专利名称：微生物转化制备香草醛的菌种及其方法
所属领域本发明属生物催化领域，涉及一种微生物朱红密孔菌Pycnoporuscinnabarinus及其突变株，及用于转化香草酸制备香草醛的方法。
背景技术：
香草醛，即香兰素，化学名4-羟基3-甲氧基苯甲醛，是目前世界上产量最大的合成香料，广泛应用于食品、饮料、香料、医药、皮革、电镀等行业。在食品中香草醛是香草、巧克力、奶油等香味的主要原料，被认为是最重要的安全食用香料之一。
香草醛的生产方法主要是化学合成和天然提取，用两种方法制备的产品在产量和价格上差异极大。化学合成香草醛售价12$/kg左右，世界年产量超过1.2万吨，而天然提取的售价1,200~4,000美元$/kg，由于受香荚兰豆的产量的限制，天然香兰素年产只有约20吨。化学法合成香草醛虽然方法简单，能大规模生产，但却存在容易造成环境污染、采用的原料如愈创木酚有毒等弊端。随着人们对健康与长寿意识的增强，世界各国对安全食品的日益重视，天然香草醛的需求不断增加。但是，从植物中提取的方法生产天然香草醛，产率低、成本高、价格昂贵。由此，促使人们寻找采用廉价、可再生的、天然原料生产天然香草醛的替代方法。Lesage-Meessen(US5866380)等开发了用两种微生物分步转化阿魏酸制备香草醛的工艺，第一步在黑曲霉Aspergillus niger CNCM I-1472(即MIC373)菌株的发酵液中，流加终浓度为5.05g/L的阿魏酸，经16天的转化，发酵液中的阿魏酸完全消耗，大部分转化为香草酸，香草酸的浓度达到3.6g/L，或者在西唐氏镰霉菌Streptomyces setoniiATCC25497的发酵液中，流加终浓度为0.88g/L的阿魏酸，经100h的转化，培养液中产生0.33g/L的香草酸；第二步培养担子菌属微生物如黄孢原毛平革菌Phanerochaeyte chrysosporium CNCMI-1471(即MIC247)，在培养过程中加入用含有纤维二糖的碳源和从第一步中转化得到的香草酸，发酵培养6天，产生0.642g/L的香草醛。后续的研究报道(C.Stenielaire；L.Lesage-meessen.；A.Oddou.；et al.J ofBiosciandBioengineering，2000，89(3)223-230.)在转化过程中添加选择性树脂XAD-2，减少香草醛对菌株的毒性，香草醛的产量达到1.57g/L，摩尔转化率82.1％。这种以阿魏酸为前体通过两种微生物的转化制备香草醛的方法，涉及到两种微生物的培养，两次底物的转化反应，和中间产物的提取，整个生产流程长，生产效率低。
技术方案本发明提供了一种直接以香草酸为前体，通过朱红密孔菌转化香草酸制备香草醛的方法，具有对环境友好，反应条件温和，有害物质含量低，并且不受种植业的影响，可大规模生产，生产周期短的优点。与上述的生物方法相比，简化了香草醛的生产工艺，降低生产能耗。
本发明中能有效转化香草酸为香草醛的微生物，是白腐真菌类的朱红密孔菌Pycnoporus cinnabarinus分类属于真菌界，担子菌门，担子菌纲，多孔目，多孔科，密孔属(Dictionary of the Fungi，9th ed.)，这种真菌分布于世界各地，生长在栎、桦、椴及松等针阔叶木材上，引起木材腐朽(戴芳澜，中国真菌总汇，北京科学出版社，1979，745)。在马铃薯培养基上，菌丝生长初期、中期呈白色毛绒状，后期菌苔反面微淡褐色；在含有香草酸的平板上，生长初期，有白色绒毛状单菌落和半透明状菌落生长，后期菌落周围呈红褐色；菌丝细长有隔。
此菌株已于2004年3月17日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保存号CGMCC No.1115。
该菌及其突变株在含有1g/L香草醛以上的固体平板上不生长，斜面培养基的成分为1000ml马铃薯浸汁(含去皮马铃薯200g)中含50~250g，葡糖糖1~15g，硫酸镁0.1~1g，磷酸二氢钾0.2~5g，蛋白胨1~5g，琼脂15~20g，pH自然；斜面培养温度20~35℃，培养时间5~10天。
本发明采用微生物转化香草酸制备香草醛的方法包括(1)将权利要求1所述的朱红密孔菌SW-0203或其突变株进行常规培养、发酵，以发酵液中的生长细胞，或分离获得的游离细胞，或用海藻酸钙等载体固定化的细胞作为香草酸转化反应的生物催化剂；(2)将香草酸配制成溶液作为生物转化的底物；(3)用(1)的生物催化剂对(2)底物溶液进行转化反应，生成香草醛；
