专利名称：一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法。
背景技术：
尿酸氧化酶(尿酸氧化还原酶，EC 1.7.3.3，Urate Oxidase，Uricase)是一种可将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。机体嘌呤核苷酸分解产生的产物黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下产生尿酸，尿酸进一步在尿酸氧化酶、尿囊素酶、尿囊酸酶、尿素酶作用下分解为CO2和NH3。不同物种尿酸分解的程度不同，在哺乳动物体内产生的大部分次黄嘌呤和鸟嘌呤是通过磷酸核糖转移酶转变为肌苷单磷酸和鸟苷单磷酸，但仍有10％要被分解，排除体外。人体中，尿酸是嘌呤降解的最终产物，并随尿排除体外。
正常男性成人24小时尿尿酸总量小于600mg，病理导致的尿酸大量产生往往高于这个值而出现许多临床症状。恶性肿瘤的增殖导致核酸分解代谢加强，嘌呤代谢产生大量尿酸，病人出现高尿酸血症(Hyperuricemia)。肿瘤放化疗过程中也因为细胞大量裂解而出现伴随高尿酸血症的肿瘤消退综合症(tumor lysissyndrome，TLS)，病人体内一系列生理功能发生改变电介质紊乱、嘌呤代谢产生大量的尿酸、极性肾衰、虚弱、痉挛、心律不齐、肾结石或者死亡。在淋巴瘤、白血病、大块肿瘤的治疗中更容易出现。TLS增加了胞内物质如钾、磷、钙、尿酸等的浓度，大大超过了人体肾脏的排泄能力，导致高尿酸、高钾、高磷、高钙等症，最后导致肾衰的形成。
痛风是另一类与尿酸水平有关的疾病，由于遗传性或获得性病因导致嘌呤代谢障碍和血清尿酸持续升高所引起。升高的血尿酸水平导致在关节中发作形成尿酸钠水合物微结晶时，就发生痛苦的痛风性关节炎，而且会反复发作。结晶沉淀物在关节、骨骼、软组织和软骨的沉积称为痛风石。尿酸盐沉积于肾小管引起炎症，肾小球纤维化等病变。痛风病人以男性为主，约占95％，且发病高峰在30-40岁之间。痛风发生的主要原因是内源性产尿酸过多，外源性富含嘌呤的食物摄入过多，尿酸排泄减少。
我国癌症肿瘤发病病人2000年为180～200万人，占世界的五分之一，预计2020年，全球每年新发癌症病人为1500万人。我国近20年恶性肿瘤在死因中的构成比例已由12.6％升至17.9％，每年新发病人数约170万，大部分在发病以后采用化疗和放疗等手段治疗，化疗与放疗时细胞分裂过盛和急剧破坏，核酸分解突然增多产生大量尿酸，导致高尿酸血症，血尿酸浓度高达2380μmol/L～3570μmol/L(40～60mg/dl)。引起结石和肾衰，病人痛苦之极。
目前控制TLS的办法有饮食控制、水合、碱化酸毒症，用别嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段。但是别嘌呤醇抑制黄嘌呤氧化酶的活性，阻滞了黄嘌呤和次黄嘌呤转化为尿酸，干扰6-巯基嘌呤的代谢，影响肿瘤的治疗。别嘌呤醇因为抑制黄嘌噙氧化酶阻滞尿酸形成，增加了肾脏排泄尿酸前体(次黄嘌呤和黄嘌呤)的负荷。与次黄嘌呤不同，黄嘌呤在尿中比尿酸难溶。有时别嘌呤醇治疗的病人也可出现黄嘌呤肾病和结石。此外，对于病人体内存留的尿酸的排泄，使用别嘌醇治疗无效。另外用别嘌呤醇治疗的患者，2％产生过敏性反应，甚至出现严重的超敏反应综合症。对于急性高尿酸血症病人，别嘌呤醇因为起效时间长而使病人不能及时得到治疗。而尿酸氧化酶能够将尿酸氧化为尿囊素，很容易被排出体外。极大地缓解了高尿酸导致的综合症对病人产生的痛苦，提高了癌症、肿瘤病人的生活质量。
从黄曲霉(Aspergillus fiavus)提取的天然尿酸氧化酶Uricozyme已经在欧洲上市使用有20年的历史，经注射给药用于治疗与白血病化疗有关的严重高尿酸血症。美国也于1997年开始将该产品用于白血病患者。与别嘌呤醇相比，尿酸氧化酶降低血尿酸水平迅速而专一。痛风病人给予尿酸氧化酶可阻断急性发作并减小痛风石的体积。
从培养的黄曲霉提取尿酸氧化酶不但培养周期长、产率低，而且容易受病原体污染。基因工程技术为大量制备尿酸氧化酶开辟了新的道路。1992年，Legoux等克隆了黄曲霉尿酸氧化酶基因，并在大肠杆菌中尝试表达，产物以可溶解的形式在胞内表达，并且具有酶活性，但表达量低，只有菌体全蛋白的4％，不具有产业化开发价值。天然黄曲霉尿酸氧化酶N端乙酰化有利于酶的稳定及抵抗蛋白酶降解，这对培养周期长的表达系统十分重要，但对活性并不是必须的。同年，Chevalet用尿酸氧化酶缺陷的黄曲霉菌株进行表达，结果转化菌株不能以尿酸为唯一氮源，而且容易恢复为野生型。而Leplatois等在这一年取得了很大进展，他们在酿酒酵母中表达黄曲霉尿酸氧化酶基因，表达量达到13％。另外2000年，Hongoh等将Nilaparvata Iugens尿酸氧化酶基因在大肠杆进行融合表达，90％的目标蛋白以包含体形式存在，表达量估计有20％。国内朱献军等于2001年在大肠杆菌中克隆表达了产朊假丝酵母的尿酸氧化酶基因，产物以可溶形式表达，占可溶性蛋白的30％。
目前的黄曲霉尿酸氧化酶大肠杆菌表达体系存在的主要问题是表达量不高，无法大规模生产。酵母表达的产物表达量达13％，培养周期长，成本高。因此有必要采用更高效表达尿酸氧化酶的制备体系，以满足临床的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达量高的黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法。
黄曲霉尿酸氧化酶cDNA序列是已知的，编码一个全长301个氨基酸的蛋白质。黄曲霉尿酸氧化酶的编码序列可以来源于基因文库，或根据文献报道的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA序列全基因合成，还可以设计引物，通过PCR扩增获得。
