一种植物金属硫蛋白双聚体的制备方法

专利名称：一种植物金属硫蛋白双聚体的制备方法
所属领域本发明是一种利用分子生物学技术制备植物金属硫蛋白双聚体的方法。
背景技术：
自从美国哈佛医学院B.L.Vallee博士于一九五七年首先从哺乳动物体内发现金属硫蛋白(Metallothionein简称MT)以来，科学家们相继在植物(PurdueUniversity，West Lafayette，IN 47907.Regulation and function of metallothioneingenes in plants)、微生物、以及海洋生物中发现和证明了存在具有相似结构和生理功能基本一致的金属硫蛋白(Classification of Metallothionein，P.-A.Binz，J.H.R.Kgi，1999)。金属硫蛋白是一类分子量小，含有丰富巯基，是至迄今为止所发现的在自然界生命有机体中清除自由基最强的活性多肽(Binz P.-A.(1996)UniversityZürich，Zürich，Switzerland.Binz P.-A. & Kgi J.H.R.(1996)poster presentation，Protein Science 6，suppl.1，p 68)。金属硫蛋白能为生物体提供多种生命活动中必需的微量元素(如锌、铜、钴等)，并具有拮抗重金属(隔、汞和铝)，抗辐射(包括紫外线)和修复受损组织等功效(Carrasco，J.，Penkowa，M.，Giralt，M.，Camats，J.，Molinero，A.，Campbell，I.L.，Palmiter，R.D.，Hidalgo，J.Role of metallothionein-IIIfollowing central nervous system damage.Neurobiol.Dis.13(1)22-36.(2003)。除了可以开发各种治疗药物外，金属硫蛋白还可以作为多功能食品的添加剂、必需微量元素补充液、功能性口服液、和其它多种保健化妆品等(www.iflorae.com/jinlip/gongsimt.htm)。植物金属硫蛋白基因到目前为止发现存在三种主要类型。用于此设计的为类型2(plant metallothionein type II)，发现于芥菜属，其cDNA克隆基因序列(见附

图1-1a)和氨基酸序列(见附图1-1b)。在植物金属硫蛋白分子中，根据半胱氨酸的常见分布规律可划分为三个序列区域区域(1)中半胱氨的序列分布为SCCGGnCGCGsgCkCgnGCgGCkmy；区域(2)序列中没有发现半胱氨酸的分布；区域(3)中半胱氨的序列分布为gCKCGsxC[kt]C[dn]PCxC。半胱氨酸的重复分布规律序列为；CC，CXC和CXXXC，两个保守序列区域(1)和(3)分布于分子两端，形成哑铃状，富含巯基(-SH)，与哺乳动物金属硫蛋白分子中半胱氨酸的重复分布规律一致。植物金属硫蛋白类型2(typeII)有十四个半胱氨酸(Cys)，是目前发现在植物蛋白中含有巯基数目最多的类型。

发明内容
本发明利用植物金属硫蛋白基因通过构建基因载体技术在大肠杆菌中得到高效表达植物金属硫蛋白双聚体。其特点是1)可制备成本低廉、高纯度的植物金属硫蛋白双聚体；2)具备哺乳动物金属硫蛋白的基本功能；3)没有哺乳动物的异种蛋白；4)不易形成环境污染；5)生产周期短。基因的构建整合利用了开发型质粒(pQe30)载体系统。用这个载体表达系统可以高效率表达并可制取高纯度植物金属硫蛋白双聚体。技术路线和方法包括植物金属硫蛋白基因的选择；PCR引物的设计；质粒选择；菌种的选择及植物金属硫蛋白双聚体的分离纯化。
具体实施例方式
