CLL或前列腺癌还可以通过检测miR15或miR16基因产生的RNA的表达水平来诊断，miR15或miR16基因表达的减少则诊断为CLL或前列腺癌。
miR15和miR16基因每个都转录产生～70kb的前体RNA，形成茎环结构。前体RNA不翻译成蛋白质，而是进一步处理成为“小分子RNA”或“miRNA”，认为这才是有功能的基因产物。
这里所说的“miR15或miR16基因产物”是指由miR15和miR16基因而来的处理过的或是未处理的RNA转录物，下面将进一步说明。术语“RNA”，“RNA转录物”和“基因产物”在本文中述及miR15或miR16基因表达时可互换使用。
miR15和miR16前体RNA如Lagos-Quintana et al.(2001)，Science 294，853-858所述，在此引入其全文作为参考。miR15和miR16前体RNA的序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。预测的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的茎环结构分别如图1A和图1B所示。ccuuggaguaaaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcugccucaaaaauacaagg[SEQ ID NO2]gucagcagugccuuagcagcacguaaauauuggcguuaagauucuaaaauuaucuccaguauuaacugug cugcugaagu aagguugac不受任何理论的限制，认为miR15和miR16前体RNA是由miR15/miR16基因簇共表达的，由Dicer/Argonaute复合体处理成为功能性miRNA产物。参见，例如Lee et al.(2001)，Science 294862。这些基因产生的两个功能性miRNA产物都是长度为22个核苷酸的单链RNA分子，5’端具有单磷酸盐，3’端具有羟基。处理过的miR15小分子RNA的核苷酸序列是uagcagcacauaaugguuugug(SEQ ID NO3)。处理过的miR16小分子RNA的核苷酸序列是uagcagcacguaaauauuggcg(SEQ ID NO4)。在本发明中，可以检测到由miR15或miR16基因产生的60-70nt的RNA前体分子。另外还可以检测到由Dicer和Argonaute蛋白对前体RNA进行处理产生的较短的miR15和miR16小分子RNA基因产物。
确定RNA表达水平的方法是本领域技术人员公知的。例如，如上所述从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中获得组织或血液样品。如上所述从患者的未受影响的组织中，或从正常人个体中获得相应的组织或血液样品作为对照。对照组织或血液样品与患者的样品一同处理。然后将患者中miR15或miR16基因的表达水平与患者中未受影响的组织的相比，或者与正常对照的组织或血液中的miR15或miR16表达水平相比。例如，CLL细胞或样品前列腺癌细胞中的相对miR15或miR16表达水平可以相对于一种或多种标准容易地确定。这些标准包括，例如，一种是表达水平为零，另一种是同一个患者的正常组织的基因表达水平，或正常对照组组织中的表达水平。所述标准还可以包括标准细胞系中的miR15或miR16表达水平。miR15或miR16表达与正常表达水平相比减少的量表示治疗后将具有的临床效果。
另外，还可以将怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中的miR15或miR16基因表达水平与先前获得的正常对照人群的miR15或miR16基因表达的平均水平相比较。
确定细胞中特定基因的RNA转录物水平的适当方法是本领域技术人员公知的。根据其中一种方法。用核酸提取缓冲液进行匀浆从细胞中提取总细胞RNA，然后离心。使核酸沉淀，用DNA酶处理和沉淀除去DNA。然后根据标准方法用琼脂糖凝胶电泳分离RNA分子，用例如所谓的“Northern”blotting技术转移到硝酸纤维素膜上。然后通过加热将RNA固定在膜上。用与所述RNA互补的具有适当标记的DNA或RNA探针对特定的RNA进行检测和定量。参见，例如，Molecular CloningA LaboratoryManual，J.Sambrook et al.，eds.，2nd edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，Chapter 7，在此引入其全文作为参考。用于miR15或miR16 RNA的Northern blot杂交的适当探针包括SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
将杂交膜曝光在胶片上，对与miR15或miR16 RNA杂交的探针进行放射自显影检测。对杂交膜曝光的胶片进行光密度扫描可以精确地测量RNA转录水平。另外，还可以通过杂交结果的计算机成像对RNA转录水平进行定量分析，例如用AmershamBiosciences，Piscataway，NJ的the Molecular Dynamics 400-B 2DPhosphorimager。
除了Northern和其它RNA blotting杂交技术，还可以用原位杂交技术检测RNA转录水平。这种技术比Northern blotting技术需要的细胞要少，包括将全细胞沉积在显微镜的盖片上，用含有放射性标记或其它标记的cDNA或cRNA探针的溶液检测细胞的核酸含量。这种技术特别适用于分析来自怀疑患有前列腺癌的患者的生物活组织样品。更详细的原位杂交的操作方法如美国专利序列号5,427,916所述，在此引入其全文作为参考。适用于miR15或miR16 RNA的原位杂交的探针包括SEQ ID NO5和SEQ IDNO6。
miR15或miR16转录物的相对数目还可以通过miR15或miR16转录物的反向转录，然后进行聚合酶链式反应扩增(RT-PCR)来测定。miR15或miR16转录物水平可以与内标相比较定量，例如，相同样品中“持家”基因的mRNA水平。可用作内标的合适的“持家”基因包括肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(G3PDH)。适用于定量RT-PCR的方法以及其它方法是本领域普通技术人员公知的。
测量miR15和miR16表达的其它方法也是本领域技术人员公知的，包括各种测量RNA转录和降解速度的方法。
可以将分离的miR15或miR16基因产物，单独或是组合给予miR15或miR16介导的癌症细胞，从而治疗miR15或miR16介导的癌症。不希望受到任何理论的限制，认为miR15或miR16基因产物能够抑制这些癌细胞的赘生物或肿瘤生长。
特别是，可以将分离的miR15或miR16基因产物单独或是组合给予CLL或前列腺癌细胞，来治疗CLL或前列腺癌。
这里所说的“miR15或miR16介导的癌症细胞”是指从患有miR15或miR16介导的癌症的患者中分离得到的肿瘤或是赘生物细胞。miR15或miR16介导的癌症细胞可以通过检测细胞中miR15或miR16基因产物的减少或缺失，或者通过检测细胞中的癌症或赘生物表型来识别。本领域技术人员可以容易地识别具有癌症或赘生物表型的细胞。例如，培养物中的细胞对于接触诱导的生长抑制不敏感，继续培养的时候聚集在一起。癌症或赘生物细胞还表现出特有的形态学变化，细胞集落无组织生长以及不贴壁生长。癌症或赘生物细胞还具有在易感动物中形成侵入性肿瘤的能力，这可以用本领域的技术通过将细胞注射到无胸腺小鼠中来评价。
这里所说的“分离的”基因产物是通过人为介入使得与其自然状态不同或从其自然状态中分离出来的基因产物。例如，天然存在于活的动物中的RNA不是“分离的”。合成的RNA，或者从其自然状态的共存物中部分或全部分离出来的RNA是“分离的”。分离的RNA可以基本上纯的形式存在，也可以存在于RNA递送到其中的细胞中。因此，递送到细胞中，或者在细胞，例如CLL或前列腺癌细胞中表达的miR15或miR16基因产物认为是“分离的”基因产物。
可以用多种标准方法得到miR15或miR16基因产物。例如，基因产物可以化学合成或者用本领域公知的方法重组产生。优选地，所述RNA产物用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和传统DNA/RNA合成仪化学合成。合成RNA分子或合成试剂的供应商包括Proligo(Hamburg，Germany)，Dharmacon Research(Lafayette，CO，USA)，Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，USA)，Glen Research(Sterling，VA，USA)，ChemGenes(Ashland，MA，USA)和Cruachem(Glasgow，UK)。
另外，miR15和miR16基因产物可以用任何适当的启动子用重组环形或线性DNA质粒表达。用于在质粒中表达RNA的适当启动子包括U6或H1 RNA pol III启动子序列，或巨细胞病毒启动子。本领域技术人员熟知如何选择其它合适的启动子。本发明的重组质粒还可以包括诱导型或调节型启动子，用以在CLL，前列腺癌，或其它细胞中表达miR15和miR16基因产物。
重组质粒表达的miR15和miR16基因产物可以用标准方法从培养的细胞表达系统中分离出来。重组质粒表达的miR15和miR16基因产物还可以递送到CLL或前列腺癌细胞中或直接在其中表达。用重组质粒将miR15和miR16基因产物递送到CLL或前列腺癌细胞中将在下面详细讨论。
miR15和miR16基因产物可以分别在单独的重组质粒中表达，或者也可以在同一个重组质粒中表达。优选地，miR15和miR16基因产物在单个质粒中作为RNA前体分子表达，然后用适当的处理系统将前体分子处理成为功能性miRNA分子。适当的处理系统包括体外果蝇细胞溶出液系统，如Tuschl等的美国公开申请2002/0086356中所述的，在此引入其全文作为参考。