(4)在(3)的反应液中加入吸附剂，并用有机溶剂提取产物；(5)对提取液进行脱水、浓缩，并用非极性溶剂结晶，获得香草醛粗品；(6)用乙醇~水溶液对香草醛粗品进行重结晶。
生物催化剂的制备将在试管斜面中生长好的朱红密孔菌CGMCC No.1115或其突变株，在液体摇瓶中扩大培养。然后按5~15％的种量接入装有50~300ml发酵培养基的500ml三角瓶中，适宜的发酵培养基的成份为葡萄糖0.1~20g/L，牛肉膏0.1~15g/L，酵母膏0.1~10g/L，磷酸二氢钾0.1~0.2g/L，硫酸镁0.1~0.5g/L，氯化钙0.1~1.32mg/L。培养基的起始pH3~8，摇床转速100~250r/min，培养温度20~35℃，培养时间24~72h后，得到用于香草酸转化的发酵液。或者，将发酵液过滤，得到湿菌体，直接用于香草酸的转化。也可，用生理盐水制成菌丝体悬液，与海藻酸钠、卡拉胶、壳聚糖、明胶等载体混合制成固定化细胞用于转化。湿菌体和固定化细胞可反复利用。
香草酸底物溶液的配制用0.1N的氢氧化钠溶液，按每g香草酸约57ml碱溶液制成100g/L的pH7.2的钠盐水溶液，0.1Mpa下灭菌20分钟，作为配制底物溶液用的原液保存，使用时按所需要的浓度稀释至含香草酸1~10g/L。
微生物对香草酸的转化反应将湿菌体和固定化细胞与底物溶液混合，湿菌体和固定化细胞的加入量为每g底物加5~100g(以湿菌体计)，底物的浓度为1~10g/L。转化反应的温度为20~40℃，转化过程中可加1~15g/L葡萄糖，当反应液中出现香草醛时，加入1~20％(质量体积)的X-5、201X7、DA201、D4020、AKA-9、HZ802、HZ816、HPD100A、HPD600、HPD300等大孔吸附树脂。当反应液中香草酸基本被消耗完时，结束反应，转化时间6~60h。湿菌体和固定化细胞可反复回用，进行数次反应。
香草醛的分离与纯化分离反应液中的吸附树脂，用乙醇、或甲醇、或乙酸乙酯等有机溶剂进行洗脱，香草醛集中在有机相中，有机溶剂的加量在15~40g/g产物。含有香草醛的有机相，经饱和氯化钠等脱水后，在30~70℃下真空浓缩，得到100~500g/L的香草醛浓缩液。浓缩液中加入1~10倍体积的正己烷或苯等非极性溶剂进行搅拌，得到纯度为70~90％的香草醛粗结晶。再用乙醇-水体积比为0.01~0.8∶1的溶液溶解，加热至60~85℃，至香草醛粗晶体完全溶解后，冷却至0~10℃，静止结晶，滤去母液，用冷乙醇洗涤，40℃下真空干燥，得到纯度为99％的香草醛晶体。
本发明突出的特点是通过以简单的葡糖糖为碳源的培养基，培养朱红密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC No.1115，就能有效地转化底物香草酸生成香草醛，微生物的转化效率高，对底物的摩尔转化率为30~80％，转化液中副产物少，产物易于提取，提取收率60~90％，所得到香草醛的纯度高。并且，本发明的转化工艺即可直接用发酵培养液添加香草酸进行转化，也可用发酵后分离到的游离菌丝体或制成的固定化细胞加香草酸溶液进行转化。
实施例实施例1配制斜面培养基，1000ml马铃薯浸汁(含去皮马铃薯200g)中含葡萄糖20g，硫酸镁0.1g，磷酸二氢钾0.25g，蛋白胨1g，琼脂20g，pH自然，装入玻璃试管中，灭菌后冷却，接入朱红密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC No.1115，30℃培养5天，作为活化种子。
配制发酵培养基，葡萄糖20g/L，牛肉膏6g/L，酵母膏0.1/L，磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钙1.32mg/L，硫酸镁0.5g/L，盐酸硫胺素3.5mg/L，pH5.0。500ml三角瓶中装液220ml，120℃灭菌20分钟，冷却后接入种子。30℃、120r/min培养48h后，补加终浓度为5g/L的葡萄糖，并加入2g/L的底物香草酸，转化42h，测定香草醛的含量为0.724g/L，摩尔转化率40％。
实施例2按实施例1的方法制备种子，以10％的种量接入25L发酵罐中发酵，控制温度30℃、罐压0.1Mpa，转速150r/min，通气量1∶1v/v，菌体生长48h时，加入终浓度2g/L的香草酸溶液进行转化，并将温度升为35℃，通气量降为0.3∶1v/v，添加300g树脂HZ802，转化72h时测定香草醛的含量为1.30g/L，摩尔转化率71％。