所述的一种植物金属硫蛋白双聚体的制备方法，其特征包括(1)利用基因工程技术构建植物金属硫蛋白双聚体基因序列，选择开发性质粒pQe系列，其中的六个组氨酸连续基因序列与植物金属硫蛋白双聚体基因序列相融合并在特选大肠杆菌菌种(Rosetta gami)中来表达植物金属硫蛋白双聚体。(2)植物金属硫蛋白双聚体工程菌在LB培养液中于常规温度培养18-20小时，稀释菌在常规温度培养至OD 0.6-1.2，迅速冷却至16-28口后加入IPTG在16-28口中诱导培养18-24小时。然后离心收集菌体，用缓冲液悬浮菌体，破碎菌体，再离心，上清液与镍琼脂糖在4℃中进行亲和吸附一小时，然后上柱洗脱、收集馏分、脱盐后即可得到植物金属硫蛋白双聚体。
所述构建植物金属硫蛋白双聚体基因序列，其特征是可利用下列引物来构建植物金属硫蛋白双聚体基因序列。
意义链引物CAGGGTACCATGGCTTGCTGTGGAGG反意义链引物CGTGGTGGTACCTTTGCAGGTGCAAGGG。
1、植物金属硫蛋白双聚体的基因序列构建植物金属硫蛋白双聚体的基因构建是在单体基因两端分别用限制性内切酶BamHI/KpnI和KpnI/PstI酶解形成粘端(见附图2-2a)，然后用DNA聚合酶作用形成植物金属硫蛋白双聚体基因(见附图2-2b)。同时，在选择的pQe30质粒载体中用限制性内切酶在BamI和PstI的酶切位点上移去部分序列，转接植物金属硫蛋白双聚体基因。此设计方法可衍生植物金属硫蛋白多聚体基因。植物金属硫蛋白双聚体的引物序列(见附图3)和氨基酸序列(见附图4)。
2、质粒的选择pQe30质粒载体系统是为克隆和表达6xHis(组氨酸)融合蛋白设计的，它共有346 l对碱基的环状DNA(由海得堡大学植物系分子生态学实验室提供)，具有胺汴青霉素(Ampicillin)抗性基因。由N段开始的启动子基因(T5)，翻译的编译密码依次是；六个连续的组氨酸序列，BamI---PstI碱基序列和停止密码。pQe30质粒载体系统具有活性极强的启动子并易于转接基因而不含其它融合蛋白。由于pQe30质粒载体系统有六个连续的组氨酸序列，可以用其与镍琼脂糖专一亲和的特点来分离所诱导的植物金属硫蛋白双聚体。
3、菌种的选择大肠杆菌(Rosetta gami)为上述植物金属硫蛋白双聚体基因载体质粒的特选宿主菌株，其特点是能同时提供六种稀有tRNA，本身具备氯霉素(Chloramphenical)抗性基因，增加了筛选度。此外，选择菌种实验结果证明大肠杆菌(Rosetta gami)对所诱导的植物金属硫蛋白双聚体比其它菌种具有更好的稳定表达性。
4、植物金属硫蛋白双聚体的分离纯化植物金属硫蛋白双聚体工程菌在LB培养液中于常规温度培养18-20小时，稀释菌在常规温度培养至OD 0.6-1.2，迅速冷却至16-28℃后加入IPTG并继续在16-28℃中进行诱导培养18-24小时，然后离心收集菌体，用缓冲液悬浮菌体，超声波破碎或酶裂解菌体，再离心，上清液与镍琼脂糖在4℃中进行亲和吸附一小时。植物金属硫蛋白双聚体的纯化是利用双聚体中具备的六个连续的组氨酸序列与镍琼脂糖发生的专一亲和作用，然后用不同浓度的洗脱液上柱洗脱，收集馏分脱盐后即可得到植物金属硫蛋白双聚体。mBBr(monobromobimane)是目前检测蛋白质还原性巯基的最好试剂之一。经过对植物金属硫蛋白双聚体的检测证明，其还原性巯基的功能成倍高于植物金属硫蛋白单体。
