专利名称：水泡性口炎病毒n基因重组表达质粒载体、表达抗原以及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于制备病毒诊断试剂的生物制剂，尤其是能够对水泡性口炎病毒进行检测的生物制剂以及这种生物制剂的制备方法。
背景技术：
水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)是由弹状病毒科水泡病毒属的水泡性口炎病毒(VSV)引起的人畜共患的重大动物疫病。该病毒分为印第安纳(Indiana，IN型)和新泽西(New Jersey，NJ型)两个血清型。感染人后出现急性热性类似流感的症状。牛、猪、马、羊和其它多种野生动物可感染，临床症状与口蹄疫(Foot and Mouth disease，FMD)不易区别。国际兽疫局(OIE)将该病列为动物A类传染病。是国际动物贸易中的重要检疫对象。
VS常用的诊断方法是病毒中和试验(VN)、补体结合试验(CF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)三种方法。VN和CF两种方法因试验复杂、麻烦、耗时、不安全、需在生物安全三级(P3)实验室内进行，有时产生非特异性反应，对血清样品的质量要求高(如抗补体、细胞毒)，应用受到限制。用VSV纯化的完整病毒粒子作为包被抗原建立的ELISA方法，病毒的繁殖和纯化烦锁复杂、成本高，有散毒的危险，也不能区别疫苗免疫和自然感染动物。从完整VS病毒中提纯的G蛋白为抗原进行ELISA，虽提高了试验的安全性，但是使成本更高，并且在G蛋白纯化过程中难免有其它病毒蛋白的污染，使其在鉴别诊断重组G蛋白疫苗免疫和自然感染动物中造成一些非特异性反应。应用VSV N蛋白基因重组杆状病毒感染昆虫细胞来表达N蛋白作为抗原，建立了ELISA，但是培养昆虫细胞产生N蛋白抗原，成本仍然较高。目前，VSV最常用的血清学诊断方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，ELISA具有快速、特异、敏感、简便和安全的优点，被广泛采用。通过组织培养方法，将病毒接种在细胞中大量繁殖，经过分离、纯化的病毒作为ELISA包被抗原，这种方法不仅操作繁锁，不稳定，产量低，成本高，而且有一定的生物安全隐患。国外应用分子克隆和基因重组技术已在原核和真核系统中表达了N蛋白，但原核表达的蛋白抗原性差，真核表达的抗原提取烦琐、成本高。
VSV为单股负链RNA病毒，基因全长11163bp，共编码5种主要病毒蛋白—糖蛋白(G)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)、磷酸蛋白(NS)、病毒RNA聚合酶(L)。其中G糖蛋白定位在包膜的突起上，由511个氨基酸组成，刺激机体产生中和抗体，呈现型乃至株的特异性。N蛋白由422个氨基酸组成，呈现群特异性，为所有型的VSV所共有，诱导产生非中和抗体，与其它弹状病毒无任何交叉反应，N基因为保守片段，N携带有群特异性抗原决定簇，由病毒抗原决定簇产生的抗体多数是针对N蛋白。因此，在VSV的群特异性血清抗体检测中，N作为首选的抗原。对于VS病毒的核蛋白基因，有报道用真核表达系统，少数报道认为原核表达系统不能高效表达核蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能稳定、高效表达具有良好反应原性的水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体。
本发明的第二个目的在于提供水泡性口炎病毒N抗原重组蛋白诊断试剂。
本发明的第三个目的在于提供上述重组表达质粒载体和抗原的制备方法。
本发明所述的水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体命名为p BAD-VN5，其编码N蛋白的核苷酸序列为
图1所示，所述p BAD-VN5中的N基因DNA序列已经在GenBank中注册，注册号为AY386617。
本发明所述的水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体所表达获得的表达产物命名为N融合蛋白，其氨基酸序列为图2所示。
本发明所述的水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体的制备方法由以下步骤组成一、将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中，构建N基因克隆重组质粒，进行核苷酸序列分析；二、亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体；三、经PCR限制性内切酶分析、测序鉴定，筛选获得N基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆，即构建了水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体。