适于表达miR15和miR16基因产物的质粒的选择，向质粒中插入核酸序列并表达基因产物的方法，以及将重组质粒递送到感兴趣细胞中的方法都是本领域技术人员公知的。参见，例如Zenget al.(2002)，Molecular Cell 91327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20446-448；Brummelkamp et al.(2002)，Science 296550-553；Miyagishi et al.(2002)，Nat.Biotechnol.20497-500；Paddison et al.(2002)，Genes Dev.16948-958；Lee et al.(2002)，Nat.Biotechnol.20500-505；和Paul et al.(2002)，Nat.Biotechnol.20505-508，在此引入其全文作为参考。
在优选的实施方案中，用于表达miR15或miR16基因产物的质粒包括处于CMV中早期启动子控制之下的编码miR15或miR16前体RNA的序列。这里所述的“处于启动子控制之下”表示编码miRNA产物的的核酸序列位于该启动子的3’端，使得该启动子可以起始miRNA产物编码序列的转录。
miR15或miR16基因产物还可以用重组病毒载体表达。miR15和miR16基因产物可以用两个单独的重组病毒载体表达，或者可以用同一个病毒载体表达。重组病毒载体表达的RNA可以用标准方法从培养的细胞表达系统中分离出来。或者可以直接在CLL或前列腺癌细胞中表达。使用重组病毒载体将miR15或miR16基因产物递送到CLL或前列腺癌细胞中将在下面详细讨论。
本发明的重组病毒载体包括编码miR15和miR16基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括，例如U6或H1 RNA pol III启动子序列，或巨细胞病毒启动子。本领域技术人员熟知如何选择其它合适的启动子。本发明的重组质粒还可以包括诱导型或调节型启动子，用以在CLL或前列腺癌细胞中表达miR15和miR16基因产物。
可以使用能够接受miR15和miR16基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来自腺病毒(AV)；腺相关病毒(AAV)；逆转录病毒(例如慢病毒(LV)，棒状病毒，鼠白血病毒)；疱疹病毒等的载体。还可以用包被蛋白或其它病毒的其它表面蛋白修饰载体从而改变病毒载体的趋向性。例如，可以用疱疹性口炎病毒(VSV)，狂犬病毒，埃博拉病毒，莫科拉病毒等修饰本发明的AAV载体。适用于本发明的重组病毒载体的选择，向载体中插入核酸序列并表达基因产物的方法，以及将病毒载体递送到感兴趣细胞中的方法都是本领域技术人员公知的。参见，例如，Dornburg(1995)，Gene Therap.2301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therap.15-14；和Anderson(1998)，Nature 39225-30，在此引入其全文作为参考。
优选的病毒载体是来自于AV和AAV的载体。适用于表达本发明的miRNA的AV载体，构建重组AV载体的方法，和将载体递送到靶细胞中的方法，在Xia et al.(2002)，Nat.Biotech.201006-1010中有描述，在此引入其全文作为参考。适于表达本发明的miRNA的AAV载体，构建重组AAV载体的方法，和将载体递送到靶细胞中的方法，在Samulski et al.(1987)，J.Virol.613096-3101；Fisher et al.(1996)，J.Viral.，70520-532；Samulski etal.(1989)，J.Virol.633822-3826；美国专利序列号5,252,479；美国专利序列号5,139,941；国际专利申请WO 94/13788；和国际专利申请WO 93/24641，在此引入其全文作为参考。优选地，miR15和miR16基因产物用含有CMV中早期启动子的单个重组AAV载体表达。
在一个实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包括编码miR15或miR16前体RNA的核酸序列，可操作地与polyT终止序列相连，并处于人U6 RNA启动子的控制之下。这里所述的“可操作地与polyT终止序列相连”是指编码有义链或反义链的核酸序列在5’方向紧邻polyT终止信号。在miR15或miR16序列在载体中转录的过程中，polyT终止信号用于终止转录。
在本发明中，miR15或miR16基因产物用于抑制miR15或miR16介导的癌细胞，特别是CLL或前列腺癌细胞的赘生物或肿瘤生长。不希望受到任何理论的限制，认为处理过的miR15和miR16 miRNA与这些细胞中起始和/或维持赘生物或肿瘤细胞生长所必需的一个或多个靶mRNA中的互补序列相结合。因此，本发明提供了一种在需要这种治疗的患者中治疗miR15或miR16介导的癌症，例如CLL或前列腺癌的方法。所述方法包括给予患者有效量的miR15或miR16基因产物，使得miR15或miR16介导的癌细胞的增殖受到抑制。
如上所述，miR15或miR16介导的癌症是指其中在与该疾病相关的肿瘤或赘生物细胞的至少一部分中miR15或miR16基因中的任何一个或两者都减少或缺失的癌症。在CLL或前列腺癌的肿瘤或赘生物细胞中miR15或miR16基因的表达减少或缺失；因此，CLL和前列腺癌被认为是miR15或miR16介导的癌症。在其它癌症中也发现miR15或miR16基因表达的减少或缺失；这些癌症也被视为是miR15或miR16介导的癌症。
例如，至少在下述组织分型的癌症的初级或转移性肿瘤或赘生物细胞中miR15或miR16基因表达减少或缺失肉瘤(中表层的结缔组织和其他组织癌症)；黑色素瘤(源于黑色素细胞的癌症)；癌(上皮癌症)；腺癌(腺上皮癌症)；神经系统癌症(神经胶质瘤/成胶质细胞瘤和星状细胞瘤)；和血液瘤，例如白血病和淋巴瘤(例如，急性淋巴细胞白血病和慢性骨髓性白血病)。
在来源于至少下述器官或组织的癌症中miR15或miR16基因表达也减少或缺失，不管其组织分型如何乳腺；男性和女性泌尿生殖组织(例如输尿管，膀胱，前列腺，睾丸，卵巢，子宫颈，子宫，阴道)；肺；胃肠系统组织(例如，胃，大肠和小肠，结肠，直肠)；外分泌腺例如胰腺和肾上腺；口腔和食道组织；脑和脊髓；肾(肾脏)；胰腺；肝胆系统(例如，肝，胆囊)；淋巴系统；平滑肌和横纹肌；骨骼和骨髓；皮肤和眼部组织。
在癌症或肿瘤的预后阶段miR15或miR16基因表达也减少或缺失，例如可用“Overall Stage Groupings”(也称为“RomanNumeral”)或“Tumor，Nodes，and Metastases”(TNM)分期系统测量。对于给定癌症的适合的预后分期系统和分期描述是本领域公知的，例如在National Cancer Institute的“CancerNet”国际互联网站上所述的。
需要治疗miR15或miR16介导的癌症的患者可以通过下述方法鉴别从该患者获得肿瘤或赘生物细胞(或者怀疑是肿瘤或赘生物的细胞)样品，测定其中至少一部分细胞与得自该患者正常组织的细胞相比miR15或miR16的表达是否减少或缺失。检测细胞中miR15或miR16基因表达水平的方法是本领域技术人员公知的(如上所述)。另外，得自患者的细胞中的miR15或miR16表达还可以与这些基因在正常人群的细胞中的平均表达水平相比较。医生可以容易地用标准诊断技术鉴别需要治疗CLL的患者。参见，例如″Chronic lymphocytic leukemiarecommendationsfor diagnosis，staging，and response criteria.International Workshopon Chronic Lymphocytic Leukemia，″(1989)Annals of InternalMedicine110(3)236-238，在此引入其全文作为参考。例如，患有CLL的患者具有循环的CLL细胞，表现出淋巴细胞增多(即血液中的淋巴细胞数目等于或大于每立方毫米10,000个细胞)，以及CLL细胞在骨髓和淋巴组织中逐渐积累。
患者血液或其它组织中CLL细胞的鉴定可以通过直接目测观察血液样品，和/或测定淋巴细胞的“CLL分数”来验证。CLL分数表示是否存在CLL细胞的五个淋巴细胞表面标记CD5+，CD23+，FMC7-，和表面免疫球蛋白(SmIg)的微弱表达(+/-)和CD22。该评分系统对这五个标记中的每一个都给出1或0的值，依据是其对CLL是典型的还是非典型的。CLL细胞的CLL分数为4或5，而其它白血病的淋巴细胞的CLL分数为＜1到3。参见Matutes et al.(1994)，Leukemia 8101640-1645 and Moreauet al.(1997)，American Journal of Clinical Pathology，108378-82，在此引入其全文作为参考。CLL细胞与正常外周血B细胞相比膜表面的免疫球蛋白水平较低。淋巴细胞膜表面的免疫球蛋白水平可以容易地用标准方法检测；参见，例如Rozman et al.(1995)，New England Journal of Medicine 3331052-1057，在此引入其全文作为参考。
医生也可以容易地根据标准诊断技术鉴别出需要治疗前列腺癌的患者，所用的标准例如患者年龄，用肛门触诊检查出前列腺增大，前列腺特异的抗原(“PSA”)水平，组织的格里森分数，以及存在在免疫组织化学水平上可检测到的遗传标记，例如前列腺组织细胞上的p53，p21，和细胞周期蛋白。血清PSA水平为20ng/ml或更高并且前列腺组织分化不佳(例如格里森分数为8或更高)表示患有前列腺癌。患者中前列腺肿瘤的存在也可以通过非侵入性的成像技术验证，例如CT扫描，对前列腺的经直肠的超声检查(“TRUSP”)，以及磁共振成像(“MRI”)，这些技术都是本领域公知的。