实例说明一、植物金属硫蛋白双聚体的工程菌的构建与蛋白的制取实例1) 植物金属硫蛋白双聚体的构建过程使用的是Invitrogen试剂盒。质粒pQe30中有BamH1和Pst1限制性内切酶的基因序列位点，酶解形成两端带有BamH1和Pst1基因序列粘端的线型质粒。两个植物金属硫蛋白的PCR产物其两端引物分别设计有BamHI/KpnI和KpnI/PstI基因序列，经限制性内切酶BamH1/KpnI/Pst1酶解后分别形成各自带有BamH1/KpnI和KpnI/Pst1基因序列的粘端，再由T4DNA聚合酶的作用下形成具有BamH1/KpnI/Pst1序列的植物金属硫蛋白双聚体基因序列，而其中BamH1和Pst1的基因序列粘端与带有BamH1和Pst1基因序列粘端的线型质粒结合形成带有植物金属硫蛋白双聚体基因序列的环状质粒。质粒用电击法转入50μl感受态大肠杆菌(Rosetta gami)中并加入1ml SOC培养液在37℃中恢复30分钟，然后取出50μl涂抹在含有抗生素胺汴青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB固体培养基上37℃培养过夜。挑选若干生长菌落培养于10ml含有抗生素胺汴青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB培养液中37℃培养过夜。取出2ml菌液离心，菌体制备质粒。为了确定植物金属硫蛋白双聚体基因的存在，用带有BamH1和Pst1酶切序列的引物进行PCR，或用BamH1和Pst1限制性内切酶酶解60分钟，然后在DNA琼脂糖胶上检测。植物金属硫蛋白双聚体基因具备489个碱基对。
2)菌种培养与植物金属硫蛋白双聚体的分离实例从培养皿菌落中选择菌种培养于含有抗生素胺汴青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的50ml LB培养液在温度37℃摇床中(180-200rpm)培养20小时，然后移入在上述含有同样抗生素剂量的950ml LB培养液中进行稀释培养，在温度37℃摇床(180rpm)中培养至OD达到0.8-1。菌液迅速冷却至18℃左右，加入IPTG最终浓度至1mM，然后置于18℃摇床(180rpm)中进行诱导培养22小时。菌液离心15分钟(15,000rpm)，可得到菌体约3.5g。菌体用25ml缓冲液(50mMNaH2PO4，pH8，300mM NaCl，10mM imidazole)进行悬浮，然后超声波破碎菌体，离心(15,000rpm)15分钟得到上清液，上清液移入一50ml试管中并加入5ml镍琼脂糖摇匀并置于4℃摇床(50rpm)中约一小时，具有6xHis的可溶性蛋白(植物金属硫蛋白双聚体)与镍琼脂糖发生亲合反应，用含不同摩尔浓度的咪唑(imidazole)缓冲液进行洗脱(10mM 125ml，20mM 125ml，250mM 10ml)，收集250mM咪唑缓冲液的洗脱馏分再进一步用透析膜进行脱咪唑、脱盐即可得到植物金属硫蛋白双聚体。
二、金属硫蛋白双聚体诱导表达温度实例1)一升菌种培养液在诱导表达温度18℃，诱导表达时间为22小时时可制取可溶性植物金属硫蛋白双聚体50～60mg/升，纯度可达95％以上。菌体在破碎离心后其沉淀物经含有10mM DTT的缓冲液悬浮后离心，上清液再经亲和纯化，取样在SDS凝胶电泳中可观察到沉淀中植物金属硫蛋白双聚体的含量相当低。18℃诱导表达的植物金属硫蛋白双聚体在沉淀物中有约5mg/升。在诱导表达温度为18℃时可制取的可溶性植物金属硫蛋白双聚体的含量较高。
2)一升菌种培养液在诱导表达温度37℃，诱导表达时间为22小时时可制取可溶性植物金属硫蛋白双聚体约35mg/升，纯度可达95％以上。菌体在破碎离心后其沉淀经含有10mM DTT的缓冲液悬浮后离心，上清液再经亲和纯化，取样在SDS凝胶电泳中可观察到离心沉淀物中植物金属硫蛋白双聚体的含量相当高。37℃诱导表达的植物金属硫蛋白双聚体在沉淀物中有约20mg/升。在诱导表达温度为37℃时可制取的可溶性植物金属硫蛋白双聚体的含量相对低。
