猪免疫性状相关基因psmb6的克隆及其应用的制作方法

专利名称：猪免疫性状相关基因psmb6的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜基因工程技术领域，具体地说涉及猪的与免疫性状相关基因PSMB6部分基因组的基因克隆以及利用克隆的基因作为猪的分子标记辅助育种的应用。
背景技术：
现代育种技术使猪的生产性能得到了显著的改良，然而高产目标通常导致猪抵抗性降低。随着人民生活水平的提高，畜牧生产的重点已经转移到提高瘦肉组织的生长效率、改良肉质、提高产品的抗逆性，从而降低单位产品的生长成本，并且减少药物残留，提高畜产品的质量，与国际接轨。
个体免疫力是衡量动物健康的重要指标(Knapp等，Relationships between genetics changes andinfections disease in domestic livestock，(eds.Hill W G，Bishop S C，McGuirk B.，)brit.Soc Anim Sci.，Edinburgh Occasional publication NO.27，65-80.2000)，它属于数量性状，其中涉及相关基因较多，分子机制很复杂。目前，猪免疫能力与生产性能间的相互关系仍然不清楚，因此从分子水平上揭示出生产性能和免疫力的控制基因间的相互关系是关键，同时为家畜的抗病育种提供了新的思路。
病原体在传染过程中，会遇到机体的3道防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制。当个体受到病原体侵染时，会调动这3方面的防御机制加以抵抗。猪是否发病取决于侵染和防御机能相互作用的结果，防御机能加强的猪便表现出自然抗病力。抗病力按遗传基础的不同可分为特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指猪对某种特定疾病或病原体的抗性，这种抗性主要受一个主基因位点控制，也可程度不同地受其它位点(包括调控子)及环境因素影响。，现有的研究结果表明，特殊抗病力的内在机理在于宿主体内存在或缺少某种子分子或其变体，这种分子有以下作用决定异体识别及特异性异体反应在；决定病原体的特殊附着力；病原体进人体内后在体内增殖，决定能否导致宿主发病。一般抗病力不限于抗某一种病原体，它受多基因和环境的综合影响，病原体的抗原性差异对一般抗病力影响极小，甚至根本没有影响，这种抗病力体现了机体对疾病的整体防御功能。如鸡的MHC与马立克病、球虫病及罗斯肉瘤等病的抗性和敏感性有关，研究得较清楚的是猪大肠杆菌K88和F18受体基因(唐国庆等，猪抗病育种研究进展)。
抗病性主要组织相容性复合体(Major Hlstocompatiblllty complex，MHC)是与抗病性和免疫应答密切相关的一组基因群，编码细胞表面特异性蛋白，存在于所有较高等的动物中。猪的MHC(命名为SLA)位于猪的7号染色体上(Warner，Mapping of C2，Bf，and C4 genes to the swinemajor histocompatibility complex.J.Immunology.1987，1393388-3395)，包括1型和II型基因，其中1型基因具有极强的多态性。Rothschild实验室长期从事猪SLA基因单倍型与猪初生重、生长速度、背膘厚等性状有关等性状的研究，他们认为SLA基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(Rothschild MF，Identification of quantitative trait loci and interesting candidategenes in the pigprogress and prospects.Proc 6th WCGALP 1998，26403-409)。Mallard等(1998)在经过8代选择形成的猪高免疫应答(H系)和低免疫应答(L系)品系中发现H系比L系早10d达到上市体重。研究表明猪的SLA与多种生产性状均有连锁(Draper，D.D.，Effects ofdivergent selection for leg weakness on bone and muscle cross-sectional areas in Durocswine.Am.J.Vet.Res.1991，52164-168；Stalder，K.J.，Maternal swine trait geneticparameter estimates measured on Landrace females with known porcine stress syndromegenotypes.J.Anim.Breed.Genet.1998，115199-209)，这些结果同猪的SLA与生长、背膘和繁殖性状间的联系多呈正相关。
PSMB6基因编码26S蛋白酶体的核心20S蛋白酶体的亚基。26S蛋白酶体是泛素-蛋白酶体的蛋白水解途径中的必要组成成分，蛋白酶体还参与MHC-classl抗原提呈，并且调节其活性。
人的PSMB6基因，它的结构和功能已有研究报道(Takezaki N等，Sequencing of amphioxusPSMB5/8 gene and phylogenetic position of agnathan sequences，Gene.2002 Jan9；282(1-2)179-187；Kohda K等，Structural analysis and chromosomal localization of themouse Psmb5 gene coding for the constitutively expressed beta-type proteasomesubunit，ImmuNOgenetica.1997；47(1)77-87)。PSMB6基因有6个外显子，5个内含子组成。人的PSMB6基因定位在HAS17p13(NCBI，ENTREZ，NT_010692)，用RH克隆板扩增猪的PSMB6的基因组DNA片段，猪的PSMB6基因被定位在猪12q13。
PSMB6基因除了参与泛素-蛋白酶体途径的蛋白水解，还参与其他的代谢途径。但是PSMB6基因的功能研究还不是很透彻，研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段，因此申请人对这个基因进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它的功能和应用在猪的分子标记辅助育种上。

