专利名称：一种提高人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化效率的新方法
技术领域：
本发明涉及一种调节细胞诱导分化的方法，具体地说涉及一种调节体外培养的人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化的新方法。
背景技术：
通过组织工程技术体外分离和培养所需的靶细胞用于体内相关疾病的细胞或组织替代治疗已为多种临床疾病的治疗提供了新的途径，近年来受到学者们的广泛关注和重视。但由于多种组织细胞的体外分离培养难度极大，限制了这一技术的开展和推广。骨髓间充质干细胞来源较广泛，取材较方便，并在不同诱导条件下，可分化为骨、软骨、腱、肌肉、韧带、血管内皮、肝、神经、皮肤和脂肪等多种组织细胞，分离培养较为容易，且植入反应较弱，是一种良好的替代治疗的靶细胞。在组织器官性损伤疾病、组织器官退行性疾病、遗传缺陷疾病等领域具有重要的应用前景。目前通过动物实验证实骨髓间充质干细胞单独应用可以较好地促进骨折愈合和软骨组织损伤修复，通过体外培养使其覆盖于陶瓷支架和碳纤维网等再植入患处效果更明显。国外还开展了将骨髓间充质干细胞用于治疗因I型胶原基因突变导致的儿童骨发育不良的临床实验。骨髓间充质干细胞移植还具有不发生免疫排斥反应或程度较低的优点且易于控制。骨髓间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还易于外源基因的导入和表达，因而，骨髓间充质干细胞有可能成为一种新型的基因治疗的靶细胞，这样再与其多向分化潜能相结合，通过导入目的基因，将细胞治疗和基因治疗结合起来，对上述疾病的治疗无疑将有更广阔的前景。
帕金森病是中枢神经系统常见的退行性疾病，其发病率仅次于阿尔茨海默病，位于第二位。本病基本上属于中、老年人的疾患，随着我国人口平均寿命延长和社会老龄化进程加速，其发病率呈明显上升势头，已成为一严重的社会问题，但其发病原因和致病机制至今还不完全清楚。其主要的病理生化学改变是位于中脑黑质致密区的多巴胺能神经元渐进性变性坏死，致使黑质-纹状体通路多巴胺神经递质水平下降，引起锥体外系的功能失调，从而导致以随意运动减慢、肌张力僵直、肢体震颤和正常的姿势平衡反射丧失为主的临床症状。长期以来，人们一直在寻找能够有效治疗帕金森病的方法，由于本病主要是源于多巴胺能神经元变性死亡而致，若能将合成和分泌多巴胺的细胞移植入黑质-纹状体系统，理论上讲是最为理想的治疗措施，可以起到治愈该病的作用。但这种疗法却存在难以克服的困难，主要限制因素是无法同时获得足够用于移植的胚胎组织，所以，寻找新的细胞来源已成为细胞替代治疗首要解决的问题。
研究人骨髓间充质干细胞的重要性主要是其潜在的治疗应用价值，目前，用于临床治疗的人间充质干细胞主要来源于骨髓。尽管骨髓样品易获取，但其中间充质干细胞含量较少，约占骨髓单个核细胞的10万分之一；特别是骨髓间充质干细胞在体外一定诱导条件下定向分化为多巴胺能神经元样细胞的比例较低，因此，获得充足、安全而合格的移植所需细胞是研究和应用骨髓间充质干细胞治疗帕金森病的前提条件。然而，目前还没有一种切实可行的生理方法来促进体外人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化。
氧是生命存在的必要条件，也是细胞生理功能的一种重要调节因子。而低氧是生命发育的基本环境，如哺乳动物的胚胎是在低氧环境中发育生长的；成体哺乳动物脑组织内的局部氧水平也只有1％～5％，骨髓中的氧浓度为4％～7％，均是一种生理性的低氧环境。然而，目前体外哺乳动物细胞培养的标准条件是在37℃下，5％二氧化碳和95％空气的混合气(氧含量是20％)。近年来关于低氧对骨髓间充质干细胞调节作用研究只有零星的报道，5％氧气可促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖，体内移植实验证实低氧能促进这些细胞向骨细胞的分化(Lennon DP.et al.Cultivation of rat marrow-derivedmesenchymal stem cell in reduced oxygen tensioneffects on in vitro and in vivoosteochondrogenesis.J Cell Physio1，2001，187345-355)。然而，迄今未见有关低氧对体外培养的人骨髓间充质干细胞向神经元方向分化影响的报道。
发明内容
本发明公开了一种提高人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化效率的新方法。
本发明的发明人在实验中意外的发现适宜的低氧浓度具有促进体外培养的人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化的作用，从而提高定向诱导分化的效率。
本发明的方法包括以下内容人骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定抽取胎儿股骨骨髓，移入含DMEM-LG培养基的离心管中，离心去脂肪及上清，向细胞团加入Percoll分离液，离心。取界面云雾状细胞层加入DMEM-LG，吹打成单细胞悬液，计数有核细胞，将细胞接种于25ml培养瓶中，进行常规原代培养和传代培养。