这里所述的miR15或miR16基因产物的“有效量”是指足以抑制患有miR15或miR16介导的癌症的患者中miR15或miR16介导的癌细胞的量。例如，miR15或miR16基因产物的有效量可以是足以抑制患有CLL的患者中CLL细胞增殖的量，或患有前列腺癌的患者中前列腺癌细胞增殖的量。应当理解，“前列腺肿瘤细胞”不一定存在于前列腺中，而是包括来源于前列腺的转移肿瘤的细胞。
这里所说的“抑制miR15或miR16介导的癌细胞的增殖”是指杀死细胞，或永久性或暂时性地使细胞停止生长。如果在施用了miR15或miR16产物以后患者中的这些细胞保持不变或减少，那么则可以推断出miR15或miR16介导的癌细胞的增殖受到了抑制。如果这些细胞的绝对数量增加，但是肿瘤生长的速度降低了，那么也认为miR15或miR16介导的癌细胞的增殖受到了抑制。
患者体内miR15或miR16介导的癌细胞的数量可以通过直接测量确定，或者从原始或转移肿瘤块的尺寸估计确定。
例如，患者CLL细胞的数目可以容易地确定，例如通过全血或白细胞计数。CLL细胞的数目还可以通过免疫组织化学方法，流式细胞术，或其它用于检测CLL细胞的特征性表面标记容易地测定。
前列腺肿瘤块可以通过直接目测观察，或者通过诊断性成像方法例如X射线，磁共振成像，超声波，和闪烁照相法来测定。用于确定肿瘤块尺寸的诊断性成像方法可以与对照试剂一起使用或者不与其一起使用，如本领域公知的。肿瘤块的尺寸还可以用物理方法测定，例如组织块的触诊或者用测量仪器例如测径器对组织块进行测量。对于前列腺肿瘤，优选的确定肿瘤块尺寸的物理方法是肛门触诊。
本领域技术人员可以容易地确定给特定患者施用的miR15或miR16基因产物的有效量，其是根据下列参数，如患者的个头和体重；疾病的程度；患者的年龄，健康状况和性别；给药方式；以及给药是局部的还是全身性的。
例如，本发明的化合物的有效量可以是基于要治疗的肿瘤块的近似重量。肿瘤块的近似重量可以通过计算肿瘤块的近似体积测定，其中一立方厘米的体积重约一克。基于肿瘤块重量的miR15或miR16基因产物的有效量可以是至少10mg/g肿瘤块，优选是10-500mg/g肿瘤块。更优选地，有效量是至少60mg/g肿瘤块。特别优选的是，有效量是至少100mg/g肿瘤块。优选将基于肿瘤块重量的有效量直接注射到肿瘤中。
miR15或miR16基因产物的有效量可以是基于要治疗的患者的近似或估计体重。优选地，该有效量是肠胃外或肠给药，如下所述。例如，给予患者的miR15或miR16基因产物的有效量是5-3000mg/kg体重，优选是700-1000mg/kg体重，更优选是大于1000mg/kg体重。
本领域技术人员可以容易地确定对给定患者给予miR15或miR16基因产物的合适的给药方案。例如miR15或miR16基因产物可以一次性给予患者(例如单次注射或沉积)。另外，该基因产物还可以每天给予患者一到两次，给药时间持续大约三到大约二十八天，更优选是大约七到大约十天。在优选的给药方案中，miR15或miR16基因产物每天给药一次，持续七天。如果给药方案是多次给药，应当理解给予患者的miR15或miR16基因产物的有效量是在整个给药方案中给予的基因产物的总量。
miR15或miR16基因产物可以通过任何适于将该基因产物递送到患者细胞，例如造血干细胞(HSC)，CLL细胞或前列腺癌细胞中的方式给予患者。例如miR15或miR16基因产物可以用适合于用miR15或miR16基因产物，或者用含有编码miR15或miR16基因产物的序列的核酸转染患者细胞的方式给药。细胞可以直接用miR15或miR16基因产物(当其是核酸的时候)转染，或者可以用含有编码miR15或miR16基因产物的序列的核酸转染。优选地，细胞用含有编码miR15或miR16基因产物的序列的质粒或病毒载体转染，如上所述。
真核细胞的转染方法是本领域公知的，包括将核酸直接注射到细胞核或细胞原核中；电穿孔；脂质体转化或者由亲脂性物质介导的转化；受体介导的核酸递送，生物弹或粒子加速；磷酸钙沉淀，病毒载体介导的转染。
例如，细胞可以用脂质体转化化合物，例如DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基-甲硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或其等同物例如LIPOFECTIN转染。所使用的核酸的量对于本发明的实施并不重要；用0.1-100mg核酸/105个细胞都能得到满意的结果。例如，使用的量可以是每105个细胞3mg DOTAP，其中含有0.5mg质粒载体。
在一个实施方案中，从患者中分离出miR15或miR16介导的癌细胞，例如CLL或前列腺癌，用编码miR15或miR16基因产物的核酸转染，并重新植入患者中。在优选的实施方案中，转染的和重新植入的细胞是CLL细胞。在更优选的实施方案中，转染的和重新植入的细胞是诊断为CLL的患者的HSC。
从患者中提取CLL细胞的技术是本领域公知的，例如下述实施例7中所述的。从患者中提取、鉴别、分离和培养HSC的技术也是本领域公知的，例如美国专利序列号5,635,387和5,643,741，以及Campana et al.(1995)Blood 851416-1434中所述的，在此引入其全文作为参考。优选地，在转染HSC之前从收集的骨髓中提取出肿瘤或赘生物细胞。合适的提取技术包括，例如固定化外周血细胞的白细胞去除，基于免疫亲和的选择或杀死肿瘤细胞，或者使用细胞毒性或者光敏试剂选择性地杀死肿瘤细胞，都是本领域公知的。参见，例如，Bone Marrow Processing andPurging，Part 5(A.Gee，ed.)，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1991；Lydaki et al.(1996)J.Photochem.and Photobiol.3227-32；和Gazitt et al.(1995)，Blood，86381-389，在此引入其全文作为参考。
分离的CLL细胞或HSC可以用任何适当的技术转染，如上所述。转染之后检查一部分CLL细胞或HSC以验证所述基因产物是否具有适当的表达水平。一旦验证了miR15或miR16基因产物具有适当的表达，就将其余的转染细胞重新引入到患者中。转染的CLL细胞或HSC可以通过肠胃外方法重新引入到患者中，包括静脉输注或向骨髓中直接注射。转染细胞优选以盐溶液或其它药学可接收的载体重新引入患者。重新引入的转染细胞的合适的数量是每kg患者体重大约105到大约108个细胞。在转染之前可在培养基中扩张细胞从而增加可用于重新引入的转染细胞的数量。
优选地，CLL细胞或HSC用含有编码miR15或miR16基因产物的序列的核酸，例如能稳定整合到CLL细胞或HSC基因组中以长期表达该化合物的质粒表达载体转染。稳定的整合和表达可以用本领域公知的技术验证，例如用miR15或miR16 cDNA(或其片段)作为探针对基因组DNA进行Southern blot。miR15或miR16基因产物的表达还可以用标准Northern blot技术来检测。用编码miR15或miR16基因产物的序列稳定转染的CLL细胞或HSC在重新植入患者中以后会继续表达该化合物。从患者中分离HSC，用表达miR15或miR16基因产物的质粒转染，并将转染的HSC重新植入到患者中的示例性方法如下述实施例8所示。
miR15或miR16基因产物还可以通过任何适当的肠或肠胃外给药方式给予患者。适用于本发明的适当的肠给药方式包括口服，直肠，或鼻内递送。适当的肠胃外给药方式包括血管内给药(例如静脉高剂量注射，静脉输注，动脉内高剂量注射，动脉内输注和经导管输注到脉管系统中)；组织外和组织内注射(例如肿瘤外和肿瘤内注射，视网膜内注射，或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如渗透泵)；直接应用到感兴趣的组织上，例如通过导管或其它放置装置(例如视网膜颗粒或栓剂或含有多孔，无孔，或胶状物质的植入物)；以及吸入。优选地，miR15或miR16基因产物通过注射或输注给药。对于miR15或miR16介导的含有肿瘤块的癌症，优选miR15或miR16基因产物通过直接注射到肿瘤中给药。
在本文的方法中，miR15或miR16基因产物可以作为裸露的RNA，或者和递送试剂一起，或者作为含有能表达该基因产物的序列的核酸(例如重组质粒或病毒载体)给药。适用于miR15或miR16基因产物给药的合适的递送试剂包括Mirus TransitTKO亲脂性试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin；或聚阳离子(例如聚赖氨酸)，或脂质体。
含有能表达miR15或miR16基因产物的序列的重组质粒如上所述。含有能表达miR15或miR16基因产物的序列的重组病毒载体也如上所述，将这些载体递送到患者的CLL或前列腺癌细胞中的方法是本领域技术人员公知的。
在优选的实施方案中，脂质体可用于将miR15或miR16基因产物，或含有编码该基因产物的序列的核酸递送到患者中。脂质体还可以增加该基因产物或核酸在血液中的半衰期。在本发明的该实施方案的实践中，所述的miR15或miR16基因产物，或含有编码该基因产物的序列的核酸可以在给患者施用之前装入到脂质体中。
适用于本发明的脂质体可以用标准的可形成载体的脂类制备，通常包括中性的或具有负电荷的磷脂和甾醇例如胆固醇。脂类的选择通常可以依据各种因素例如所希望的脂质体大小和脂质体在血管中的半衰期。已知多种制备脂质体的方法，例如Szokaet al.(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467；和美国专利序列号4,235,871，4,501,728，4,837,028，和5,019,369中所述的，在此引入其全文作为参考。
