专利名称：聚乙二醇修饰的含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法，属于酶的凝胶包埋固定化技术。
背景技术：
sol-gel法一般是前驱体在水、助溶剂(通常为醇)及催化剂(酸或碱)存在下，发生水解和缩聚反应，释放出水和相应的醇等，形成三维网络，得到湿凝胶，湿凝胶经过陈化、干燥得到干凝胶。sol-gel法可在低温条件下实现对材料显微结构的裁剪和调控，作为一种“软化学”方法，它为生物分子掺杂于无机或无机-有机复合基质中提供了新途径。
与传统的物理吸附、化学交联和化学键合等固定化方法相比，现有的sol-gel固定化酶方法虽然具有许多突出优点，如固定化酶的可调控性、固定化过程的高效性及普适性等，但尚存在一些明显缺点，总体表现是缺乏分子水平上调控凝胶结构的手段以及固定化过程中和固定化后基质对酶的生物相容性。具体的问题主要体现在下述几方面(1)基质的刚性强而柔性差，易破碎；(2)凝胶基质的微观结构，如孔径(一般小于1.5nm)和孔道结构，使底物和产物的扩散速度慢，酶与底物不易接触，从而使酶的表观活性降低。固定化酶的凝胶孔径需满足两方面的要求一方面，凝胶孔径应足够大以使体系分子(包括缓冲液中的离子、底物和产物等)能自由传递；另一方面，凝胶孔径又不能太大，以防止固定化的酶分子的流失和环境中存在的诸如微生物等杂质的侵入。因此，调节出适当的凝胶孔径及有序的孔道结构对提高酶活性是非常有益的。(3)酶所处微环境的改变引起酶活性降低。酶的构象维持是决定其活性的关键。酶分子的构象主要是由静电作用力、范德华力、疏水作用以及氢键构成的复杂的立体结构来维持的。在酶的sol-gel法固定化过程中，由于氧化硅凝胶粒子与酶的多肽链之间存在的相互作用以及助溶剂和前驱体水解产生的醇等有机物的存在会破坏酶的构象，从而引起酶活性降低。
为增大凝胶的孔径，常采用表面活性剂作为模板剂，在水解过程中，溶胶粒子围绕表面活性剂胶束堆积并凝胶化，然后去除表面活性剂，得到孔径可调的凝胶。这种方法虽然在增大孔径上有明显效果，但由于表面活性剂往往对酶的结构造成破坏，使酶失活或活性下降，所以不适宜用于酶的固定化。非表面活性剂，如葡萄糖、麦芽糖、二苯甲酰酒石酸等，作为模板剂用于调控凝胶孔结构可以解决与酶的相容性问题。如在用正硅酸乙酯或正硅酸甲酯包埋碱性磷酸酶的过程中，加入上述非表面活性剂作为模板剂，得到的凝胶孔径较传统凝胶孔径提高1倍，且孔道相互连通，既有利于酶与底物之间的充分接触，同时也有助于底物与产物的扩散。但要调控出不同孔径的凝胶，需要采用不同类型的非表面活性剂。利用聚乙二醇(PEG)作模板剂控制纳米凝胶材料的结构是近年来sol-gel化学发展的新动态，通过调变PEG的大小和用量能够更便捷且有效地控制材料的结构及性能。PEG是一种线性、亲水、灵活而不带电的分子，具有很好的生物相容性，它的加入可以增强凝胶基质的柔性和亲水性。PEG修饰凝胶虽增大了孔径，但对孔的完整性的维持较差，在干燥和老化过程中，容易发生孔的坍塌。
酶分子的化学修饰是以酶分子空间结构和生物功能为基础，通过引入或除去化学基团，使其共价结构发生改变来对酶分子定向改造得到性能更符合要求的非天然大分子。目前常用的酶修饰剂包括小分子修饰剂，如乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺等，以及大分子修饰剂，如PEG、聚氨基酸、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、环糊精等。它们都是利用修饰剂分子与某一特定的氨基酸残基的侧链基团发生化学反应并形成共价键来实现对酶的修饰。大分子修饰剂多用于保护酶的活性基团，增强酶在有机溶剂中的性能。PEG类修饰剂与其他修饰剂相比，毒性小，具有良好的两亲性和生物相容性。特别是当酶经过PEG类修饰剂修饰后，修饰剂的许多优良性质也会随之移植到修饰酶中。PEG分子末端有两个能被活化的-OH基团，化学修饰时则多采用单甲氧基聚乙二醇的衍生物为修饰剂。PEG衍生物与酶的共价结合多是以酶分子上具有亲核性的赖氨酸残基作为修饰位点，如SS-PEG与赖氨酸氨基形成酯键，SC-PEG与之形成尿烷键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法。本发明提供的PEG修饰溶胶-凝胶过程操作易行，凝胶的平均孔径较大，底物和产物在基质中的传递速度较高，固定化PEG衍生物修饰酶的空间结构维持率和酶的活性维持率较高。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种聚乙二醇修饰的含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤1 在浓度为1～10mg/mL的磷酸盐缓冲液中，加入脱氢酶及与酶分子的质量比为1～3的能与酶分子上赖氨酸残基反应的SS-PEG、SC-PEG聚乙二醇衍生物修饰剂。