发明内容
本发明的目的在于克隆猪PSMB6基因的部分基因组DNA序列，寻找PSMB6基因的突变位点以及基因多态性的检测方法，建立适用于猪免疫性状的分子标记的方法。
本发明通过以下技术方案实现一种猪免疫性状相关基因PSMB6，它的部分基因组DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述，它的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO2，序列表SEQ ID NO3。所述的基因，所获得的PSMB6基因部分DNA序列为587bp，其中包含如附图2所述的部分外显子1，部分的外显子2和完整的内含子1的序列。
序列表SEQ ID NO1的第72位碱基处有一个碱基突变(72A-72C)，导致EcoO109I-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性；序列表SEQ ID NO1的第300位碱基处有一个碱基突变(300T-300G)，导致EcoRI-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性。
这两个碱基突变分别位于PSMB6基因第1外显子和第一内含子中，外显子的碱基突变引起氨基酸序列的改变(脯氨酸变为组氨酸)。
一种筛选猪免疫性状相关的分子标记的方法，它按照下列步骤
用人PSMB6基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；根据与人PSMB6基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物；从猪血液基因组提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
应用PCR-RFLP的方法检测猪PSMB6基因72A-72C和300T-300G的多态性，并初步进行其基因型与猪的部分免疫性状及生长性状之间的关联分析。本发明为猪的分子育种提供了两个新的遗传标记。
依照本发明，所述得猪免疫性状相关基因PSMB6可以应用于猪得标记辅助育种上。
详细技术细节如下所述1、PSMB6基因部分DNA序列的克隆(1)引物设计用人PSMB6基因cDNA(GenBank收录号NM_002798)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计扩增引物。序列如下5’-GTAACGGAGGATGAAGATGG-3’(正向)5’-CAGTGGTTGTTCTGGAGTCG-3’(反向)(2)PCR产物的纯化、克隆和测序PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mlEpendorff管中，于70℃水浴至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入lml Resin，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30～50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。
连接反应将纯化RACE产物与pGEM-T载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl2×buffer，0.5μl的T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。
感受态细胞的制备从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3～0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
转化无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
质粒的小量制备挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5mlEP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mMTris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II
200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III[5M 乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H2O28.5ml]150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚氯仿异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
重组质粒的酶切鉴定取3μl质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为15μl，加入2-3U限制性内酶EcoR I及2μl相应的10X限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。
(3)DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechNOlogy Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
2、PCR-RFLP诊断方法建立(1)引物序列 5’-GTAACGGAGGATGAAGATGG-3’ (正向)5’-CAGTGGTTGTTCTGGAGTCG-3’ (反向)该引物扩增片段长度587bp。
(2)PCR扩增条件PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94℃ 4min，然后循环35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3～5μl，限制性内切酶EcoO109I或EcoRI为0.5μl(5U)，用H2O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
3、标记性状关联分析在利用申请人组建的中国湖北省通城猪群做性状关联分析，96个DNA样品用于基因型检测。
所分析的性状有部分免疫性状，部分生产性能，部分肉质性状。申请人建立了如下最小二乘模型yijk＝μ+GENOTYPEi+SEXj+COMBINATIONk+εijk，其中，yijk是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPEi为基因型效应，SEXj为性别效应，COMBINATIONk为组合的效应，εijk为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
本发明的效果1、猪PSMB6基因部分DNA序列的克隆PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR产物的长度为587bp。其中包括部分外显子1，完整的内含子1，和部分的外显子2的序列。内含子序列均符合GT-AG规则。
2、PCR-RFLP诊断方法建立用引物扩增猪基因组DNA得到了587bp特异性扩增片段，包括部分外显子1和部分外显子2序列以及完整的内含子1的DNA序列(详见图2)。
序列分析结果表明在120bp处存在1个EcoO109I酶切位点(G/A↓GGNCCC/T)，该基因座由两个等位基因控制，A等位基因只有587bp一个片段，C等位基因有72bp+515bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型AA，AC，CC(见图3)。
序列分析结果表明在300bp处存在1个EcoRI酶切位点(G↓AATTC)，该基因座由两个等位基因控制，T等位基因只有587bp一个片段，G等位基因有287bp+300bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型TT，TG，GG(见图4)。
3、标记性状关联分析3.1猪PSMB6基因EcoO109I-RFLP多态性与免疫性状及部分生产性状之间的关联分析对猪PSMB6基因EcoO109I-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在90个个体中CC基因型有10个，AC基因型有22个个体，AA基因型有58个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有免疫性状，部分生产性状和肉质性状。不同基因型之间性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)总结于表1。其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。
表1PSMB6基因第一外显子EcoO109I-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