包含有miR15或miR16基因产物，或含有编码该基因产物的序列的核酸的脂质体可以包含能够将所述脂质体靶定到miR15或miR16介导的癌细胞，例如CLL或前列腺癌细胞上的配体分子。在这些癌细胞中普遍能与受体结合的配体，例如能与肿瘤细胞抗原或CLL细胞表面标记的单克隆抗体是优选的。
还可以对包含有miR15或miR16基因产物，或含有编码该基因产物的序列的核酸的脂质体进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮组织系统(“RES”)清除。这种修饰的脂质体的表面上或其脂质体结构中具有调理作用抑制分子。在特定的优选的实施方案中，本发明的脂质体可以同时包含调理作用抑制分子和配体。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制分子典型地是能与脂质体膜结合的大分子的亲水性聚合物。这里所述的调理作用抑制分子与脂质体膜“结合”是指其与膜发生化学或物理连接，例如脂溶性锚定物插入到膜中，或者直接与膜脂的活性基团结合。这些调理作用抑制亲水性聚合物形成具有保护作用的表面层，能显著减少脂质体被MMS和RES吸收，例如美国专利序列号4,920,016中所述的，在此引入其全文作为参考。
适用于修饰脂质体的调理作用抑制分子优选是水溶性聚合物，其平均分子量是大约500到大约40,000Da，更优选是大约2,000到大约20,000Da。这种聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧PET或PPG，以及PET或PPG硬脂酸盐；合成聚合物例如聚丙烯酰胺或聚N-聚乙烯吡咯烷酮；直链，枝链和分枝聚酰胺基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如聚乙烯醇和聚木糖醇，其中羧基和氨基以化学方法连接，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GM1。也可以使用PEG，甲氧PEG，或甲氧PPG，或其衍生物的共聚物。此外，调理作用抑制聚合物可以是PEG和聚氨基酸，多聚糖，聚酰胺，聚乙烯胺，或聚核苷酸中的任一个的嵌段共聚物。所述调理作用抑制聚合物还可以是天然的含有氨基酸或羧酸，例如半乳糖醛酸，葡萄糖醛酸，甘露糖醛酸，透明质酸，果胶酸，神经氨酸，褐藻酸，角叉胶的多糖；胺化多糖或寡糖(直链或枝链)；或羧化多糖或寡糖，例如可与碳酸衍生物反应最终连接羧基基团。优选地，所述调理作用抑制分子是PEG，PPG，或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时被称为“PEG化的脂质体”。
调理作用抑制分子可以通过多种已知方法与脂质体膜结合。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯可与磷脂酰乙醇胺的脂溶性锚定物相结合，然后结合到膜上。类似地，右旋糖苷聚合物可以与十八胺脂溶性锚定物通过用Na(CN)BH和溶剂混合物如3012的四氢呋喃水在60℃进行的还原性胺化作用来衍生化。
用调理作用抑制分子修饰的脂质体在循环系统中保留的时间比未修饰的脂质体长。鉴于此原因，这些脂质体有时称为“隐形”脂质体。隐形脂质体已知可在由多孔的或“有渗漏的”微脉管系统反馈的组织中积累。因此，具有微脉管系统毛病的组织，例如肿瘤块，可有效积累这些脂质体；参见Gabizon，et al.(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，186949-53。此外，RES吸收的减少由于阻止了该脂质体在肝和脾中的积累从而降低了隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制分子修饰的脂质体适用于将miR15或miR16基因产物，或含有编码该基因产物的序列的核酸递送到肿瘤细胞中。
miR15或miR16基因产物优选在给患者施用之前根据本领域公知的技术制成药物组合物。本发明的药物组合物至少是无菌的和不含热源的。这里所说的“药物制剂”包括用于人的和兽医使用的制剂。制备本发明的药物组合物的方法是本领域技术人员公知的，例如Remington′s Pharmaceutical Science，17th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pa.(1985)中所述的，在此引入其全文作为参考。
本发明的药物制剂含有miR15或miR16基因产物，或含有编码该基因产物的序列的核酸(例如按重量计0.1到90％)，或其生理学可接收的盐，并与药学可接收的载体相混和。本发明的药物制剂还可以包括包含在脂质体中的miR15或miR16基因产物，或含有编码该基因产物的序列的核酸，以及药学可接收的载体。
优选药学可接收的载体是水，缓冲液，生理盐水，0.4％盐水，0.3％甘氨酸，透明质酸等。
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包括能抵抗核酸酶降解的miR15或miR16基因产物。本领域技术人员可以容易地合成具有核酸酶抗性的miR15和miR16基因产物，例如在miR15和miR16基因产物的2’位置加入一种或多种核糖核苷酸。合适的2’修饰的核糖核苷酸包括在2’位置具有氟，氨基，烷基，烷氧基，和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。
例如，本发明的药物组合物含有加入了一个或多个具有2′AR-核苷酸的通式的2’修饰的核糖核苷酸的miR15或miR16基因产物，其中A是氧或卤素(优选氟，氯或溴)；以及R是氢或直链或枝链C1-6烷基；其中当A是卤素的时候，没有X和R。优选的修饰的2-核糖核苷酸是2’-O甲基核糖核苷酸。优选地，本发明的药物组合物包括其中每个核糖核苷酸都是2’-修饰的核糖核苷酸的miR15或miR16基因产物。
本发明的药物组合物还可以包括传统的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂，抗氧化剂，调节摩尔渗透压浓度的试剂，缓冲液，和pH调节试剂。合适的添加剂包括生理学的生物相容的缓冲液(例如盐酸缓血酸胺)，加入螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺)或者钙螯合复合物(例如DTPA钙，CaNaDTPA-双酰胺)，或者，可选择地，加入钙盐或钠盐(例如，氯化钙，抗坏血酸钙，葡萄糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以以液体形式使用，也可以以冻干形式使用。
对于本发明的固体药物组合物，可以使用传统的无毒的固体的药学可接收的载体；例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等。
例如，用于口服给药的固体药物组合物可以含有上述的任何载体以及10-95％，优选25％-75％的miR15或miR16基因产物。用于喷雾(吸入)给药的药物组合物可以含有按重量计0.01-20％，优选按重量计1％-10％的包含于上述脂质体中的miR15或miR16基因产物，和推进剂。还可以包含其它载体；例如用于鼻内递送的卵磷脂。
下述非限制性实施例将对本发明作出说明。
实施例在实施例中使用下述方法患者样品和细胞系-患者样品是在得到了被CLL ResearchConsortium institutions诊断为CLL的患者的知情同意后获取的。简短来说，外周血是从CLL患者中获得的，单核细胞是通过Ficoll-Hypaque梯度离心(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)分离的，然后进行处理以便按标准方法提取RNA和DNA，如Sambrook J et al.(1989)，Molecular cloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)中所述的，在此引入其全文作为参考。将相应患者的口腔粘膜DNA放置在小片(1-2mm2)纸上，作为LOH研究中的正常对照。
三十个人的细胞系是得自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)并根据ATCC的说明培养。这些细胞系是AS283，BL2，Bla，BJAB，CA46，Namalva，P3HRI，PAPB 682，PABm，Raji(Burkitt′s淋巴瘤)，Dell，SKDHL，ST486(T-细胞淋巴瘤)，JM(免疫母细胞B细胞淋巴瘤)，MC116(未分化的淋巴瘤)，Molt3，Supt 11(T-ALL)，U266(多发性骨髓瘤)，A549，H1299(肺癌)，TE2，TE10(食道癌)，HeLa(子宫颈癌)，RC48(肾癌)和2220，2221，11609，11611，LNCAP，TSUR(前列腺癌)。
CD5+B-细胞的分离一从儿科组(3-9岁)通过常规的扁桃腺切除术获得扁桃腺。用唾液酸苷酶处理过的绵羊红血球使单核细胞散开，得到纯化的B细胞。将B细胞用不连续Percoll梯度(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进一步分级，如Dono M etal.(2000)，J.Immunol.1645596-5604中所述，在此引入其全文作为参考。从50％的Percoll级分中收集B细胞，并与抗CD5 mAb一起培育，然后与和微磁珠结合的羊抗鼠Ig一起培育。收集细胞并置于磁性柱MS上，用MiniMACS系统(Miltenyi Biotec)通过正选择获得CD5+B细胞。