在反应温度为25℃和pH值为7.0的条件下，制得PEG修饰剂修饰的脱氢酶溶液；2在水中，加入与水的摩尔比为0.05～0.10的正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯前驱体，并加入与上述前驱体的摩尔百分比为0.5～5％的分子量为200～5000的PEG修饰剂，及加入与上述前驱体的摩尔比为1.0～2.0的盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、氢氧化钠、氨水、磷酸盐、醋酸盐催化剂。在反应温度20～25℃，pH值在7.0的条件下，水解和缩聚反应制得PEG修饰剂修饰的二氧化硅溶胶；3将步骤1得到的PEG修饰后的脱氢酶溶液与步骤2得到的PEG修饰剂修饰的二氧化硅溶胶混合，在1分钟之内形成凝胶，静置5～7天得到PEG修饰的含脱氢酶生物硅凝胶。
本发明制备的含酶凝胶经测定，其平均孔径为4.0～10纳米，比表面积为500～600m2/g。
本发明提出的制备方法的优点在于凝胶的平均孔径较大，固定化后酶的空间结构维持率和酶活性维持率高，固定化过程简便易行。
具体实施例方式
实施例一称取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料试管中，加入1.5％的HCl溶液0.55g，加入相对分子质量为600的PEG 0.0747g，在旋涡混合仪上混合至形成均一溶液，然后边混合边滴加1％的NaOH溶液1.05g，用以调节pH至接近中性，凝胶化后形成透明空白溶胶(A)。
称取ADH(购自Sigma公司)17.5mg，溶于5mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，加入52.5mg的SC-PEG。在25℃，pH7.0条件下，反应2h，得到PEG修饰ADH溶液(B)。
取0.5mL空白溶胶(A)与0.5mL酶溶液(B)在聚苯乙烯试管中混合，大约50～60s内形成凝胶。将试管密封，4℃下静置老化7天，得到含PEG修饰脱氢酶的PEG600修饰硅凝胶。
实施例二称取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料试管中，加入1.5％的HCl溶液0.55g，加入相对分子质量为600的PEG 0.3735g，在旋涡混合仪上混合至形成均一溶液，然后边混合边滴加1％的NaOH溶液1.05g，用以调节pH至接近中性，凝胶化后形成透明空白溶胶(A)。
称取ADH(购自Sigma公司)17.5mg，溶于5mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，加入52.5mg的SC-PEG。在25℃，pH7.0条件下，反应2h，得到PEG修饰ADH溶液(B)。
取0.5mL空白溶胶(A)与0.5mL酶溶液(B)在聚苯乙烯试管中混合，大约50～60s内形成凝胶。将试管密封，4℃下静置老化7天，得到含脱氢酶硅凝胶。
实施例三称取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料试管中，加入1.5％的HCl溶液0.55g，加入相对分子质量为400的PEG 0.0500g，在旋涡混合仪上混合至形成均一溶液，然后边混合边滴加1％的NaOH溶液1.05g，用以调节pH至接近中性，凝胶化后形成透明空白溶胶(A)。
称取ADH(购自Sigma公司)17.5mg，溶于5mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，加入35.0mg的SC-PEG。在25℃，pH7.0条件下，反应2h，得到PEG修饰ADH溶液(B)。