本发明所述的水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体所表达获得的抗原制备方法由以下步骤组成一、将筛选获得的含有VSV群特异性抗原N基因表达重组质粒阳性克隆载体的工程菌株，接种于含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养12h；二、上述培养物按1％的体积接入含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养4h；三、在培养基中加入阿拉伯糖至最终浓度为0.02％，温度降至30℃，继续振荡培养，缓慢诱导表达5h；四、收集菌液以4℃下5000r/min离心30min，将沉淀菌体按1∶10(W/V)悬浮于TE缓冲液，置冰水浴中300~400W反复超声破菌，每次15s，间隔15s；五、菌体裂解液以4℃下5000r/min离心30min，取上清液为粗提的BTV VP7重组融合蛋白。
本发明的优点和积极效果为1、本表达抗原生产的VSV核蛋白融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)，具有快速、特异、敏感、简便和安全的优点，克服了通过组织培养方法生产完整病毒作为ELISA包被抗原而造成的操作繁锁，不稳定，产量低，成本高、有生物安全隐患的缺点。
2、用pBAD/Thio-TOPO原核表达系统对水泡性口炎病毒的N蛋白进行表达，生产的抗原以可溶性形式高效表达，融合蛋白有完全生物学活性。也克服了真核系统中表达N蛋白抗原的提取烦琐、成本高的缺陷，本方法生产N抗原具有简便、快捷和高效的特点。
3、本表达抗原含有阿拉伯糖启动子，它的调控快速而灵敏。
4、用表达产物作为抗原进行ELISA方法具有较强的特异性和更高的敏感性，不与相关环状病毒发生交叉反应。包被的酶标板在4℃可以存放2个月，在-20℃可保存6个月以上。本试验生产的重组N蛋白抗原可以代替完整病毒作为ELISA检测用的标准抗原。
5、为制备VSV N抗原，将核蛋白基因片段重组至pBAD/Thio-TOPO载体的arapBAD启动子下游附近，构建了高效表达核蛋白的重组表达质粒载体。该硫氧还蛋白融合蛋白表达系统表达的目的蛋白与天然产物在构象及生物活性等方面没有区别，融合蛋白以可溶性的形式存在于细胞间质中，从而大大简化纯化程序，避免了包涵体处理这一下游棘手问题。
6、本VSV N基因重组载体表达的融合蛋白中的非目的蛋白部分增强了目的蛋白的抗原性，而没有导致抗体与非目的蛋白部分发生交叉反应的现象。用表达产物作为抗原进行ELISA，检测该病毒抗血清以及其它相似病毒抗血清，结果表明，表达产物均能与该病毒的所有血清型抗血清发生良好反应，而与其它相似病毒抗血清不能发生反应，说明表达产物为该病毒的特异性核蛋白。
7、在对人工感染VSV-NJ和VSV-IN阳性血清检测中发现，没有产生干扰和降低敏感性的现象，VSV-NJ和VSV-IN两型间发生交叉反应，用VSV-NJ的核蛋白表达抗原可检测两型的抗血清。本发明生产的重组核蛋白抗原可以代替完整病毒作为ELISA检测用的标准抗原。
8、生产简单，成本低廉，稳定性好，安全。
具体实施例方式
(一)、VSV N基因重组质粒的构建按照花群义等《水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析》，中国生物制品学杂志，2004年第1期，第4页至第7页，进行水泡性口炎病毒N基因克隆和测序，构建VSVN基因重组质粒，将重组质粒命名为pMD-VN5。
(二)、VSV N基因重组表达载体的构建以上述构建的含有VSV N基因的pMD-VN5质粒DNA为模板，进行目的片段的扩增。经1％琼脂糖电泳检测，回收纯化的目的片段插入p BAD/Thio-TOPO载体，转化TOP10感受态细菌，在含100μg/mL Amp的LB培养基上选择培养24h。从LB平板培养基上挑选单个菌落，用PCR分析鉴定，根据载体和目的基因上的酶切位点，用BamHI酶切鉴别出正向插入VSV N基因的重组质粒。对重组质粒中的插入片段进行序列测定，进一步鉴别出正向插入VSV N基因和读码框正确的重组表达载体。命名为p BAD-VN5。
(三)大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备与转化、质粒的制备大肠杆菌TOP10感受态细胞制备，采用氯化钙制备法，具体方法参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第55-56页。只是采用由0.75mmol/LTris-HCl代替水为溶剂配制0.1mol/LCaCl2。感受态细胞的转化方法，参照上述参考文献进行。质粒的制备参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第26-28页，采用碱裂解法制备，用PEG沉淀法纯化。
