专利名称：一种人工合成的蝎氯离子通道神经毒素基因－rBmK CTa的制作方法
技术领域：
本发明涉及突变和遗传工程，具体属于DNA重组技术，更具体的说是一种改良的蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa及其该基因的表达。
背景技术：
中国蝎约有15种，其中分布最广、数量最多者为东亚钳蝎(Buthus martensii)。在我国，自1981年以来，对东亚钳蝎的研究取得了一些进展。已纯化了部分蝎毒素、测定部分一级结构、研究了药理和生理作用及对细胞膜的影响，还从蝎毒中纯化到许多具有较高抗癫痫活性多肽(Anti-epilepsy peptide，AEP)(Wang，C.G.，European Journal ofBiochemistry，2001，2682480)。
神经胶质细胞是人脑中易发生癌变的细胞。神经胶质瘤细胞以高扩散性和广泛多样的组织学特性而著称。近年许多研究发现表明，从东亚钳蝎中提取的氯离子通道毒素可通过一种途径有效的防止神经胶质瘤细胞的扩散(Deshhane，J.等，J.Biol.Chem.2003，278(6)4135-4144)。第一个氯离子通道毒素基因Bm-12由Wu，J.等克隆得到(Toxicon，2000，38661-668)，与此同时，国内的另一个课题组Zeng，X.C.等(Toxicon，2000，381009-1014)也从东亚钳蝎尾腺的cDNA文库中得到该基因，并命名为BmK CT。这段由35个氨基酸、四对二硫键组成的短肽与从以色列蝎L.quinquestriatus蝎中提取的小电导氯离子通道抑制剂蛋白的同源性为66％。这条短肽如何选择性地与氯离子通道结合并发生作用有待于进一步的研究。
正是由于蝎神经毒素所具有的特异活性和高度选择性，它作为重要的工具已被日益广泛地应用于神经生物科学中涉及到的相关靶离子通道蛋白成分的鉴定与纯化、毒素与受体位点结合的特异性和敏感性、以及受体调控胞内递质释放和信息传输的分子机制等生命现象的基础理论研究。另一方面，它们作为未来的新型药物也正显示出十分诱人的应用前景。
但从蝎粗毒中提取单一纯蛋白不仅步骤繁琐，而且量少，远远不能满足科研和医疗生产需要，尤其是对那些在天然粗蝎毒中含量少的毒素，目前还没有大量获得其纯蛋白的有效途径。本发明采用PCR技术和基因工程技术，可获得大量较纯的氯离子通道蝎毒素。不仅为传统中医学用蝎毒制药提供充足的来源，而且还可用于神经化学、蛋白质化学、蝎毒的毒理学、药理学等研究。
发明内容
本发明根据已报道的天然蝎氯离子通道神经毒素的序列(Zeng，X.C.等Toxicon，2000，381009-1014)，设计了适合在大肠肝菌中表达该基因的DNA序列，并在大肠杆菌中大量表达重组蝎氯离子通道神经毒素。
1、基因序列根据本发明的目的，提供了一种改良的蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa，其核苷酸序列为ATG TG GG CC TGC TT AC AC GA GCT AA ATG GC AG AAA TG AG GAA TG TG GG GGT AT GG AAA TGC TT GG CC CA TG CTGTG AAC CGT AT TGA(其中方框中的碱基为根据大肠杆菌偏爱密码子而设计，原始序列见附图1A)2、获得该基因序列的方法另外本发明提供一种重组蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa的合成方法，包括步骤I.设计6个寡聚脱氧核糖核酸序列(见附图1C)；II.人工搭桥法合成蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmK CTa；上述步骤中首先合成一系列的寡聚脱氧核糖核酸，其中所述的寡聚脱氧核糖核酸为2个正向顺序，2个为反向顺序；2个为接头引物，分别带有EcoRI和BamHI酶切位点。
采用多聚酶链式反应(PCR)技术进行该基因的人工搭桥法合成(见附图2)。DNA序列分析确认该合成基因的正确性(见附图3)。
3、rBmK CTa的表达、纯化方法本发明还提供一种重组蝎氯离子通道神经毒素的表达方法，其步骤包括i.将合成的蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa克隆在表达载体中；ii.用热休克法将该重组质粒转化宿主细胞中；iii.筛选得到转化菌株；iv.诱导表达出重组蝎氯离子通道神经毒素。
将上述人工搭桥法合成的重组蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa克隆在表达载体原核表达载体pExSecI中，获得重组表达质粒pExSecI-rBmK CTa(见附图4)。用热休克法将该重组质粒转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)，筛选得到转化菌株，用IPTG诱导(本实施例中，诱导条件为0.4mM IPTG，16℃诱导4小时)，获得重组蝎氯离子通道神经毒素的表达产物。提取其总蛋白，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和胶图扫描灰度分析(GeneTools software，U.S.A)后，分析该蛋白表达量占菌体总蛋白的百分含量。rBmK CTa基因表达产物占大肠杆菌总蛋白的19.936％，还包括纯化步骤，从一升培养液中可纯化得到2.4mg该重组蛋白，而对照基因BmK CT的表达量仅为9.116％(见附图5，6)，表明改良后的蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa与原始基因BmKCT相比在大肠杆菌中表达量提高50％以上。