取0.5mL空白溶胶(A)与0.5mL酶溶液(B)在聚苯乙烯试管中混合，大约50～60s内形成凝胶。将试管密封，4℃下静置老化7天，得到含脱氢酶硅凝胶。
实施例四将NADH和甲醛溶解到0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，配成NADH浓度为50～250μmol/L，甲醛浓度为3～30mmol/L的溶液。将老化后的凝胶取出，用大量pH＝7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液浸泡，其间多次更换新鲜的缓冲液，并取样进行气相色谱分析，至无乙醇残留。取出凝胶，加入一定量的NADH溶液，使ADH的浓度为0.087mg/mL，浸泡24h，使NADH充分扩散到凝胶内部。25℃下反应。采用340nm分光光度法，在一定的时间间隔内，测定NADH浓度的变化确定反应进度。在不同的底物浓度下即可得到各浓度下的反应初速度。
本发明采用sol-gel法将PEG修饰的甲醇脱氢酶(ADH)包埋于PEG修饰的SiO2多孔基质中作为催化剂，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核甙酸(NADH)作为电子供体，通过酶促反应将甲醛转化为甲醇，反应式如下
本发明采用的固定化酶法将甲醛转化为甲醇反应中的反应初速度较未经修饰的固定化酶的反应初速度提高。可见，酶经修饰并包埋于修饰凝胶后，由于凝胶孔结构的改善，底物与酶的可及性提高，底物和产物的扩散速度增大，表现为酶的反应活性提高。酶和凝胶经修饰后，其活性维持率大大提高，存放92天后，ADH活性几乎没有变化。
权利要求
1.一种经聚乙二醇修饰的含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法，其特征在于包括以下过程1)在浓度为1～10mg/mL的磷酸盐缓冲液中，加入脱氢酶及与酶分子的质量比为1～3的能与酶分子上赖氨酸残基反应的SS-PEG、SC-PEG聚乙二醇衍生物修饰剂，在反应温度为25℃和pH值为7.0的条件下，制得PEG修饰剂修饰的脱氢酶溶液；2)在水中，加入与水的摩尔比为0.05-0.10的正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯前驱体，并加入与上述前驱体的摩尔百分比为0.5～5％的分子量为200～5000的PEG修饰剂，及加入与上述前驱体的摩尔比为1.0～2.0的盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、氢氧化钠、氨水、磷酸盐、醋酸盐催化剂，在反应温度20～25℃，pH值在7.0的条件下，水解和缩聚反应制得PEG修饰剂修饰的二氧化硅溶胶；3)将步骤1)得到的PEG修饰后的脱氢酶溶液与步骤2)得到的PEG修饰剂修饰的二氧化硅溶胶混合，在1分钟之内形成凝胶，静置5～7天得到PEG修饰的含脱氢酶生物硅凝胶。
全文摘要
本发明公开了一种经聚乙二醇修饰的含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法。属于酶的凝胶包埋固定化技术。该方法包括以下过程在磷酸盐缓冲液中，加入脱氢酶和能与酶分子上赖氨酸残基反应的SS－PEG、SC－PEG聚乙二醇衍生物修饰剂，制得PEG修饰剂修饰的脱氢酶溶液；在水中，以正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯为前驱体，加入PEG修饰剂，以盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、氢氧化钠、氨水、磷酸盐、醋酸盐为催化剂，制备PEG修饰剂修饰的二氧化硅溶胶；将PEG修饰后的脱氢酶溶液与PEG修饰剂修饰的二氧化硅溶胶混合，得到PEG修饰的含脱氢酶生物硅凝胶。本发明的优点在于凝胶的平均孔径较大，固定化后酶的空间结构维持率和酶活性维持率高，固定化过程简便易行。
文档编号C12N11/04GK1597948SQ200410020228
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月3日 优先权日2004年8月3日
发明者姜忠义, 吴洪, 黄淑芳 申请人:天津大学