用免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞，当盖玻片上的细胞融合约50％时，取出盖玻片，用PBS冲洗，室温自然风干，酒精固定，蒸馏水洗；用TritonX-100和双氧水处理；滴加正常羊血清室温封闭；分别滴加一抗工作液和生物素化二抗；用DAB试剂盒室温显色；苏木精轻度复染，脱水、透明、中性树胶封片。
人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元样细胞将传代的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)按一定的密度接种，分2组，即对照组和诱导组。诱导组用含1mmol/L β-巯基乙醇、20％胎牛血清的DMEM-HG培养基预诱导24h，然后更换为含5mmol/L β-巯基乙醇、无血清的DMEM-HG培养基诱导5h。对照组不加诱导剂。用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤；非免疫性动物血清封闭，PBS洗涤；加入TH一抗，PBS洗涤；加入二抗，PBS洗涤；DAB溶液室温下反应显色。镜下观察到一些hMSCs在诱导剂作用下转变为神经元样形态，对照组细胞形态无明显变化；免疫组化显示，约8.63％的细胞TH染色阳性，对照组则无阳性结果。
低氧对人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元样细胞的作用将传代的hMSCs按一定的密度接种，分三组正常诱导组、预诱导+低氧组和预诱导、诱导+低氧组。用含1mmol/L β-巯基乙醇、20％胎牛血清的DMEM-HG培养基预诱导24h，然后更换为含5mmol/L β-巯基乙醇、无血清的DMEM-HG培养基诱导5h。预诱导+低氧组和预诱导、诱导+低氧组分别在预诱导期间和诱导的全过程将hMSCs放在含氧量为3％的低氧环境中培养。诱导后用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤；非免疫性动物血清封闭，PBS洗涤；加入TH一抗，PBS洗涤；加入二抗，PBS洗涤；DAB溶液室温下反应显色。镜下观察预诱导+低氧组和预诱导、诱导+低氧组hMSCs转变为神经元样形态的明显多于正常诱导组；免疫组化显示，预诱导+低氧组(16.57％)和预诱导、诱导+低氧组(24.88％)TH染色阳性细胞数均高于正常诱导组，预诱导、诱导+低氧组TH染色阳性细胞数高于预诱导+低氧组，统计均有显著性差异(P＜0.001)。
综上所述，低氧可促进人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化，提高这些细胞的定向诱导分化效率。利用环境中的低氧调节体外培养的人骨髓间充质干细胞的定向分化，具有实验流程简单，重复性强，结果可靠，在体外易调控，对骨髓间充质干细胞及其分化的多巴胺能神经元样细胞无损伤和毒副作用，实用性强等特点。
图1.为体外培养接近融合的人骨髓间充质干细胞形态图(×100)。
图2.为人骨髓间充质干细胞免疫细胞化学鉴定图(×400)。
图3.为人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞图(TH染色，×200)。其中A对照组；B诱导组图4.为低氧对人骨髓间充质干细胞定向分化为神经元样细胞的作用图。(*P＜0.001)图5.为人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞图(TH染色，×200)。其中A正常诱导组；B预诱导+低氧组；C预诱导、诱导+低氧组具体实施方式
实施例一人骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定1.人骨髓间充质干细胞的分离培养无菌抽取胎儿(6个月水囊引产胎儿，经产妇知情同意提供)股骨骨髓约1ml，移入含3ml DMEM-LG培养基(Hyclone公司产品)的无菌离心管中，900g离心5min。去脂肪及上清，向细胞团加入70％Percoll分离液(Pharmacia公司产品)，900g离心30min。取界面云雾状细胞层加入含20％胎牛血清的DMEM-LG，吹打成单细胞悬液，计数有核细胞，将细胞以105个/ml的密度接种于25ml培养瓶中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。24h后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，以后每3～4d换液一次。当细胞相互融合达到约90％的生长表面(见图1.)时，用0.25％胰蛋白酶消化分散细胞，以1∶3比例进行传代培养。