体细胞杂交-用传统方法进行体细胞杂交，在次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷(HAT)介质上选择，如Negrini M et al.(1994)，CancerRes.541818-1824中所述的，在此引入其全文作为参考。从单个细胞克隆和亚克隆中得到的DNA用DNeasy组织试剂盒(Qiagen)分离并用PCR检测是否存在染色体13和染色体2标记(引物序列见下述表1)。从一种带有t(2；13)(q32；q14)移位的CLL细胞(CLL-B)中分离得到十五个克隆，从另一种带有t(2；13)(q12；q13)移位的CLL细胞(CLL-A)中分离得到一个克隆。十二个来自CLL-B的克隆带有染色体13和2的完全互补序列，另外三个带有del(13q)和染色体2的完全互补序列。来自CLL-A的一个克隆含有在13q14位置具有染色体13的小缺失并且不含部分染色体2。
Northern blotting-用Tri Reagent方法(Molecular ResearchCenter，Inc)分离总RNA。将RNA样品(每个30g)在15％丙烯酰胺变形(脲)Criterion预制凝胶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上分离并转移到Hybond-N+膜(AmershamPharmacia Biotech)上。在42℃在7％SDS，0.2M Na2PO4pH7.0的条件下与-32P ATP杂交过夜。在42℃将膜用2x SSPE，0.1％SDS洗涤两次，用0.5x SSPE，0.1％SDS洗涤两次。用于检测miR15和miR16 RNA的探针分别是CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQ ID NO5)GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQ ID NO6)在0.1％SDS水溶液/0.1x SSC中煮沸10分钟剥离杂交膜并重新杂交几次。用溴化乙锭染色的5S rRNA作为对照。
反向转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)-通过RT-PCR分析正常CD5+细胞和23个B-CLL样品中的基因表达水平。用Advantage2 PCR试剂盒(Clontech)每次扩增反应用一微升cDNA，每种基因特异性引物10pmol进行35次循环，94℃20秒，65℃30秒，68℃1分钟(引物列表见下述表1)。为了保证RT-PCR中使用的RNA具有足够的纯度，用G3PDH cDNA(Clontech，PaloAlto，CA)特异的引物进行PCR检测。用上述Sambrook J et al.(1989)中的标准方法用琼脂糖凝胶电泳分离RT-PCR产物。
Western blotting-对9个B-CLL患者的细胞溶解物的SDS/PAGE凝胶产物用GST-SLUG Middle抗体(Dr.Thomas Look-Harvard，MA赠与)和SNX2(N17)抗体(Santa Cruz Biotechnology，CA)检测。用ECL Western Blotting检测试剂盒(AmershamPharmacia，UK)进行检测，根据制造商的说明操作。
数据库分析-用由National Institutes of Health and theNational Library of Medicine维护的National Center forBiotechnology Information网站提供的BLAST排列工具搜索“nr”和“dbEST”数据库，搜索短的几乎完全匹配的序列。还可参见Altschul et al.(1990)，J.Mol.Biol.215403-10和Altschul et al.(1997)，Nucleic Acids Res.2533 89-3402，在此引入其全文作为参考。也可以用Biology workBench网站提供的FASTA排列工具搜索短序列的同源序列。
表1-用于检测体细胞杂交株的引物名称 引物序列SEQIDNOD2S396LATA CAC CTC TAA ATA TCT GTT CCA G 7D2S396RAAG TAG GAC CAT TCT AAT AGC C 8D2S112LGAG TGG CGG TGA GAA GGT AT 9D2S112RAGC CAT TGCTAT CTT TGA GG 10D2S2243L TGG GAT ATG CTT CAG GGA C 11D2S2243R AGC TGA CCT TGG AAT CTG GTT 12D13S260L AGA TAT TGT CTC CGT TCC ATG A 13D13S260R CCC AGA TAT AAGl GAC CTG GCT A 14D13S263L CCT GGC CTG TTA GTT TTT ATT GTT A 15D13S263R CCC AGT CTT GGG TAT GTT TTT A 16D13S165L GTT TCG CCAAGC CTG TT 17D13S165R GTT GAC AAT AAA ATA CGC CAC A 18D13S273L CTG NGG CAA AAA CAA CTC TT 19D13S273R ATC TGT ATG TCC TCC TTT CAA TG 20D13S1168L AAC CTC ATT TAA ATG TAA AGC ATC A 21D13S1168R GTAATG TCA TTG CTT TTG ATT TGC 22D13S1150L CTC TTG AGG GAA AAA AAA AAT CA 23D13S1150R CCA GGC AAC CAA CCA GTC 24D13S272L ATA CAG ACT TCC CAG TGG CT 25
D13S272R AGC TAT TAA AGT TCC CTG GAT AAA T 26GCT16C05LAAG GAA TCA GAG AAA TGG GG 27GCT16CO5RGCT GAG TCA GAG GGA TTT GA 28D13S25FORAGA GGT AAA CAA ACC AAA CCC 29D13S25REVGCT GAC AAT CAA GAG AAG ATG 30D13S284L AAA ATC AGG TGG AAA CAG AAT 31D13S284R AAA GGC TAA CAT CGA AGG GA 3201ALU18 CAG AAC CAG AGA AAC AGC 3302ALU18 ATG GCA CAA CAG CTT AAC 34AFMA301WB5 GAA TGC AGG TGT ACC TAT CAA C 35AFMA301WB5 ACT GAG TGA CTG CTA CCC AG 36D13S272L1AGC TAG CCC TAT CAG GGT 37D13S272R1GTA AGT GGA GGT TAC CTG 385279FGAA TCA TTC GTG CTA AGT GGA T 395451RTGC CAA CTG CTT GAA GAA TCT C 407130FACA CCT AAC TCC TGG GTT GTT C 417371RACT AAA TGC CAG CGT TTG CAT G 429530FGGT CTT ACT CTG GTT AAA TCT 439757RCAT TGG TAG CTA AGG AAA CAC 4411521F CCA TTC AAG CCT GGA CAA TCT T 4511802R GAA ACT TGA GAC AAT AAG GAG C 4612440F CAT GTA ACC AAG ATA AAT CCG T 4712558R CTG GAA AAT GTA TGT GAT GAG G 4817261F CTG TTG CTA TCT GTA ATA ACA C 4917494R CTT GGA ATT TTC CAC TGA ATC 50
18701RTCA TCA GAA GAA ATC AAG GCA G 5118560FCAG TGT TAG GAA TAC GCA TTC A 52GSP2F4CCT TGC CAG TAC GCC CAC AAG CTG53GSP1R1CCC CAC CTA TGG TTG TAG TGA GCA54TCC实施例1-CLL患者的体细胞杂交株中的一段30kb的缺失区域至今还没有确定CLL患者13q14处丢失的最小区域。已经描述了CLL中13q14处缺失的多种以及相对较大的(在130到550kb)区域(参见图2B)。用LOH和Southern blot分析鉴别Alu18位点纯合子丢失的着丝粒边界，该位点位于D13S1150和D13S272之间小于65kb着丝粒到LEU2基因的外显子5处。但是，没有发现能使靶肿瘤抑制子定位的小的或重叠的纯合子缺失。
为了更好的定义CLL中的丢失区域，制备鼠LM-TK-的体细胞杂交株和带有13q14移位和/或缺失的CLL细胞。对得到的杂交克隆的PCR检测可以分开肿瘤中存在的染色体13的两个拷贝。用这种方法可以识别一种细胞中的31.4kb的缺失，以及另一种细胞中染色体断点的精确定位(图2D)。这些结果表明13q14肿瘤抑制基因位于LEU2基因的外显子2和5之间的29kb的区域中。用于检测体细胞杂交株的引物如表1所示。