三、金属硫蛋白双聚体诱导表达时间实例1)一升菌种培养液当诱导表达时间为22小时，诱导表达温度18℃时可制取可溶性植物金属硫蛋白双聚体50～60mg/升，纯度可达95％以上。菌体在破碎离心后其沉淀物经含有10mM DTT的缓冲液悬浮后离心，上清液再经亲和纯化，取样在SDS凝胶电泳中可观察到沉淀物中植物金属硫蛋白双聚体的含量相当低。22小时诱导表达的植物金属硫蛋白双聚体在沉淀物中约有约5mg/升。诱导时间为22小时时可制取的可溶性植物金属硫蛋白双聚体的含量相对高。
2)一升菌种培养液当诱导时间为16小时时，诱导表达温度18℃时可制取可溶性植物金属硫蛋白双聚体约30mg/升，纯度可达95％以上。菌体在破碎离心后其沉淀物经含有10mM DTT的缓冲液悬浮后离心，上清液再经亲和纯化，取样在SDS凝胶电泳中可观察到16小时诱导表达的沉淀中植物金属硫蛋白双聚体的含量约1mg/升，诱导时间为16小时时可制取的非溶性和可溶性植物金属硫蛋白双聚体的含量都较低。
3)一升菌种培养液当诱导时间为24小时以上，诱导表达温度18℃时可制取可溶性植物金属硫蛋白双聚体约35mg/升，纯度可达95％以上。菌体在破碎离心后其沉淀物经含有10mM DTT的缓冲液悬浮后离心，上清液再经亲和纯化，取样在SDS凝胶电泳中可观察到24小时以上诱导表达的植物金属硫蛋白双聚体在沉淀物中约25mg/升。诱导时间在24小时以上时可制取的可溶性植物金属硫蛋白双聚体的含量相对低。
四、物金属硫蛋白双聚体诱导表达的温度域与时间域较佳组合实例当一升菌种培养液诱导表达温度在16℃-28℃，时间域在18-24小时的范围内时可制取可溶性植物金属硫蛋白双聚体50～60mg/升，纯度可达95％以上。菌体在破碎离心后其沉淀物经含有10mM DTT的缓冲液悬浮后离心，上清液再经亲和纯化，取样在SDS凝胶电泳中可观察到沉淀中植物金属硫蛋白双聚体的比例非常低。在诱导表达温度在16℃-28℃范围内，诱导表达时间域在18-24小时内时可制取的可溶性植物金属硫蛋白双聚体的总量较高，表达稳定。
权利要求
1.一种植物金属硫蛋白双聚体的制备方法，其特征包括(1)利用基因工程技术构建植物金属硫蛋白双聚体基因序列，选择开发性质粒pQe系列，其中的六个组氨酸连续基因序列与植物金属硫蛋白双聚体基因序列相融合并在特选大肠杆菌菌种(Rosetta gami)中来表达植物金属硫蛋白双聚体。(2)植物金属硫蛋白双聚体工程菌在LB培养液中于常规温度培养18-20小时，稀释菌在常规温度培养至OD 0.6-1.2，迅速冷却至16-28℃后加入IPTG 16-28℃中诱导培养18-24小时。然后离心收集菌体，用缓冲液悬浮菌体，破碎菌体，再离心，上清液与镍琼脂糖在4℃中进行亲和吸附一小时，然后上柱洗脱、收集馏分、脱盐后即可得到植物金属硫蛋白双聚体。
2.依据权利要求1(1)所述构建植物金属硫蛋白双聚体基因序列，其特征是可利用下列引物来构建植物金属硫蛋白双聚体基因序列。意义链引物CAGGGTACCATGGCTTGCTGTGGAGG反意义链引物CGTGGTGGTACCTTTGCAGGTGCAAGGG。
全文摘要
一种植物金属硫蛋白双聚体的制备方法其特征包括利用基因工程技术构建植物金属硫蛋白双聚体基因序列，选择开发性质粒pQe系列，并在特选大肠杆菌(Rosetta gami)中来表达植物金属硫蛋白双聚体。将植物金属硫蛋白双聚体工程菌在LB培养液中进行培养。然后离心收集菌体，用缓冲液悬浮菌体，破碎菌体，再离心，上清液与镍琼脂糖在4℃中进行亲和吸附一小时，然后上柱洗脱、收集馏分、脱盐后即可得到植物金属硫蛋白双聚体。本发明提供一种制备低成本、高产量、高纯度的植物金属硫蛋白双聚体的方法。
文档编号C12N15/70GK1609229SQ20041001363
公开日2005年4月27日 申请日期2004年3月22日 优先权日2004年3月22日
发明者安志刚, 祖元刚, 付玉杰 申请人:东北林业大学, 安志刚, 祖元刚