由表1可见AA基因型的DTH(PHA刺激迟发型皮肤超敏反应)性状，初生重及背膘厚均高于AC，CC基因型，以AC基因型对应值居中间，CC基因型最低。
3.2 猪PSMB6基因EcoRI-RFLP多态性与免疫性状及部分生产性状之间的关联分析对猪PSMB6基因EcoRI-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在90个个体中GG基因型有3个，GT基因型有19个个体，TT基因型有68个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有免疫性状，部分生产性状和肉质性状。不同基因型之间性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)总结于表2。其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。
表2不同PSMB6基因第1内含子EcoRI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

由表2可知，GG基因型的白细胞计数与超敏反应性状显著高于GT，TT基因型(P＜0.05)，而且肌内脂肪含量也高于后者(P＜0.05)，可见在这三个性状上可以初步说明GG基因型的猪的肉质性状和免疫力性状都是比较好的；与此不同的是，杂合基因型的猪的IgG1水平最高，有明显的杂合效应。对背膘厚来说，GG基因型组合极显著的高于GT，TT组合。(P＜0.05)。
序列表

序列表SEQ ID NO1是本发明克隆的猪免疫性状相关基因PSMB6的部分DNA序列，包括；克隆的用PCR-RFLP检测猪免疫相关基因PSMB6多态性的引物序列。
图1是本发明的技术流程图。
图2是猪PSMB6基因部分DNA序列。大写字母分别为外显子1，2。小写字母分别为内含子1。内含子序列的起始结尾(GT/AG)用黑体标出，引物的位置用方框显示(在提供的序列表1中已经给出了内含子1和引物的具体位置)。
图3EcoO109I-RFLP的示意图。
图4EcoRI-RFLP的示意图。
具体实施例方式
实施例1PCR-RFLP-EcoO109I多态性在6个猪品种(品种为中国血统地方猪种梅山、藏猪、二花脸、通城猪、清平猪和欧洲血统猪种大白)中的分布情况(1)引物序列5’-GTAACGGAGGATGAAGATGG-3’(正向)5’-CAGTGGTTGTTCTGGAGTCG-3’(反向)(2)PCR扩增条件PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。
扩增程序94℃ 4min，然后循环35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)RFLP检测条件酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 10μl，PCR产物3～5μl，限制性内切酶EcoO109I为0.5μl(5U)，用H2O补足10μl，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
表3 PCR-RFLP-EcoO109I多态性在6个猪品种中的分布

根据表3的基因型和基因频率的结果显示，在所检测的6个猪品种中，藏猪的两个等位基因频率相差不大，其余的5个品种均为A等位基因占优势。
实施例2对猪PSMB6基因EcoO109I-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在90个个体中CC基因型有11个，AC基因型有36个个体，AA基因型有43个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有免疫性状，部分生产性状和肉质性状。不同基因型之间性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)总结于表1。其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。
表4 PSMB6基因第1外显子EcoO109I-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