如图2所示，体细胞杂交株中缺失的区域与所有已报道的丢失区域相同，包括几年前由Liu et al.(1997)Oncogene 152463-2473报道的10kb的区域。LEU2的外显子1和2也在此区域内，并且也在本文所定义的区域内。但是LEU2并不是B-CLL的可能的候选肿瘤抑制子基因(参见Bullrich et al.(2001)，CancerRes.616640-6648；Migliazza et al.(2001)，Blood 972098-2104；Wolf et al.(2001)，Hum.Mol.Genet.101275-1285；和Mertens etal.(2002)Blood 994116-4121)实施例2-miR15和miR16基因位于染色体13的最小缺失区域内，并且在CD5+细胞中高表达在已公开可用的序列信息和数据库中筛选13q14处的最小丢失区域中的新的调控基因。最近被克隆的两个miRNA基因簇，miR15和miR16正是位于该缺失区域内(图2A)。为了评价miR15和miR16在正常组织中的表达水平，对一组正常组织，包括分离自正常个体的扁桃腺的CD5+B细胞进行miR15和miR16 RNA的Northern blot分析(图3A)。用CD5+B细胞做对照，这是因为B-CLL具有逐渐积累CD5+B淋巴细胞的特性。发现普遍存在miR15和miR16基因的表达，并且在正常CD5+淋巴细胞中表达量最高。此外，在正常组织中miR16始终比miR15表达水平高。这些数据表明miR15和miR16基因在正常CD5+B细胞的动态平衡中具有重要作用。
实施例3-在13q14缺失的CLL样品中miR15和miR16基因常常缺失或受到负调控为了研究miR15和miR16基因是否与CLL的发病有关，用Northern blotting分析了60个CLL样品和30个人癌细胞系的miR15和miR16基因表达(图3A)。CLL患者中的68％(41/60)，以及分析的6个前列腺癌细胞系中的5个与其正常组织对应物相比显示出表达显著减少。这些发明证明miR15和miR16基因在所检测的大部分B-CLL和前列腺癌细胞中受到负调控。
此外，60个CLL样品中的23个(38％)显示出明显可识别的代表miR15前体RNA的大约70nt的条带。而除了骨髓之外的任何所分析的正常组织中都没有发现70nt的miR15条带(图3A)，这表明CLL细胞对miR15前体RNA的处理效率较低。
为了确定所观察到的表达的负调控是否与CLL的等位基因缺失有关，用微卫星标记D13S272和D13S273对46个CLL患者进行了LOH研究，从这些患者可以获得正常DNA(图3B)。我们发现有义样品的68％都在至少一个标记中表现出LOH(35个中的24个)。在除了4个样品以外的所有样品(75％)中miR15/16基因产物的表达都有所减少。有12个样品由于起始物质的问题不能得到可重复的结果。此外，在没有明显LOH的11个样品中的6个(55％)中表达水平也有所减少。在这些实验中，可能由于缺失片段太小而不能被所用的标记检测到。
Northern blot分析表明在在13q14处具有已知的较大纯合子缺失的细胞和少于5％的正常细胞中都表达miR15和miR16基因产物，表明在基因组中存在其它高度类似的小分子RNA基因。实际上，已有报道有一个与miR15/miR16基因簇非常类似的基因簇位于染色体3q25-26.1处(参见Lagos-Quintana et al.(2002)，Curr.Biol.12735-739)。为了表明miR15/16基因表达的变化确实与染色体13q的缺失有关，设计了对染色体13上的miR16前体RNA特异的和对染色体3上的基因产生的miRNA前体RNA特异的探针，用于进行Northern blot。
染色体13的miR16前体RNA只检测到很低的水平，在相同样品中用染色体3探针却没有发生特异性的杂交。此外，用两个跨越位于该基因簇着丝粒的2Mb区域的微卫星标记进行LOH研究。17个有义样品中的4个在至少一个标记中显示出了LOH，并且没有发现其与miR15/16的表达水平之间的关系。这些数据明显证明CLL中miR15和miR16基因表达的负调控与13q14处的等位基因丢失相关，表明miR15和miR16基因产物在CLL的发病中具有重要作用。
实施例4-在小鼠中miR15和miR16也与CLL发病有关为了进一步研究miR15和miR16基因是否与CLL发病有关，继续用患有CLL的E-TCL1转基因小鼠进行研究(Bichi et al.，(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99106955-6960)。检测E-TCL1转基因小鼠中细胞和基因的变化。如上所述进行Northern blot分析(参见实施例-“Northern blotting”，和实施例3)。
在大约80％的转基因小鼠中，与正常鼠脾淋巴细胞相比，CLL细胞中miR15和miR16的鼠同系物都有所降低。这些结果与实施例3中所述的人CLL与正常人细胞相比较的结果一致。
还将小鼠染色体15和人染色体12进行了比较。转基因小鼠的白血病的比较基因杂交(CGH)显示出大约35％扩增出了小鼠染色体15的一个区域，相应于人染色体12的区域。这些小鼠白血病的细胞分析也表明小鼠染色体15具有三倍体性或四倍体性。已知大约有25％的人CLL的染色体12具有三倍体性。
比较基因杂交还显示了小鼠染色体14(51.6-78.5Mb)具有丢失的区域，相应于人的13q14区域。
这些研究结果表明CLL小鼠模型重现了人CLL发病中发生的事件。综合来说，实施例1-4的数据表明在哺乳动物中miR15和miR16在CLL发病中具有重要作用。
实施例5-突变分析没有显示出在CLL和胃肠癌中miR15和miR16基因具有点突变为了进一步评价miR15和miR16基因在CLL中的作用，用对PCR扩增产物直接测序的方法检测了120个B-CLL以及80个结肠直肠癌和胃癌中是否具有突变。扩增了含有全部基因簇的720 bp的染色体区域。在这三种情况下，发现miR16前体RNA具有同样的变化；在位点2具有T到C的置换。这种变化不会改变miRNA的发夹结构。还发现了几种非遗传性的多肽性。由于miR16基因较小(70bp)，miR16基因仅具有极少的突变并不令人惊讶。
为了识别在显示出LOH的CLL中其余的等位基因失活的可能机制，用“in silico”克隆鉴别位于miR16基因下游大约215bp的可能的启动子区域。已报道有几种癌相关基因具有启动子高度甲基化反应的负调控，包括p16INK4a，p73，hMLH1，或VHL(参见Esteller(2002)，Oncogene 215427-5440)。因此使用甲基化特异的PCR分析位于可能的miR16启动子的5’的一个富含CpG区域的甲基化状态。在十个CLL样品中，与miR15或miR16基因表达的水平(八个表达减少，两个具有高表达)无关，在任何所分析的CpG位点都没有检测到甲基化模式的差别。但是，也不能排除甲基化特异的PCR没有检测到CpG位点的不同区域或较小区域的甲基化。
实施例6-miR15和miR16基因产物在人细胞中的表达将编码全长70个核苷酸的miR15和miR16 RNA前体的cDNA序列分别克隆到无关的mRNA中，该mRNA处于巨细胞立即早期(CMV-IE)启动子的控制之下，根据Zeng et al.(2002)，Mol.Cell 91327-1333中所述的方法操作，在此引入其全文作为参考。
简短来说，将Xho I连接子置于编码miR15和miR16 RNA前体的双链cDNA序列的末端，并将这些构建体分别克隆到pBC12/CMV质粒的Xho I位点。pBC12/CMV质粒如Cullen，(1986)，Cell 46973-982所述，在此引入其全文作为参考。含有miR15前体RNA序列的所述质粒称为pCMV-miR15，含有miR16前体RNA序列的所述质粒称为pCMV-miR16。
用FuGene 6试剂(Roche)用标准方法将pCMV-miR15和pCMV-miR16分别转染培养的人293T细胞。如上所述提取总RNA，用miR15和miR16特异的探针用Northern blot分析检测是否存在处理过的miR15或miR16 RNA。
再使pCMV-miR15和pCMV-miR16分别转染培养的人前列腺癌细胞系2220，2221，11609，11611，LNCAP，TSUR。如上所述提取总RNA，用miR15和miR16特异的探针用Northern blot分析检测前列腺癌细胞中是否存在处理过的miR15或miR16RNA。同时评估转染的前列腺癌细胞在形态上的变化，克服接触抑制的能力，以及能指示转化表型的其它标记。
实施例7-用miR15和miR16基因产物转染CLL细胞从诊断患有CLL的患者中分离CLL细胞，如下所述用编码miR15和miR16小分子RNA的质粒转染。
如上所述分离CD5+B细胞，用目测观察或者通过用Matuteset al.(1994)，Leukemia 8(10)1640-1645的评分系统测定CLL分数来鉴别CLL细胞，在此引入其全文作为参考。CLL分数至少为4的CD5+B细胞视为是CLL细胞。证实了在分离的CLL细胞中具有13q14区域的缺失，从而除去了miR15/miR16基因簇。
通过标准方法用pCMV-miR15和pCMV-miR16转染分离的CLL细胞。如上所述提取总RNA，用miR15和miR16特异的探针用Northern blot分析检测是否存在处理过的miR15或miR16RNA。用miR15和miR16基因序列特异的探针进行Southern blot杂交也证实了miR15和miR16基因的稳定整合。
实施例8-用miR15和miR16基因产物转染造血干细胞如下所述从诊断为CLL的患者的骨髓中获得造血干细胞(HSC)。
在手术室用标准方法在常规麻醉状态下在从患者的髂骨中收集骨髓。用肝素化注射器进行多次抽吸，得到总量为大约750到1000ml的骨髓。将抽出的骨髓立刻转移到运送介质(TC-199，Gibco，Grand Island，New York)中，每100ml该介质含有10,000单位的不含防腐剂的肝素。将抽出的骨髓通过三次逐渐精细的分筛过滤得到不含细胞聚集物，细胞碎片和骨骼颗粒的细胞悬液。然后将过滤得到的骨髓进一步用自动细胞分离器(例如Cobe2991 Cell Processor)得到“血沉棕黄层”(即不含红细胞和血小板的白细胞)。