实施例3按实施例1的方法，朱红密孔菌CGMCC No.1115发酵培养48h，过滤得到朱红密孔菌游离菌丝体。用生理盐水配制成3％海藻酸钠溶液，煮沸溶解，与生理盐水调制的菌丝体悬浮液混合搅拌均匀，用滴管滴入0.1mol/L CaCl2中，得到海藻酸钙包埋细胞。在150mL三角瓶中，装30mL转化液和30g固定化细胞，在温度35℃下转化反应48h，测定溶液中香草醛的含量。表1结果表明，重复使用3次，第4次转化能力下降。
表1固定化细胞反复分批转化结果反复利用次数 1 2 3 4香草醛浓度(g/L) 0.444 0.645 0.489 0.195实施例4按实施例2的方法，得到2400g吸附香草醛的树脂(测定含香草醛20.6g)，用1660ml乙酸乙酯抽提三次，得到4670ml有机相，HPLC测得含3.728g/L香草醛，用250g无水硫酸镁脱水，35℃真空浓缩到75ml，加入150ml正己烷，得到粗晶体17.7g，经HPLC测定其含量为82.7％。
实施例5取实施例4中得到的粗结晶1.89g，加12倍量85℃的乙醇-水溶液溶解，乙醇-水溶液的体积比为0.25∶1，调pH7.0，冷却，去除先析出的棕色油状物，再冷却析出晶体，经过滤后于50℃烘干，得到淡黄色结晶，HPLC测定含量95％，重复进行二次重结晶得到0.87g白色结晶，HPLC测定纯度为99％。
权利要求
1.一种能有效转化香草酸为香草醛的微生物菌株，其特征是担子菌属(Basidiomycetes)的朱红密孔菌Pycnoporus cinnabarinus及其突变株。
2.一种用微生物转化制备香草醛的方法，包括(1)将权利要求1所述的朱红密孔菌或其突变株进行常规培养、发酵，以发酵液中的生长细胞，或分离获得的湿菌体、固定化细胞作为香草酸转化反应的生物催化剂；(2)将香草酸配制成溶液作为生物转化的底物；(3)用(1)的生物催化剂对(2)的底物溶液进行转化反应，生成香草醛；(4)在(3)的反应液中加入吸附剂，并用有机溶剂提取产物；(5)对提取液进行脱水、浓缩，并用非极性溶剂结晶，获得香草醛粗品；(6)用含有乙醇的水溶液对香草醛粗品进行重结晶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中菌株的发酵培养基含有葡萄糖0.1~20g/L，牛肉膏0.1~15g/L，酵母膏0.1~10g/L，磷酸二氢钾0.1~0.2g/L，硫酸镁0.1~0.5g/L，氯化钙0.1~1.32mg/L，培养基起始pH3~8，培养温度20~35℃，500ml三角瓶装液50~300ml，摇床转速100~250r/min，培养时间24-72h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中的底物溶液中香草酸浓度1~10g/L，加入生物催化剂的量为5~100g/g底物(以湿菌体计)。
5.根据权利要求2所述的方法，步骤(3)中转化反应的温度20~40℃，转化时间6~72h。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述的吸附剂为大孔吸附树脂X-5、201X7、DA201、D4020、AKA-9、HZ802、HZ816、HPD100A、HPD600、HPD300。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述的有机溶剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯，加入量为15~40g/g产物。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述的非极性溶剂为正己烷或苯，加入量为1~10倍提取液。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述的含有乙醇的水溶液中乙醇-水的体积比为0.01~0.8∶1。
全文摘要
本发明是一种用微生物转化技术制备香草醛的方法，利用筛选得到的微生物朱红密孔菌Pycnoporus cinnabarinus转化香草酸生成香草醛。具体包括朱红密孔菌在优化的培养条件下发酵；其发酵液或游离细胞或固定化细胞能将1~10g/L的香草酸转化为香草醛，对底物的摩尔转化率为30~80％；转化液通过树脂吸附、溶剂抽提和结晶，得到淡黄色晶体，收率60~90％；用含有乙醇的水溶液重结晶后得到纯度为99％的香草醛结晶。
文档编号C12P7/24GK1670182SQ200410008769
公开日2005年9月21日 申请日期2004年3月18日 优先权日2004年3月18日
发明者孙志浩 申请人:江南大学