重组蝎氯离子通道神经毒素的纯化步骤主要是将上述在大肠杆菌中诱导表达出的总蛋白过IgG Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱，得到纯蛋白并经Western blot鉴定分析，表明所得蛋白为蝎氯离子通道神经毒素。
4、rBmK CTa表达产物的用途利用本发明获得的重组蝎氯离子通道神经毒素对神经胶质细胞的具有抑制作用。可用于制备通过抑制神经胶质细胞可以治疗的疾病的药物，也可用于蝎神经毒素空间结构及药理学活性等研究。
本发明实施中对神经胶质细胞的活性检测采用MTT法，将从乳鼠脑部提取的神经胶质细胞，加入96孔培养板中，以不同蛋白浓度梯度的重组蝎氯离子通道神经毒素进行处理，在培养箱中培养后，加入MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)，培养后置于酶标仪中测量490nm处的吸收值，抑制率的计算方法为1-(处理组OD490/未处理组OD490)。利用Sigma blot软件得到抑制率与处理蛋白浓度之间的回归曲线。具体操作见实施例4，测得的半抑制剂量(IC50)为45μM。
附图1A原BmK CT基因序列(Zeng，X.C.等Toxicon，2000，381009-1014)；附图1B根据大肠杆菌偏爱密码子原则，将24个位点突变而成的rBmK CTa基因序列和氨基酸序列；附图1C设计的6条引物序列。
附图2搭桥法合成rBmK CTa基因示意图。
附图3rBmK CTa测序报告结果。
附图4pExSecI-rBmK CTa重组质粒构建图。
附图5rBmK CTa基因表达产物SDS-PAGE分析图及灰度扫描分析图。
附图6rBmK CTa基因表达产物灰度扫描分析图。
附图7rBmK CTa蛋白的纯化结果与Western blot鉴定。
附图8rBmK CTa蛋白对神经胶质细胞的抑制活性鉴定曲线图。
具体实施例方式实施例1、改良基因的人工合成根据天然BmK CT基因合成6条寡聚脱氧核糖核酸的序列(见图1C)。其中Primer1、2为正向引物，Primer3、4为反向引物，BmK CT(EcoRI)、BmKCT(BamHI)为两端接头引物，分别带有EcoRI、BamHI酶切位点，以便与pExSecI表达系统连接。
用Primer1与3、2与4分别作PCR，后将两个产物进行末端平滑化。混合后PCR得到rBmK-CTa基因。将其克隆到pGEM-T Easy中，测序(见图2，3)。
实施例2、重组表达质粒构建用引物BmK CT(EcoRI)、BmKCT(BamHI)扩增rBmK-CTa基因，然后用EcoRI、BamHI酶切，与经相同酶切的表达载体pExSecI连接(见图4)。
实施例3、重组蝎氯离子通道神经毒素rBmK CTa的诱导表达与纯化重组质粒pExSecI-rBmK CTa转化大肠杆菌BL21(DE3)，经0.4mM IPTG，16℃诱导4小时，SDS-PAGE电泳检测到该基因的大量表达，占全菌蛋白的19.936％，而对照基因BmK CT的表达量仅为9.116％(见附图5，6)，表明改良后的蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa与原始基因BmK CT相比在大肠杆菌中表达量提高50％以上。
经IgG-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia biotech，Sweden)亲和层析，得到较纯蛋白，从一升培养液中可纯化得到2.4mg该蛋白(见图7A)。Western blot鉴定为rBmK CTa基因表达产物(见图7B)。抗体为蝎毒总蛋白抗体。
实施例4、活性检测rBmK CTa蛋白对神经胶质细胞抑制活性检测实验采用MTT法，具体过程如下将从乳鼠脑部提取的神经胶质细胞(缓冲液为标准细胞外液，ES)按每孔5×104个细胞加入96孔培养板中，以从0.24μM到240μM的蛋白浓度梯度进行处理，在37℃的CO2培养箱中培养24小时后，加入5mg/ml的MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)15μl，培养4小时后置于酶标仪(BIO-RAD 550，U.S.A)中测量490nm处的吸收值，抑制率的计算方法为1-(处理组OD490/未处理组OD490)。利用Sigmablot软件得到抑制率与处理蛋白浓度之间的回归曲线。
活性检测表明表达纯化的rBmK CTa蛋白对神经胶质细胞具有抑制活性，测得的半抑制剂量(IC50)为45μM(见图8)。