(四)VSV N基因重组表达质粒载体在大肠杆菌中的诱导表达、重组蛋白抗原制备具体方法按照Guzman L M，Belin D和Carson M J等.《Tight Regulation，Modulation，and High-Level Expression by Vectors Containing the Arabinose PQADPromoter》.J.Bacteriol，1995，1774121-4130。将已转化p BAD-B5的TOP10细菌接种在含100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃振荡培养12h；参照杨丽琛、常团结和陈宛新等《CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定》，生物工程学报，2003年第1期，第63-67页，制备含100μg/mL Amp的LB培养基，按1％的体积接入上述制备的种子菌液，37℃振荡培养4h，加入阿拉伯糖至最终浓度为0.02％，温度降至30℃，继续振荡培养，缓慢诱导表达5h，收集菌液以4℃下5000r/min离心30min，称量菌体湿重。将菌体按1∶10(W/V)悬浮于TE缓冲液，置冰水浴中300~400W反复超声破菌，每次15s，间隔15s，涂片染色镜检至完全裂解菌体，以4℃下5000r/min离心30min，取上清液为粗提的VSV N重组蛋白抗原。
(五)ELISA检测按照花群义、金宁一等《水泡性口炎病毒核蛋白基因的表达和被步应用》，生物工程学报，2004年第1期，第130页至第135页。用上述方法制备表达菌株的重组蛋白粗提物，用VSV特异性抗血清和HRP-protein G进行酶联免疫吸附试验，测定表达菌株的重组蛋白粗提物和阴性对照菌株的粗提物中表达产物的特异性ELISA滴度，采用方阵滴定法测定最适包被抗原的浓度。用经上述测定包被抗原浓度的重组蛋白作为包被抗原，进行水泡性口炎ELISA方法检测。
(六)按上述(四)所制备VSV N蛋白重组抗原方法，100mL含100μg/mLAmp的LB培养基可获得约45mL水泡性口炎酶联免疫吸附试验(ELISA)包被抗原。
(七)按上述(五)方法，应用VSV N蛋白重组抗原试剂对大量被检样品和对照参考血清进行检测，证明VSV N蛋白重组抗原在诊断水泡性口炎方面特异性强、敏感性高。该方法生产VSV N抗原具有简便、快捷和高效的特点。本发明利用原核表达载体pBAD/Thio TOPO成功高效表达VSV N群特异性抗原，首次创立原核表达水泡性口炎病毒群特异性抗原N蛋白，研制VSV诊断试剂的新策略。
GCTCCTACAGTTAAGAGAATCATTAACGACTCAATTATTCAGCCGAAATTACCGGCCAACGAGGATCCGGTCGAATACCCGGCTGATTACTTCAAAAATAATACCAATATAGTATTGTATGTGAGCACCAAAGTGGCACTAAATGATTTGAGAGCATACGTATACCAGGGTATCAAGTCCGGTAATCCATCCATCCTCCACATAAATGCTCATCTCTATGCTGCATTAAAGGGAGTGGAAGGAACTTTAGACAGAGACTGGATTAGCTTTGGAAGAACAATTGGAAAGAGAGAGGAGAATGTGAAAATTTTCGATCTAGTGAAAGTTGAAGAACTGAAGACAGCACTTCCTGATGGGAAATCAGACCCTGACCGTTCTGCTGAGGATGATAAATGGCTTCCCATCTACATCCTAGGTCTTTACAGAGTGGGCAGATCTAAAGTTACGGATTACAGAAAGAAACTACTGGACGGGCTTGAAAATCAGTGCAAAGTGGCGTCAACCAGATTTGAGAGTCTAGTCGAGGATGGTCTCGACTTCTTTAACATATGGGAGAATGATCCAAATTTCACCAAGATAGTTGCTGCAGTGGATATGTTCTTCCACATGCTCAAAAAGCATGAACGTGCTCCAATCAGATACGGAACCATAGTCTCAAGATTCAAGGACTGTGCAGCACTTGCAACATTTGGGCATCTCAGCAAAGTCAGTGGACTCTCAATTGAGGAACTCACAACATGGGTCCTGAATAGGGAAGTTGCAGACGAGCTATGCCAGATGATGTATCCGGGTCAAGAAATTGACAAAGCAGATTCATACATGCCGTATATGATTGACTTTGGGTTATCTCAGAAATCCCCATATTCATCAGTGAAGAATCCAGCTTTTCATTTCTGGGGACAACTTGCTGCACTCTTGCTAAGATCAACTCGGGCAAAAAATGCTAGACAGCCTGACGACATCGAATACACTTCACTAACTTGCGCAAGTTTACTGCTGTCATTTGCTGTTGGGTCCTCAGCAGACATTGAACAGCAGTTCTATATTGGAGAAGACAAATACACAACAGAAAAAGATGATGGTCTGAAGAAATCAGATGTCCCACCAAAAGGAAGAAATGTCGTGGACTGGCTTGGCTGGTATGATGACAATGGGGGAAAACCCACACCAGATATGCTCAACTTCGCAAGAAGAGCAGTCAACTCTCTGCAGTCACTTCGTGAAAAGACAATTGGCAAATACGCAAAAGTAGAATTTGACAAA。
