专利名称：一种呋喃丹农药残留降解菌及其生产的菌剂的制作方法
技术领域：
本发明一种呋喃丹农药残留降解菌及其生产的菌剂，属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
二、技术背景自从滴滴涕、六六六等有机农药使用以来，化学农药日益被人们所重视。随着农业生产的发展，病虫害与杂草为害作物生长的问题急需解决，也促使农药生产的品种与数量不断增加。目前，国外农药的总含量，以含百分之百有效成份计约为二百万吨。生产的农药约1300多种。常见产量较大的约有50种左右。
化学农药在作物病、虫、杂草害的综合防治中占有重要的地位。但是由于长期和大量地使用农药，尤其在开始时，人们对农药在自然界、生物体中的运动规律，诸如代谢途径、降解方式、残留积蓄等方面知识掌握不够，同时也由于开始时对农药毒性的认识，局限于急性毒性方面，忽略了农药慢性毒害的严重性，致使一些性质较为稳定、对人和牲畜又具有积蓄性慢性毒害的化学农药，象含汞、铅等金属元素的农药制剂，以及大多数有机氯制剂。污染了自然环境，并通过生物富集和食物链，造成了它们在动植物体内，甚至在人体内的积贮，出现了今日农药的公害问题。
目前，国内外一些科学工作者积极开展农药残留、代谢等方面的研究，了解农药在环境、人畜、作物中的变化规律，制定了一系列的安全用药措施，基本上控制了农药的污染问题。
对于已施用的农药，科研工作者一直在农药在自然环境中的降解方面探索，这其中包括使用物理、化学、生物等方法。而微生物由于具有分布广，数量大，代谢类型多样性和适应突变能力强等特点，因而倍受青睐。任何存在污染物的地方都会出现相应的降解微生物，并存在着或强或弱的生物降解作用。生物修复目前已成为一种新的可靠的环保技术，已有大量的生物修复资料，参数和各种降解模型以供工程技术人员进行工艺路线选择、实际设计和处理效果评价。
呋喃丹(carbofuran)，是一种高效广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂和杀螨剂，广泛应用于土壤害虫的防治。其用量大、难降解、毒性高，尤其对哺乳动物的急性毒性就更大。呋喃丹施入土壤后，易被淋溶而直接进入环境，从而广泛存在于水体、土壤及生物体中，直接威胁人类的生存环境。联合国已将其列为世界禁用农药之列。可是对于已经施用过呋喃丹的环境的综合治理目前一直未见有比较成熟的方法。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使呋喃丹农药的残留量降低905％以上。同时生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药呋喃丹进行病虫害防止而保证农产品中农药呋喃丹残留含量符合绿色食品要求。
技术方案 下面为本发明的主要内容本发明提供一种消除呋喃丹农药残留的降解菌，其菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌CDS-1(2003年10月27日已寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC NO.1025)，经鉴定为Sphingomonas agrestis。主要生物学特性为G-，菌体为长杆状，略带卷曲，无芽孢，好氧生长，接触酶阳性；从戊糖、己糖和双糖能氧化产酸，但不分解多羟基醇和菊糖。能以呋喃丹为唯一碳源、氮源进行生长，将其彻底矿化为CO2和水及简单的无机化合物。在实验室要瓶条件下呋喃丹的降解率达95％以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
使用上述呋喃丹农药残留降解菌生产菌剂的工艺为斜面种—摇瓶种子液—种子罐—产品(包装剂型为液体菌剂)。
本发明的详细实施步骤为1)将试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为葡萄糖1％(质量比，下文同)，(NH4)2SO40.05％，K2HPO40.15％，MgSO40.01％，蛋白胨0.05％，pH7.2-7.5；
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。
有益效果 本发明提供了一种消除呋喃丹农药残留的降解菌，实验室生物降解实验结果表明，对呋喃丹的降解率达到98.80％以上。
使用该发明生产的农药残留降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。降解菌CDS-1能使呋喃丹农药的残留量降低95％以上。可以大大降低生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药呋喃丹进行病虫害防治而保证农产品中农药呋喃丹残留含量符合绿色食品要求。并且该菌为革兰氏阴性菌，在田间的存活时间适当，不会影响以后农药使用效果。