核苷酸及氨基酸序列表<110>山西大学<120>一种人工合成的蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmK CTa<160>2<210>1<211>111<212>DNA<213>东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)<223>n＝a或g或c或t<221>CDS<222>(1)...(111)<400>1atg tgc ggt ccg tgc ttc act act gac gct aac atg gct aga aaa tgc 48Met Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala Arg Lys Cys1 510 15aga gaa tgc tgt ggt ggt atc ggt aaa tgc ttc ggt ccg cag tgc ctg 96Arg Glu Cys Cys Gly Gly Ile Gly Lys Cys Phe Gly Pro Gln Cys Leu20 25 30tgc aac cgt atc tga 111Cys Ash Arg Ile ***35<210>2<211>36<212>PRT<213>东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)<400>2Met Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Ash Met Ala Arg Lys Cys1 5 10 15Arg Glu Cys Cys Gly Gly Ile Gly Lys Cys Phe Gly Pro Gln Cys Leu20 25 30Cys Asn Arg Ile***3权利要求
1.一种改良的蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa，其核苷酸序列为ATG TGC GGT CCG TGC TTC ACT ACT GAC GCT AAC ATG GCT AGAAAA TGC AGA GAA TGC TGT GGT GGT ATC GGT AAA TGC TTC GGTCCG CAG TGC CTG TGC AAC CGT ATC TGA
2.权利要求1所述基因的合成方法为i.设计6个寡聚脱氧核糖核酸序列；ii.人工搭桥法合成蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmK CTa；
3.权利要求2的方法，其中所述的寡聚脱氧核糖核酸为2个正向顺序，2个为反向顺序；2个为接头引物，分别带有EcoRI和BamHI酶切位点。
4.一种重组蝎氯离子通道神经毒素的表达方法，其步骤包括i.将权利要求1所述的蝎氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa克隆在表达载体中；ii.用热休克法将该重组质粒转化宿主细胞中；iii.筛选得到转化菌株；iv.诱导表达出重组蝎氯离子通道神经毒素。
5.权利要求4的方法，还包括重组蝎氯离子通道神经毒素的纯化步骤。
6.权利要求5所述的方法为过IgG Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱。
7.权利要求4所述的含有rBmK CTa基因的重组表达载体，其特征在于将rBmK CTa基因克隆至原核表达载体pExSecI后，获得的重组表达质粒是pExSecI-rBmK CTa。
8.权利要求4所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。
9.权利要求4所述的rBmK CTa的表达方法获得的重组蝎氯离子通道神经毒素对神经胶质细胞的抑制作用。
10.权利要求4所述表达方法获得的重组蝎氯离子通道神经毒素可用于制备通过抑制神经胶质细胞可以治疗的疾病的药物。
11.权利要求4所述表达方法获得的重组蝎氯离子通道神经毒素，可用于蝎神经毒素空间结构及药理学活性等研究。
全文摘要
依据大肠杆菌偏爱密码子的原则，将天然蝎氯离子通道神经毒素BmK CT基因进行24个位点的突变，设计了适合在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的DNA序列，采用PCR技术完成了重组蝎氯离子通道神经毒素rBmK CTa基因的人工合成。在此基础上，将此基因克隆到pExSecI表达系统中，转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选得到高效表达的菌株，SDS－PAGE电泳检测到该基因的表达产物占全菌蛋白的19.936％。经亲和层析，得到较纯的具有生物学活性的蛋白，从一升培养液中可纯化得到2.4 mg蛋白。采用本基因工程所得的改良的重组蝎氯离子通道神经毒素对神经胶质细胞具有抑制作用，可用于制备通过抑制神经胶质细胞可以治疗的疾病的药物，也可用于蝎神经毒素空间结构及药理学活性等研究。
文档编号C12N15/11GK1597951SQ20041001254
公开日2005年3月23日 申请日期2004年9月22日 优先权日2004年9月22日
发明者梁爱华, 付月君, 王伟, 柴宝峰, 张志云 申请人:山西大学