本发明一种重组黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，包括如下步骤(1)、黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得；(2)表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌将合成的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后直接转化大肠杆菌宿主菌；(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；(4)、融合蛋白的分离、纯化首先将大肠杆菌工程菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化；(5)、融合蛋白的酶切，其中所述的表达载体质粒是pET-15b、pET-19b、pET-30a-c、pET-32a-c；黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得是通过全基因合成或通过设计引物，再PCR获得；所述的酶切位点是Nde I/BamH I或Nco I/BamH I位点；步骤(3)中是用氨苄青霉素做抗性筛选；步骤(3)中培养基培养的温度控制在28℃～40℃，优选在30℃～35℃；步骤(3)中诱导表达使用浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，优选0.4～1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂；层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析和亲和层析中的一种或多种方法；步骤(5)中酶切所用的酶是凝血酶或牛肠激酶。
本发明一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其表达方案简单，表达量高，纯化工艺简单，收率高。表达产物可溶，不需要复性，直接用层析方法进行纯化，纯化收率大大提高，适合大规模制备。
图1本发明表达载体构建示意图；图2融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果图；
其中1和8蛋白质分子量标准，自上而下分别为97.4kd、66.2kd、43kd、31kd、20.1kd、14.4kd；2未诱导全菌；3未诱导菌体破菌上清；4未诱导菌体破菌沉淀；5诱导全菌；6诱导菌体破菌上清；7诱导菌体破菌沉淀。
图3离子交换层析图谱；图4融合蛋白的酶切后的SDS-PAGE电泳分析结果图；其中1未加酶对照；2酶2000稀释作用结果3酶200稀释作用结果；4酶20稀释作用结果；5酶对照。
图5疏水层析图谱；图6活性分析结果图。
具体实施例方式
实施例11、黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得表1黄曲霉尿酸氧化酶cDNA序列
表达载体采用pET-15b(Invitrogen)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。根据文献报道的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA序列，见表1，合成30段互补的寡核苷酸，并在5’端和3’端分别引如酶切位点Nde I、BamH I，按分子克隆的常规方法，首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合，94℃变性5min，立即65℃退火10min，然后加入T4连接酶，16℃连接过夜。
2、表达载体pET-15b-202的构建和转化宿主菌pET-15b质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段，与合成的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA片段连接，20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1，加T4DNA连接酶300单位，15℃连接过夜，取10μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得工程菌经进一步筛选，工程菌构建过程见图1，3、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆pET-15b-Uox。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。
接种阳性克隆进行培养，经0.8mmol/L的IPTG诱导。
(4)、融合蛋白的分离、纯化收集菌体，进行超声破碎，然后收集上清和沉淀，用12％SDS-PAGE电泳分析，结果目标蛋白主要存在于破菌后的上清液中，电泳结果见图2，根据电泳结果的条带分析，诱导全菌的5号跑胶带中的目标蛋白的表达量应该在30％以上。将收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化，其过程为用pH值为8.5的20mmol/L Tris.CL缓冲液稀释，使其电导率小于5mS/cm。用同样的缓冲液平衡CM柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用0.01～0.5mol/LD NaCL梯度洗脱，收集目标蛋白峰，层析图谱见图3。
