专利名称：用Alteromonas sp.nov.SY37-12菌株生产琼胶酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的微生物Alteromonas sp.nov.SY37-12以及该菌株产生的琼胶酶。
背景技术：
据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，产生琼胶酶的菌种主要来源于海洋。Cytophage，Vibrio；Streptomyces，Alteromonas，Pseudoalteromonas，Pseudomonas中的某些菌株均可以产生琼胶酶。根据伯杰氏手册第九版，本发明的菌株的形态和生理生化特征均不同于已知菌，是从自然界分离出的新种(该菌种区别与其它该属菌的特征见表1)。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于海藻的新种Alteromonas sp.nov.SY37-12以及利用该菌株生产琼胶酶的方法。
本发明分离纯化出一株来源于海藻的新种Alteromonas sp.nov.SY37-12，其具有产生琼胶酶的特性，保藏单位简称CCTCC，保藏号为M204009。该琼胶酶作用于琼胶可产生不同分子量大小的琼胶糖片段。
本发明的特点是首次分离出产琼胶酶的Alteromonas sp.nov.SY37-12菌株。
图1显示了该菌株的电镜照片。该菌株为杆状，革兰氏阴性菌，0.5～0.6μm×1.8～2.1μm。端生单鞭毛，不积累聚羟丁酸盐颗粒作为胞内贮存物。该菌种来源于海洋环境，生长必须需要NaCl。根据伯杰氏手册第九版确定其为交替单胞菌属。此菌株在2216E培养基上37℃培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。该菌种具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点，特别是具有高的产酶活性，在2216E培养基中发酵16h，其发酵液中酶的活力即达到300U/ml。用本发明的菌株作为琼胶酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化的生产。
分离纯化后，利用SDS-PAGE测定了该菌株产生的琼胶酶的分子量。图2显示该琼胶酶的分子量为39Kda。由表2可知它不同于已报导的琼胶酶的分子量。
下面通过实施例说明本发明实施例从南海海域采集样品，通过选择菌落在2216E培养基上产生透明圈的大小进行初筛，通过测定酶活力复筛得到具有高产琼胶酶活力的一株细菌。该菌株通过形态观察和生理生化鉴定为交替单胞菌属中的一个新种。(2216E培养基的组成酵母膏1g，蛋白胨5g，磷酸高铁0.1g，琼胶15g，NaCl 20g，H2O 1000ml)将菌种用2216E培养基活化后，以1％的接种量接入装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，35℃摇瓶培养16h后，将培养液用冷冻离心机以4000rpm离心10分钟去除菌体，获得发酵酶液。酶活力测定的条件1mL酶液加入20mL0.5％琼胶底物中，35℃反应30min。沸水浴灭活5min，用DNS法测定还原糖的量。在上述反应条件下，1mL酶液1min产生1μg还原糖作为一个酶活力单位，以D-半乳糖作为标准。
该菌种产生琼胶酶的分子量测定采用(NH4)2SO4沉淀得到的酶蛋白在50mmol Tris-HCl pH7.5的缓冲液中透析、干燥后。经DEAE-Sepharose离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶柱层析分离纯化酶蛋白。SDS-PAGE得到一条单带，分子量为39Kda。
A.aur- A.ci- A.colw- A.denit- A.esp- A.halo- A.ha- A.luteo- A.macl- A.nigrif- A.r- A.un- A.sp.
antia trea elliana rificans ejiana planktis nedai violacea eodii aciensubra dina nov细胞形状直 + + + ++ ++ + + ++ -+弯 - - - -- -- d - -- +-有鞘鞭毛- - +- -+ d - -- -+生长4℃ + - - +- -+ d - -- d-35℃- d - -d d- + + -+ -+40℃- d - -- -- - d -- -+硝酸盐还原 - - + -- d+ - - -- --反硝化产气 - - - +- -- - - -- --产生物荧光 - - - -- -+ - - -- --需有机因子 + + + ++ d+ + - ++ +-产生淀粉酶 + + + ++ d- + + -+ d+藻朊酸酶- ++ -- d - -+几丁质酶- d - +- d+ - - -- +-利用D-葡萄糖+ + - ++ +d + ++ ++D-甘露糖+ + -d +- d - -+ -+D-半乳糖- - - -+ dd - + +- -+D-果糖 + + - -d d- d + +- -蔗糖- - - -+ +- - + -- +-麦芽糖 d - - ++ +- + +- +-纤维二糖- - -d -- - + -- --蜜二糖 - + -- - + +- -乳糖- - - -+ -- - + +- --水杨苷 - - -- -- - + -- -D-葡萄糖酸 - - + -- -d - + +- -盐N-乙基葡萄 + - -- ++ + d - +糖酸铵琥珀酸 - - - -- +- - - ++ -富马酸 - - + -- +- - - +- +DL-乳酸盐 - - - -- -- d d +- -DL-甘油酸盐 - -- -+ - + - -L-酮戊二酸 - - +- -- - - -- -柠檬酸盐- - -+ +- - - +- - -乌头酸盐- + +- - + - -D-甘露醇- - - -+ d- - d -- - -甘油- - - -- -- - + +- - -L-苏氨酸 - -+ -- + - -+L-酪氨酸+ - ++ +d d + + + +L-谷氨酸- - +- d+ - d + - -L-精氨酸+ - +d d- d d - d -腐胺 - -- -+ - - - -水溶性褐色素- - + -- -d - - -- - -水溶性红色素- - - +- -- - - -+ - -水溶性紫色素- - - -- -- + - -- - -水溶性黄色素- + - -- -- + - -- - -水溶性橙色素+ - - -- -- - - -- - -水溶性黑色素- - - -- -- - - +- - -表1交替单胞菌属种间的鉴别菌种 酶系 分子量 KDaVibrio sp.Strain JT010772Alteromonas sp.E-1 82Bacillus cereus ASK202 90Vibrio sp.PO-3034A87.5B115C57Bacillus sp.MK03 92Pseudomonas atlantica 32Vibrio sp.AP-2 20Alteromonus sp.strain C-1. 52Pseudomonas sp.PT-531Pseudomonas sp.strain W7 59Alteromonas sp.nov.SY 37-1239表2 Alteromonas sp.nov.SY 37-12菌株产酶与其他菌株产酶的比较
权利要求
1对琼胶酶生产菌种Alteromonas sp.nov.SY 37-12实施专利保护。
2对利用Alteromonas sp.nov.SY 37-12产生的琼胶酶实施专利保护。
全文摘要
本发明涉及一种新的微生物，特别是涉及一种能产生的琼胶酶的新颖的微生物Alteromonas sp.nov.SY37－12.以及该菌种产生的琼胶酶。本发明的目的是提供一种来源于自然界的新种Alteromonas sp.nov.SY37－12以及利用该菌株生产琼胶酶的方法。本发明从南海海域分离纯化出一株菌Alteromonas sp.nov. SY37－12，其具有产生琼胶酶的特性。该菌种的形态和生理生化特征均不同于已知菌种。根据伯杰氏手册第九版确定其为交替单胞菌属的一个新种。该菌种具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点，产生的琼胶酶具有很高的活性。用本发明的菌株作为琼胶酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化的生产。该酶作用于琼胶可产生不同分子量大小的琼胶糖片段。
文档编号C12P21/02GK1560226SQ20041002365
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月2日 优先权日2004年3月2日
发明者江晓路, 管华诗, 王静雪 申请人:中国海洋大学