田间试验表明，用本发明生产的降解菌剂直接施用于农作物可使作物中农药呋喃丹残留量降低95％以上。本发明成功的解决了农业生产中农药呋喃丹残留超标问题，既充分发挥化学农药呋喃丹在植物病虫害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。
四
图1 CDS-1菌落照片图2接种量对CDS-1降解的影响图3初始pH对CDS-1降解的影响图4温度对CDS-1降解的影响图5通气量对CDS-1降解呋喃丹的影响五具体实施方式
1菌株的分离和鉴定取实验室驯化的活性污泥颗粒，将其溶解于无菌水中，进行梯度稀释。稀释液涂布于100mg/L的呋喃丹无机盐离子固体培养基上，30℃培养数天。从中挑取单菌落(见图1)，鉴定为Sphingomonas agrestis。主要生物学特性为G-，菌体为长杆状，略带卷曲，无芽孢，好氧生长，接触酶阳性；从戊糖、己糖和双糖能氧化产酸，但不分解多羟基醇和菊糖。能以呋喃丹为唯一碳源、氮源进行生长，将其彻底矿化为CO2和水及简单的无机化合物。在实验室要瓶条件下呋喃丹的降解率达95％以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
2实验室生物降解实验2.1接种量对CDS-1降解呋喃丹的影响CDS-1在LB培养基中培养至对数后期，按2％、4％、8％、15％与20％的接种量分别接入富集培养基(含100mg/L的呋喃丹无机盐离子液体培养基，下文同)中，30℃、150r/min摇床培养，每隔1小时测定一次呋喃丹的含量，结果如图2。8小时的测定结果表明，按接种量从低到高排列，呋喃丹的降解率依次为9.17％、13.31％、25.49％、51.34％、67.79％；14小时的测定结果表明，8％、15％与20％接种量的培养基中，呋喃丹已完全被降解；2％、4％接种量的培养基中，呋喃丹的降解率分别为91.25％、98.80％。由此可见，接种量的大小对呋喃丹的降解效率有直接的关系，接种量越大，呋喃丹的降解效率就越高。
2.2初始pH对CDS-1降解呋喃丹的影响CDS-1在LB培养基中培养至对数后期，按8％接种至不同初始pH的富集培养基中，30℃、150r/min摇床培养，14h后测定其中呋喃丹的含量，结果如图3所示。在pH5.0～8.0的条件下，CDS-1对呋喃丹的降解率都大于85％；当pH为7.0，降解率几乎为100％。当pH小于5.0时，呋喃丹的降解率随着pH的下降呈明显的下降趋势；pH为3.0时，呋喃丹的降解率仅为33％。
2.3温度对CDS-1降解呋喃丹的影响CDS-1在LB培养基中培养到对数后期，按8％的接种量接到富集培养基中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、37℃的温度下，150r/min摇床培养，14h后测定其中呋喃丹的含量，结果如图4所示。在15℃时，CDS-1对呋喃丹的降解率为14％；在20℃～30℃的范围内，随着温度的升高降解菌降解呋喃丹性能明显上升，在30℃时，降解率接近100％。而当温度达到37℃时，CDS-1对呋喃丹的降解率急剧下降，仅为2％，几乎不降解呋喃丹。以上数据说明，CDS-1的最适降解温度为30℃；在较低的温度下仍具有一定的降解能力；而过低或过高的环境温度会严重抑制呋喃丹的生物降解。
2.4通气量对CDS-1降解呋喃丹的影响在5个250mL的三角瓶中分别装入30mL、50mL、70mL、100mL和150mL富集培养基，以装液百分比来指示通气量。CDS-1在LB培养基中培养到对数后期，按8％的接种量接种到上述各培养基中，30℃、150r/min摇床培养，10小时后测定呋喃丹的降解率，结果如图5。10小时的测定结果表明装有30mL、50mL、70mL、100mL和150mL培养液的三角瓶中呋喃丹的降解率分别为98％、92％、78％、69％和42％，CDS-1降解呋喃丹的过程是个好氧过程，大通气量有助于呋喃丹的降解。
2.5呋喃丹的起始浓度对CDS-1降解的影响CDS-1在LB培养基中培养至对数后期，按8％接种至不含碳源的无机盐培养基中，分别添加不同浓度的呋喃丹(50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L)作为碳源，每隔一定时间测定呋喃丹的含量，结果如表1。300mg/L高浓度呋喃丹的添加未对CDS-1降解性能产生明显抑制，完全降解200mg/L呋喃丹仅需要72h。这与大多数降解细菌的降解性能会受高浓度异源化合物的抑制这一现象不同。