(5)、融合蛋白的酶切、纯化将离子交换目标蛋白峰稀释后使目标蛋白的浓度达到1mg/mL，样品对凝血酶切割缓冲液(50mmol/L Tris.CL，150mmol/L NaCL，2.5mmol/L CaCL2，pH 7.5)透析进行缓冲液交换，然后加入20mg/mL(0.5U/mL)的凝血酶，稀释比例分别为20、200、2000倍，25℃保温过夜酶切，12％SDS-PAGE电泳分析，结果见图4，20、200倍稀释的凝血酶切割效果很好。经酶切后的目标蛋白补加(NH4)2SO4使终浓度为1.0-1.5mol/L，样品上用1.2mol/L(NH4)2SO4，20mmol/L PB，pH7.4的缓冲液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，通过降低盐浓度梯度洗拖，收集目标蛋白峰，见图5的疏水层析图谱。
得到的疏水层析峰经Sephadex G-25脱盐，平衡液为20mmol/L PB，pH7.4。样品脱盐后即为精细纯化的黄曲霉尿酸氧化酶。
实施例2黄曲霉尿酸氧化酶活性分析纯化后的黄曲霉尿酸氧化酶用文献报道的方法(Legoux R.et al.，J.Biol.Chem.，1992，267，(12)，8565-8570)分析酶活性，3ml缓冲液体系(TEA buffer，7.5g三乙醇胺；0.38gEDTA)中含尿酸0.18μmol，pH 8.9，30℃保温，检测波长292nm，每分钟将1μmol尿酸氧化为尿囊酸所需的酶量为一个酶活性单位。加入1mg/mL的酶1μL、2μL、5μL、10μL，反应结束后测吸收值，结果见图6。
权利要求
1.一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)、黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得；(2)表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌将合成的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后直接转化大肠杆菌宿主菌；(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；(4)、融合蛋白的分离、纯化首先将大肠杆菌工程菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化；(5)、融合蛋白的酶切、纯化将部分纯化的融合蛋白经酶切后用层析技术纯化得到黄曲霉尿酸氧化酶，其中所述的表达载体质粒是pET系列载体质粒。
2.根据权利要求1所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于pET系列载体质粒是pET-15b、pET-19b、pET-30a-c、pET-32a-c。
3.根据权利要求1所述的一种重组黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得是通过全基因合成或通过设计引物，再PCR获得。
4.根据权利要求1所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于所述的酶切位点是Nde I/BamHI或Nco I/BamHI位点。
5.根据权利要求1所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于步骤(3)中是用氨苄青霉素做抗性筛选。
6.根据权利要求1所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于步骤(3)中培养的温度控制在28℃～40℃，优选在30℃～35℃。
7.根据权利要求1所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于步骤(3)中诱导表达使用浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，优选0.4～1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂。
8.根据权利要求1所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析和亲和层析中的一种或多种方法。
9.根据权利要求1所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其特征在于步骤(5)中酶切所用的酶是凝血酶或牛肠激酶。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其包括如下步骤(1)、黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得；(2)表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达(4)、融合蛋白的分离、纯化(5)、融合蛋白的酶切、纯化，其中所述的表达载体质粒是pET系列载体质粒，本发明一种重组黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，其表达方案简单，表达量高，纯化工艺简单，收率高，表达产物可溶，不需要复性，直接用层析方法进行纯化，纯化收率大大提高，适合大规模制备。
文档编号C12N9/02GK1690197SQ200410017948
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月27日 优先权日2004年4月27日
发明者刘国安, 方永强, 张玉良 申请人:杭州北斗生物技术有限公司