如下所述用免疫磁珠(Dynal A.S.，Oslo，Norway)进行CD34+细胞的正选择使血沉棕黄层制备物部分富集造血干细胞(HSC)。将血沉棕黄层制备物重悬于加入添加物的介质中，并与小鼠抗HPCA-I抗体以1∶20的稀释比率共培育，在4℃轻轻颠倒试管45分钟。用加入添加物的介质洗涤细胞三次，然后与包覆有羊抗鼠IgG1(75 1免疫珠/107CD34+细胞)的Fc片段的微珠共培育。在4℃培育45分钟以后，用磁性微粒集中器对粘附在微珠上的细胞进行正选择，根据制造商的说明书操作。
将富集HSC的制备物中的2×104个细胞在5ml聚丙烯管(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中的含有2％人AB血清和10mM Hepes缓冲液的总体积为0.4ml的Iscove′s修改的Dulbecco′s培养基(IMDM)中培育，并用标准方法用pCMV-miR15和pCMV-miR16转染。用一部分转染的HSC通过Northern blot分析证实其中表达miR15或miR16 RNA，用一部分HSC通过Southern blot分析证实其中稳定整合了miR15或miR16基因序列。将其余的转染细胞以大约4×108/kg体重到大约8×108/kg体重的比率用标准骨髓移植方法重新植入到患者体内。
重复该实验，除了用在转染和重新移植之前用电离辐射除去骨髓中的赘生物细胞，如下所述。调整血沉棕黄层制备物中的细胞至细胞浓度为在含有大约20％的自体血浆的TC-199中是2×107/ml。向细胞悬液中加入重组人造血生长因子rH IL-3或rHGM-CSF以刺激造血赘生物的生长，从而增加其对电离辐射的敏感性。然后将这些细胞暴露于5-10Gy的电离辐射中，在4℃用含有大约20％的自体血浆的TC-199洗涤一次，然后如上所述用pCMV-miR15和pCMV-miR16转染。
实施例9-含有miR15或miR16的脂质体的制备脂质体的制备1-由乳酰脑苷酯，磷脂酰甘油，卵磷脂和胆固醇以摩尔比率1∶1∶4∶5组成的脂质体通过美国专利序列号4,235,871中所述的反相蒸发方法制备，在此引入其全文作为参考。在100g/ml的处理的miR15或miR16 RNA或500g/ml的pCMV-miR15或pCMV-miR16水溶液中制备脂质体，因此制备得到的脂质体含处理的miR15或miR16 RNA，或pCMV-miR15或pCMV-miR16质粒。
然后将脂质体通过0.4聚碳酸酯膜，重悬于盐水中，用135mM氯化钠，10mM磷酸钠pH7.4通过柱层析与未包覆的物质分离开来。所述脂质体无需修饰即可进一步使用，或者如下所述进行修饰。
将一些如上所述制备的脂质体加入到适当的反应容器中，并边搅拌边加入含有20mM偏高碘酸钠，135mM氯化钠和10mM磷酸钠(pH7.4)的溶液。将得到的混合物在黑暗中在温度为大约20℃的条件下放置90分钟。将反应混合物用250ml盐水缓冲液(135mM氯化钠，10mM磷酸钠，pH7.4)透析2小时除去过量的高碘酸盐。得到的产品是表面碳水化合物的羟基被氧化成乙醛基的脂质体。目标基团或调理作用抑制分子可以通过这些乙醛基团与脂质体表面结合。
脂质体的制备2-如下所述制备由马来酰亚胺苯甲酰-磷脂酰乙醇胺(MBPE)，卵磷脂和胆固醇组成的第二种脂质体。MBPE是能使含有巯基的化合物，包括蛋白质与脂质体偶合的活性磷脂。
将十四酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)(100mmol)溶解于含有2当量的三乙胺和50mg m-马来酰亚胺苯甲酰N-羟基琥珀酰亚胺酯的5ml无水甲醇中，如Kitagawa et al.(1976)，J.Biochem.79233-236中所述，在此引入其全文作为参考。在氮气气氛下在室温继续反应过夜，然后用氯仿/甲醇/水(65/25/4)在硅胶H上进行薄层层析，这可以定量显示出DMPE向更快的迁移产物的转变。减压除去甲醇，将产物重新溶于氯仿中。用1％氯化钠提取氯仿相两次，用氯仿/甲醇(4/1)作为溶剂用硅酸层析纯化马来酰亚胺苯甲酰-磷脂酰乙醇胺(MBPE)。纯化以后，薄层层析指示出含有茚三酮阴性斑点的纯磷酸盐。
在100g/ml处理的miR15或miR16 RNA水溶液或500g/ml pCMV-miR15或pCMV-miR16溶液中，用上述美国专利序列号4,235,871中的反相蒸发方法制备由MBPE，卵磷脂和胆固醇以摩尔比为1∶9∶8组成的脂质体。用100mM氯化钠-2mM磷酸钠(pH6.0)通过柱层析使脂质体与未包覆的物质分离开来。
实施例10-使抗CD5+或抗前列腺肿瘤抗体与含有miR15或miR16的脂质体结合将1.1ml(含有大约10mmol)的带有活性乙醛基团的脂质体制备物1，或上述脂质体制备物2装入适当的容器中。向该制备物中边搅拌边加入0.2ml的200mM氰硼氢钠溶液和1.0ml的3mg/ml的直接针对CD5+细胞表面标记或前列腺肿瘤细胞抗原的单克隆抗体溶液。在室温继续反应过夜。将得到的混合物在BiogelA5M琼脂糖柱(Biorad，Richmond，Ca.；1.5×37cm)上分离。
实施例11-在体内用miR15或miR16基因产物抑制人前列腺肿瘤给裸鼠接种激素抗性人前列腺腺癌细胞系(PC-3)，将小鼠分为处理组和对照组。当小鼠中的肿瘤达到100到250立方毫米的时候，将包裹在脂质体中的处理过的miR15和miR16直接注射到处理组的肿瘤中。对照组的肿瘤中只注射包裹有载体溶液的脂质体。研究过程中一直测量肿瘤体积。还评价了miR15和miR16基因产物在Dunning R-3327鼠前列腺腺癌模型中抑制前列腺肿瘤生长的功效，如下所述。将Dunning R-3327前列腺腺癌细胞的高度转移性的和恶性克隆(RT-3.1)接种到Copenhagen鼠中，然后将其分为处理组和对照组。大约一周后两组都形成实体肿瘤块。然后向处理组的肿瘤中注射包裹在脂质体中的处理过的miR15和miR16，两周一次，一共注射5周。对照组的肿瘤只注射含有载体溶液的脂质体。研究过程中一直测量肿瘤体积。
所有本文所涉及的参考文献在此都引入作为参考。本领域技术人员应当容易理解，本发明非常适于实施并达到本文所提及的以及其所固有的发明目的和优点。本发明还可以以其它特定方式实施而不背离其精神和基本属性，相应地可作为下述权利要求而不是上述说明书的参考，表征本发明的保护范围。
序列表<110>托马斯杰斐逊大学卡洛·M·克罗西乔治·A·卡林<120>用于癌症诊断和治疗的组合物和方法<130>08321-0126PC<150>60/425.864<151>2002-11-13<150>60/469,464<151>2003-05-09<160>54<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>83<212>RNA<213>人<400>1ccuuggagua aaguagcagc acauaauggu uuguggauuu ugaaaaggug caggccauau60ugugcugccu caaaaauaca agg83<210>2<211>89<212>RNA<213>人<400>2gucagcagug ccuuagcagc acguaaauau uggcguuaag auucuaaaau uaucuccagu60auuaacugug cugcugaagu aagguugac 89<210>3<211>22<212>RNA<213>人
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<223>引物
<400>47catgtaacca agataaatcc gt22<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>51tcatcagaag aaatcaaggc ag22<210>52<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>54ccccacctat ggttgtagtg agcatcc 2权利要求
1.一种在需要治疗的患者中治疗miR15或miR16介导的癌症的方法，包括给患者施用有效量的分离的miR15或miR16基因产物，由此miR15或miR16介导的癌症细胞的增殖受到抑制。
2.权利要求1的方法，其中所述miR15或miR16介导的癌症是慢性淋巴细胞白血病或前列腺癌。
3.权利要求1的方法，其中所述分离的miR15或miR16基因产物通过转染患者细胞的方式给药。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞是造血干细胞，慢性淋巴细胞白血病细胞或前列腺癌细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述分离的miR15或miR16基因产物以肠胃外或者肠内的形式给患者施用。
6.权利要求5的方法，其中所述肠内给药方式是口服，直肠，或鼻内。
7.权利要求5的方法，其中所述肠胃外给药方式选自血管内给药，组织外周或组织内注射，皮下注射或沉积，包括皮下输注，直接敷用，和吸入。
8.权利要求7的方法，其中所述血管内给药选自静脉内快速高剂量输注，静脉内输注，动脉内快速高剂量输注，动脉内输注和向脉管系统的导管滴注。
9.权利要求7的方法，其中所述组织外和组织内注射选自肿瘤外和肿瘤内注射，视网膜内注射，或视网膜底注射。
10.权利要求7的方法，其中所述皮下注射或沉积包括用渗透泵输注。
11.权利要求7的方法，其中所述直接敷用包括通过导管，视网膜丸，栓剂，含有多孔物质的植入物，含有非多孔物质，或者含有凝胶状物质的物质的植入物。
12.权利要求1的方法，其中所述分离的miR15或miR16基因产物以裸露RNA，或和递送试剂一起，或者以含有表达miR15或miR16基因产物的序列的核酸给药。
13.权利要求12的方法，其中所述含有表达miR15或miR16基因产物的序列的核酸是重组质粒或重组病毒载体。