表1呋喃丹起始浓度对CDS-1降解的影响呋喃丹的起始 呋喃丹的含量(mg/L)浓度(mg/L)14h 24h 48h72h50 0 00 0100 0 00 0200 143.73 96.6127.75 0300 264.8 206.13 104.41 43.62.6添加低浓度营养物对CDS-1降解呋喃丹的影响在富集培养基中分别添加等浓度的其它碳源，包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖和LB。CDS-1在种子培养基中培养至对数后期，按2％的接种量接入上述各培养基中，30℃、150r/min摇床培养。设置一个不添加营养物的作为对照。分别在10h、24h、36h测定各培养基中呋喃丹的含量，结果见表2。24h的测定结果表明与对照相比除酵母膏外，添加其他碳源物质均会使呋喃丹的降解率略微减小；但是36h的测定数据显示这对于呋喃丹的彻底降解无影响。这说明外界低浓度营养物的添加仅在降解的前半程起轻微的延滞作用，对于CDS-1的总体降解性能并无明显影响。
表2添加低浓度营养物对CDS-1降解的影响培养条件 培养后测定呋喃丹的含量(mg/L)(浓度单位为mg/L)10h 24h 36h100FND 94.32 30.84 0100FND+100牛肉膏 92.52 38.06 0100FND+100酵母膏 90.29 27.41 0100FND+100蛋白胨 94.73 35.96 0100FND+100G 94.10 32.07 0100FND+100LB 96.47 36.52 03 田间实际应用实验将本发明的微生物呋喃丹农药残留的降解菌CDS-1的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml发酵培养基1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为葡萄糖1％，(NH4)2SO40.05％，K2HPO40.15％，MgSO40.01％，蛋白胨0.05％，pH7.2-7.5。投料完毕后115℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8。将达到对数生长期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后生产罐1.1kg/cm2的压力下，115℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.8-1.0，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
用上述方法所得的产品进行田间农药呋喃丹残留降解试验示范。河北沧州30万亩枣园土壤中呋喃丹农药残留严重超标，大大影响了金丝小枣的出口，2003年在1300亩金丝小枣上应用农药残留生物修复技术，有效的去除了土壤与小枣中呋喃丹的农药残留，是林园小枣获得了国家绿色食品证书，形成“超健”品牌，基地与北方国际集团有限公司达成合作协议，每年向北方国际集团提供年产300吨小枣供其出口，净增效益20多万元。提供年产900吨小枣供其出口，充分体现了优质优价，为农民增收做出了重要贡献。
表3是使用呋喃丹农药后，将上述菌剂按使用方法要求施用于土壤中，20天时间后，利用气相色谱测定该土壤中呋喃丹的含量(由南京农业大学绿色食品测试中心和农业部环境监测总站测定)，从结果看出，经降解菌处理后能大大降低土壤中残留农药。
表3土壤中呋喃丹的含量Ck1Ck2T1T2T3呋喃丹的含1.21.4NDNDND量(mg/kg)
权利要求
1.一种呋喃丹农药残留降解菌，其特征在于该微生物是革兰氏染色阴性的Sphingomonas agrestis的菌株CDS-1，2003年10月27日寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1025，经鉴定为Sphingomonas agrestis，主要生物学特性为G-，菌体为长杆状，略带卷曲，无芽孢，好氧生长，接触酶阳性；从戊糖、己糖和双糖能氧化产酸，但不分解多羟基醇和菊糖。能以呋喃丹为唯一碳源、氮源进行生长，将其彻底矿化为CO2和水及简单的无机化合物，在实验室要瓶条件下呋喃丹的降解率达95％以上。
2.一种用权利要求1所述的呋喃丹农药残留降解菌生产的降解菌剂，是通过以下方法生产而成1)将试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为葡萄糖1％(质量比，下文同)，(NH4)2SO40.05％，K2HPO40.15％，MgSO40.01％，蛋白胨0.05％，pH7.2-7.5；3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。
全文摘要
本发明提供了一种消除呋喃丹农药残留的降解菌及降解菌剂，所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌CDS－1，经鉴定为Sphingomonas agrestis。主要生物学特性为G
文档编号C12P3/00GK1556196SQ20041001383
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月8日 优先权日2004年1月8日
发明者李顺鹏, 武俊, 何健, 崔中利 申请人:南京农业大学