HP-ThioredoxinMGSDKIIHLT DDSFDTDVLK ADGAILVDFW AHWCGPCKMI APILDEIADE YQGKLTVAKL 60NIDHNPGTAP KYGIRGIPTL LLFKNGEVAA TKVGALSKGQ LKEFLDANLA GSGSGDDDDK 120LALAPTVKRI INDSIIQPKL PANEDPVEYP ADYFKNNTNI VLYVSTKVAL NDLRAYVYQG 180IKSGNPSILH INAHLYAALK GAEGTLDRDW ISFGRTIGKR EENVKIFDLV KVEELKTALP 240DGKSDPDRSA EDDKWLPIYI LGLYRVGRSK VTDYRKKLLD GLENQCKVAS TRFESLVEDG 300LDFFNIWENO PNFTKIVAAV DMFFHMLKKH ERAPIRYGTI VSRFKDCAAL ATFGHLSKVS 360GLSIEELTTW VLNREVADEL CQMMYPGQEI DKADSYMPYM IDFGLSQKSP YSSVKNPAFH 420FWGQLAALLL RSTRAKNARQ PDDIEYTSLT CASLLLSFAV GSSADIEQQF YIGEDKYTTE 480KDDGLKKSDV PPKGRNVVDW LGWYDDNGGK PTPDMLNFAR RAVNSLQSLR EKTIGKYAKV 540EFDKKGELEG KPIPNPLLGL DSTRTGHHHH HH........ .......... ........... 63权利要求
1.一种水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体，其特征在于命名为pBAD-VN5重组表达质粒载体，其表达N融合蛋白的核苷酸序列为GCTCCTACAGTTAAGAGAATCATTAACGACTCAATTATTCAGCCGAAATTACCGGCCAACGAGGATCCGGTCGAATACCCGGCTGATTACTTCAAAAATAATACCAATATAGTATTGTATGTGAGCACCAAAGTGGCACTAAATGATTTGAGAGCATACGTATACCAGGGTATCAAGTCCGGTAATCCATCCATCCTCCACATAAATGCTCATCTCTATGCTGCATTAAAGGGAGTGGAAGGAACTTTAGACAGAGACTGGATTAGCTTTGGAAGAACAATTGGAAAGAGAGAGGAGAATGTGAAAATTTTCGATCTAGTGAAAGTTGAAGAACTGAAGACAGCACTTCCTGATGGGAAATCAGACCCTGACCGTTCTGCTGAGGATGATAAATGGCTTCCCATCTACATCCTAGGTCTTTACAGAGTGGGCAGATCTAAAGTTACGGATTACAGAAAGAAACTACTGGACGGGCTTGAAAATCAGTGCAAAGTGGCGTCAACCAGATTTGAGAGTCTAGTCGAGGATGGTCTCGACTTCTTTAACATATGGGAGAATGATCCAAATTTCACCAAGATAGTTGCTGCAGTGGATATGTTCTTCCACATGCTCAAAAAGCATGAACGTGCTCCAATCAGATACGGAACCATAGTCTCAAGATTCAAGGACTGTGCAGCACTTGCAACATTTGGGCATCTCAGCAAAGTCAGTGGACTCTCAATTGAGGAACTCACAACATGGGTCCTGAATAGGGAAGTTGCAGACGAGCTATGCCAGATGATGTATCCGGGTCAAGAAATTGACAAAGCAGATTCATACATGCCGTATATGATTGACTTTGGGTTATCTCAGAAATCCCCATATTCATCAGTGAAGAATCCAGCTTTTCATTTCTGGGGACAACTTGCTGCACTCTTGCTAAGATCAACTCGGGCAAAAAATGCTAGACAGCCTGACGACATCGAATACACTTCACTAACTTGCGCAAGTTTACTGCTGTCATTTGCTGTTGGGTCCTCAGCAGACATTGAACAGCAGTTCTATATTGGAGAAGACAAATACACAACAGAAAAAGATGATGGTCTGAAGAAATCAGATGTCCCACCAAAAGGAAGAAATGTCGTGGACTGGCTTGGCTGGTATGATGACAATGGGGGAAAACCCACACCAGATATGCTCAACTTCGCAAGAAGAGCAGTCAACTCTCTGCAGTCACTTCGTGAAAAGACAATTGGCAAATACGCAAAAGTAGAATTTGACAAA。