14.权利要求13的方法，其中所述重组质粒或重组病毒载体包括U6启动子，H1启动子，或巨细胞病毒启动子。
15.权利要求13的方法，其中所述重组病毒载体是腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，或疱疹病毒载体。
16.权利要求15的方法，其中所述逆转录病毒选自慢病毒载体，棒状病毒载体，和鼠白血病毒载体。
17.权利要求1的方法，其中所述分离的miR15或miR16基因产物和亲脂性试剂，lipofectin，lipofectamine，cellfectin，聚阳离子，或脂质体一起给药。
18.权利要求17的方法，其中所述脂质体含有调理作用抑制分子。
19.权利要求18的方法，其中所述脂质体含有能将该脂质体靶定到慢性淋巴细胞白血病细胞或前列腺癌细胞上的配体。
20.权利要求1的方法，其中所述患者患有肿瘤，所述有效量的分离的miR15或miR16基因产物是至少大约10mg/g肿瘤块。
21.权利要求20的方法，其中所述有效量的分离的miR15或miR16基因产物是至少大约60mg/g肿瘤块。
22.权利要求20的方法，其中所述有效量的分离的miR15或miR16基因产物是至少大约100mg/g肿瘤块。
23.权利要求20的方法，其中所述有效量的分离的miR15或miR16基因产物是大约10-500mg/g肿瘤块。
24.权利要求1的方法，其中所述有效量的分离的miR15或miR16基因产物是大约5到3000mg/kg患者体重。
25.权利要求24的方法，其中所述有效量的分离的miR15或miR16基因产物优选是大约700-1000mg/kg患者体重。
26.权利要求1的方法，其中所述有效量的分离的miR15或miR16基因产物大于大约1000mg/kg患者体重。
27.一种在需要治疗的患者中治疗miR15或miR16介导的癌症的方法，包括下述步骤1)从患者中分离细胞；2)用含有编码有效量的miR15或miR16基因产物的序列的核酸转染所述细胞；并且3)将转染的细胞重新植入患者体内，由此患者中的miR15或miR16介导的癌症细胞受到抑制。
28.权利要求27的方法，其中所述miR15或miR16介导的癌症是慢性淋巴细胞白血病或前列腺癌。
29.权利要求28的方法，其中在将转染的细胞重新植入患者体内之前确证在转染细胞中表达所述miR15或miR16基因产物。
30.权利要求27的方法，其中在将转染的细胞重新植入患者体内之前确证含有编码有效量的miR15或miR16基因产物的序列的核酸稳定整合到转染细胞的基因组中。
31.权利要求27的方法，其中所述含有编码有效量的miR15或miR16基因产物的序列的核酸包括重组质粒或重组病毒载体。
32.权利要求31的方法，其中所述重组质粒或重组病毒载体包括U6启动子，H1启动子，或巨细胞病毒启动子。
33.权利要求32的方法，其中所述重组病毒载体是腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，或疱疹病毒载体。
34.权利要求33的方法，其中所述逆转录病毒选自慢病毒载体，棒状病毒载体，和鼠白血病毒载体。
35.权利要求27的方法，其中所述转染的细胞是慢性淋巴细胞白血病细胞或前列腺癌细胞。
36.权利要求27的方法，其中所述转染的细胞是造血干细胞。
37.一种在患者中抑制miR15或miR16介导的癌症细胞增殖的方法，包括向miR15或miR16介导的癌症细胞施用有效量的分离的miR15或miR16基因产物。
38.权利要求37的方法，其中所述miR15或miR16介导的癌症细胞包括慢性淋巴细胞白血病细胞或前列腺癌细胞。
39.权利要求37的方法，其中所述分离的miR15或miR16基因产物以转染miR15或miR16介导的癌症细胞的方式给药。
40.权利要求37的方法，其中所述的分离的miR15或miR16基因产物以裸露RNA，或和递送试剂一起，或者以含有表达miR15或miR16基因产物的序列的核酸给药。
41.权利要求40的方法，其中所述含有表达miR15或miR16基因产物的序列的核酸是重组质粒或重组病毒载体。
42.权利要求41的方法，其中所述重组质粒或重组病毒载体包括U6启动子，H1启动子，或巨细胞病毒启动子。
43.权利要求41的方法，其中所述重组病毒载体是腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，或疱疹病毒载体。
44.权利要求43的方法，其中所述逆转录病毒选自慢病毒载体，棒状病毒载体，和鼠白血病毒载体。
45.权利要求37的方法，其中所述分离的miR15或miR16基因产物和亲脂性试剂，lipofectin，lipofectamine，cellfectin，聚阳离子，或脂质体一起给药。
46.权利要求45的方法，其中所述的脂质体含有调理作用抑制分子。
47.权利要求45的方法，其中所述脂质体含有能将该脂质体靶定到慢性淋巴细胞白血病细胞或前列腺癌细胞上的配体。
48.一种药物组合物，含有分离的miR15或miR16基因产物和药学可接受的载体。
49.权利要求48的药物组合物，其中所述分离的miR15或miR16基因产物包裹在脂质体中。
50.权利要求49的药物组合物，其中所述脂质体含有调理作用抑制分子。
51.权利要求49的药物组合物，其中所述脂质体含有能将该脂质体靶定到慢性淋巴细胞白血病细胞或前列腺癌细胞上的配体。
52.权利要求48的药物组合物，其中所述分离的miR15或miR16基因产物能够抵抗核酸酶的降解。
53.权利要求52的药物组合物，其中所述分离的miR15或miR16基因产物含有一种或多种在2’位置具有修饰的核糖核苷酸。
54.权利要求53的药物组合物，含有其中每个核糖核苷酸都是2’修饰的核糖核苷酸的miR15或miR16基因产物。
55.权利要求53的药物组合物，其中在2’位置具有修饰的一个或多个核糖核苷酸在2’位置具有氟，氨基，烷基，烷氧基，或O-烯丙基基团的修饰。
56.权利要求53的药物组合物，其中在2’位置具有修饰的一个或多个核糖核苷酸具有2’AR-核苷酸的通式，其中A是氧或卤素(优选氟，氯或溴)；以及R是氢或直链或枝链C1-6烷基；其中当A是卤素的时候，则没有X和R。
57.权利要求53的药物组合物，其中在2’位置具有修饰的一个或多个核糖核苷酸是2’-O甲基核糖核苷酸。
58.一种药物组合物，含有编码分离的miR15或miR16基因产物的核酸，和药学可接受的载体。
59.权利要求58的药物组合物，其中所述核酸包裹在脂质体中。
60.权利要求59的药物组合物，其中所述脂质体含有调理作用抑制分子。
61.权利要求59的药物组合物，其中所述脂质体含有能将该脂质体靶定到CLL或前列腺癌细胞的配体。
62.一种诊断患者中miR15或miR16介导的癌症的方法，包括测定来自患者的样品中的miR15或miR16基因产物的水平，其中样品中miR15或miR16基因产物的水平相对于对照样品中miR15或miR16基因产物较低，表明存在miR15或miR16介导的癌症。
63.权利要求62的方法，其中对miR15或miR16基因产物水平的检测方法是选自下组的检测方法northern blot分析，原位杂交，和定量反向转录酶聚合酶链式反应。
64.权利要求62的方法，其中所述miR15或miR16基因产物选自具有序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4的基因产物。
65.权利要求62的方法，其中所述miR15或miR16介导的癌症是慢性淋巴细胞白血病或前列腺癌。
66.一种诊断患者中miR15或miR16介导的癌症的方法，包括分析来自患者的样品中的miR15或miR16基因，其中检测到来自于患者的样品中的miR15或miR16基因相对于对照样品中的miR15或miR16基因具有一个或多个缺失或突变，表明存在miR15或miR16介导的癌症。
67.权利要求66的方法，其中分析所述一个或多个缺失或突变的检测方法是选自下组的检测方法Southern blot杂交，序列分析，和单链构象多肽性。
68.权利要求66的方法，其中所述miR15或miR16介导的癌症是慢性淋巴细胞白血病或前列腺癌。
69.一种诊断患者中miR15或miR16介导的癌症的方法，包括测定来源于患者的样品中的miR15或miR16基因拷贝数，其中miR15或miR16基因拷贝数减少到1或0，则表明存在miR15或miR16介导的癌症。
70.权利要求69的方法，其中所述基因拷贝数的减少是通过分析13q14处的D13S273或D13S272微卫星标记的杂合丢失测定的，其中D13S273或D13S272微卫星标记的杂合丢失表明存在miR15或miR16介导的癌症。
71.权利要求70的方法，其中杂合丢失是通过分析D13S1150或D13S273微卫星标记的杂合丢失测定的。
72.权利要求71的方法，其中杂合丢失是通过分析位点Alu18或D13S273微卫星标记的杂合丢失测定的。
73.权利要求69的方法，其中miR15或miR16基因拷贝数是通过Southern blot杂交测定的。
74.权利要求68的方法，其中所述miR15或miR16介导的癌症是慢性淋巴细胞白血病或前列腺癌。
全文摘要
miR15和miR16小分子RNA基因位于13q14，在特定癌细胞，例如慢性淋巴性白血病或前列腺癌的丢失的30kb区域内。慢性淋巴性白血病或前列腺癌可以通过检测miR15或miR16基因拷贝数目的减少，确定miR15或miR16基因突变的情况，或者通过检测由这些基因转录的RNA的减少来诊断。当对患有这些疾病的患者给药的时候，miR15或miR16基因产物能抑制癌症例如慢性淋巴性白血病或前列腺癌细胞的赘生物生长或肿瘤生长。
文档编号C12N15/63GK1719973SQ200380104787
公开日2006年1月11日 申请日期2003年11月12日 优先权日2002年11月13日
发明者卡洛·M·克罗西, 乔治·A·卡林 申请人:托马斯杰斐逊大学