由表4可见AA基因型的DTH(PHA刺激迟发型皮肤超敏反应)性状，初生重及背膘厚均高于AC，CC基因型，以AC基因型对应值居中间，CC基因型最低。
实施例3PCR-RFLP-EcoRI多态性在中国血统猪种小梅山，二花脸，清平猪，民猪，通城猪和欧洲血统猪种大白猪中的分布情况。
表5 PCR-RFLP-EcoRI多态性在6个猪品种中的分布

这6个猪种中，T等位基因在大白猪中占绝对优势，在小梅山，通城猪及清平猪中明显高于G等位基因，以大白猪中T等位基因频率最高；而在黑龙江民猪中，G等位基因却占优势；在二花脸品种中，G，T两个等位基因的频率相比差异不是很大。
实施例5PSMB6基因第一内含子EcoRI-RFLP不同基因型与部分生产性状的关联分析。
表6 PSMB6基因第一内含子EcoRI-RFLP不同基因型与部分生产性状的关联分析

由表6可知，GG基因型的白细胞计数与超敏反应性状显著高于GT，TT基因型(P＜0.05)，而且肌内脂肪含量也高于后者(P＜0.05)，可见在这三个性状上可以初步说明GG基因型的猪的肉质性状和免疫力性状都是比较好的；与此不同的是，杂合基因型的猪的IgG1水平最高，有明显的杂合效应。对背膘厚来说，GG基因型组合极显著的高于GT，TT组合。(P＜0.05)。
猪免疫性状相关基因PSMB6序列表(SEQUENCE LISTING)<110>华中农业大学<120>猪免疫性状相关基因PSMB6的克隆及其应用<130>
<141>2004-06-07<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>587<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
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Asp His Tyr His Gly Arg Ala Ile Arg Trp Gly Arg Gly40 45 50tct agg agc cga ctc cag aac aac cac tg587Ser Arg Ser Arg Leu Gln Asn Asn His55 60
权利要求
1.一种猪免疫性状相关基因PSMB6基因，它的部分基因组DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所获得的PSMB6基因部分基因组序列共587bp，其中包含如附图2所述的完整内含子1的序列，部分外显子1和部分的外显子2的序列。
3.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO1的第72位碱基处有一个碱基突变(72A-72C)，导致EcoO109I-RFLP多态性；
4.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO1的第300位碱基处有一个碱基突变(300T-300G)，导致EcoRI-RFLP多态性。
5.权利要求1所述的基因，检测72A-72C和300T-300G碱基处碱基突变的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO2和序列表SEQ ID NO3所述。
6.制备如权利要求1所述的基因组DNA序列的方法，其特征按照以下步骤用人PSMB6基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；根据与人PSMB6基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物；从猪血液基因组提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.应用PCR-RFLP的方法检测猪PSMC5基因的EcoO109I-RFLP和EcoRI-RFLP多态性。
8.权利要求1-6任一项所述的猪免疫性状相关基因PSMB6在猪分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种与猪免疫性状相关基因PSMB6克隆及其在猪遗传育种技术领域作为辅助选择的应用。克隆了猪免疫性状相关基因PSMB6的部分基因序列，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所示，该序列全长为587bp，其中包含如附图2所述的完整内含子1的序列，部分外显子1和部分的外显子2的序列。序列表SEQ ID NO1的第72位碱基处有一个碱基突变(72A－72C)，导致EcoO109I－RFLP多态性；序列表SEQ IDNO1的第300位碱基处有一个碱基突变(300T－300G)，导致EcoRI－RFLP多态性。应用本发明分别对原产于中国地方猪种和欧洲的血统的猪种进行了相关检测，肯定了本发明用于猪遗传辅助选择的效果。本发明还提出了制备上述基因和用于检测应用的方法。
文档编号C12P19/34GK1715406SQ20041001338
公开日2006年1月4日 申请日期2004年6月29日 优先权日2004年6月29日
发明者李奎, 吴潇, 刘榜, 余梅, 樊斌, 朱猛进, 熊统安, 王彦芳 申请人:华中农业大学