2.一种水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体p BAD-VN5所表达获得的N蛋白抗原，其特征在于命名为VSV N融合蛋白，其氨基酸序列为HP-ThioredoxinMGSDKIIHLT DDSFDTDVLK ADGAILVDFW AHWCGPCKMI APILDEIADE YQGKLTVAKL 60NIDHNPGTAP KYGIRGIPTL LLFKNGEVAA TKVGALSKGQ LKEFLDANLA GSGSGDDDDK 120LALAPTVKRI INDSIIQPKL PANEDPVEYP ADYFKNNTNI VLYVSTKVAL NDLRAYVYQG 180IKSGNPSILH INAHLYAALK GVEGTLDRDW ISFGRTIGKR EENVKIFDLV KVEELKTALP 240DGKSDPDRSA EDDKWLPIYI LGLYRVGRSK VTDYRKKLLD GLENQCKVAS TRFESLVEDG 300LDFFNIWEND PNFTKIVAAV DMFFHMLKKH ERAPIRYGTI VSRFKDCAAL ATFGHLSKVS 360GLSIEELTTW VLNREVADEL CQMMYPGQEI DKADSYMPYM IDFGLSQKSP YSSVKNPAFH 420FWGGLAALLL RSTRAKNARQ PDDIEYTSLT CASLLLSFAV GSSADIEGQF YIGEDKYTTE 480KDDGLKKSDV PPKGRNVVDW LGWYDDNGGK PTPDMLNFAR RAVNSLQSLR EKTIGKYAKV 540EFDKKGELEG KPIPNPLLGL DSTRTGHHHH HH........ .......... .......... 632V5 epitope6His tag
3.按照权利要求1所述的水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体的制备方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、将VSV编码群特异性抗原N基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中，构建N基因克隆重组质粒，进行核苷酸序列分析；(二)、亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体；(三)、转化TOP10细胞，经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定；(四)、筛选获得VSV N基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆，即构建了VSV群特异性抗原N基因重组表达载体。
4.按照权利要求2所述的水泡性口炎病毒N基因重组载体表达所获得的VSVN抗原的制备方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、将筛选获得的含有VSV群特异性抗原N蛋白表达重组质粒阳性克隆载体的工程菌株，接种于含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养12h；(二)、上述培养物按1％的体积接入含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养4h；(三)、在培养基中加入阿拉伯糖至最终浓度为0.02％，温度降至30℃，继续振荡培养，缓慢诱导表达5h；(四)、收集菌液以4℃下5000r/min离心30min，将沉淀菌体按1∶10(W/V)悬浮于TE缓冲液，置冰水浴中300~400W反复超声破菌，每次15s，间隔15s；(五)、菌体裂解液以4℃下5000r/min离心30min，取上清液为粗提的VSV N重组融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种用于制备水泡性口炎病毒VSVN蛋白重组抗原诊断试剂，以及制备方法。本制剂包括水泡性口炎病毒VSV N基因重组表达质粒载体以及由其表达所获得的水泡性口炎病毒VSV N蛋白重组抗原，其制备方法为一、将VSV编码群特异性抗原N基因片段克隆至pMD18－T质粒载体中，构建N基因克隆重组质粒；二、亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体；三、转化TOP10细胞；四、筛选获得VSV N基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆，即构建了VSV群特异性抗原N的重组表达载体。本制剂可稳定、高效表达具有良好反应原性的VSV N重组抗原，可作为水泡性口炎诊断试剂。
文档编号C12N15/70GK1563384SQ200410008749
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月17日 优先权日2004年3月17日
发明者花群义, 徐自忠, 董俊, 杨晶焰, 杨云庆, 周晓黎, 贾建军, 肖荣海, 龙忠保 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心