2.人骨髓间充质干细胞的鉴定当培养瓶中盖玻片上的细胞融合约50％时，取出盖玻片，0.01M PBS冲洗，室温自然风干，95％酒精固定30min，蒸馏水洗；0.2％TritonX-100处理10min，0.5％双氧水10min；滴加正常羊血清，室温封闭20min，甩去多余液体；滴加一抗工作液(小鼠抗人Vimentin，购自北京中山生物公司)，4℃过夜，0.01M PBS洗；滴加生物素化二抗，37℃ 20min，0.01M PBS洗；滴加SABC，370℃ 20min，0.01M PBS洗；用DAB试剂盒室温显色；苏木精轻度复染，脱水、透明、中性树胶封片。在显微镜下计数结果显示98％细胞Vimentin阳性(见图2.)。
实施例二人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元样细胞1.实验分组将第5代的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)按1×105/ml密度接种于35mm培养皿中，随机分成2组，分别为对照组和诱导组，每组10皿。
2.诱导方法用含1mmol/L β-疏基乙醇、20％胎牛血清的DMEM-HG培养基预诱导24h，然后用解剖液洗涤2遍，更换为含5mmol/L β-巯基乙醇、无血清的DMEM-HG培养基诱导5h。对照组不加诱导剂。
3.免疫细胞组化鉴定和细胞分化的定量分析诱导后用4％多聚甲醛固定细胞30min(室温)，0.1M PBS洗涤3遍；用非免疫性羊血清封闭，室温处理30min，0.1M PBS洗3遍；加入兔TH抗体，浓度1∶1000，4℃过夜；PBS洗3遍，加入抗兔IgG，4℃过夜；PBS洗3遍，用AB复合物1∶1000室温处理1h，PBS洗3遍；DAB溶液室温下反应显色。镜下观察细胞形态的变化，每皿从上下左右中5个方位分别选取2个视野计数TH阳性细胞，并计算其百分比例的平均数。最后计算出每组TH阳性细胞百分比例的平均值。镜下可见诱导组一些hMSCs在诱导剂作用下发生形态改变，原来的梭形细胞向核回缩，出现突起样变化，转变为神经元样形态，对照组细胞形态无明显变化；免疫组化显示，诱导组约8.63％的细胞TH染色阳性，呈黑色。对照组则无阳性结果(见图3.和图4.)。
实施例三低氧对人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元样细胞的作用1.实验分组将第5代的hMSCs按1×105/ml密度接种于35mm培养皿中，随机分成3组，分别为正常诱导组、预诱导+低氧组和预诱导、诱导+低氧组，每组10皿。
2.低氧条件的确定向自制细胞低氧培养箱内的密闭容器通入含3％O2、5％CO2和氮气平衡的混合气体，开始通气量为1L/min，持续通气30min后，调整至维持量0.1L/min继续通气，保持密闭容器内的氧含量为3％O2。
3.免疫细胞组化鉴定和细胞分化的定量分析诱导后免疫细胞组化鉴定和细胞分化的定量分析方法同上。组间比较用非配对Student’s T-test作统计学分析。
4.低氧对人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元样细胞的促进作用镜下可见预诱导+低氧组和预诱导、诱导+低氧组hMSCs转变为神经元祥形态的明显多于正常诱导组；免疫组化结果显示，预诱导+低氧组和预诱导、诱导+低氧组TH染色阳性细胞数平均值分别为16.57％和24.88％，均高于正常诱导组，预诱导、诱导+低氧组TH染色阳性细胞数高于预诱导+低氧组，统计均有显著性差异(P＜0.001)(见图4.和图5.)。
权利要求
1.一种提高人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化效率的新方法，其特征在于采用低氧环境，促进体外培养的人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的诱导分化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的低氧环境为氧浓度低于20％的环境。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于低氧环境中氧的浓度为3％至10％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于低氧环境中的氧浓度为3％。
全文摘要
本发明公开了一种提高人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化效率的新方法。本发明通过适宜的低氧浓度对诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化进行调节，使这些细胞向多巴胺能神经元样细胞转化的效率得到提高。通过本发明的方法，采用一种可调控的无损伤的物理手段，体外调节人骨髓间充质干细胞的分化，实现少量取样、体外扩增和诱导分化、大量获取所需细胞，进而实现应用人骨髓间充质干细胞治疗帕金森病，具有较好的经济效益和社会效益。
文档编号C12N5/08GK1752208SQ20041000959
公开日2006年3月29日 申请日期2004年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者李海生, 赵彤, 朱玲玲, 张翠萍, 丁爱石, 范明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所