专利名称：一种基因工程重组技术制备hiv融合抑制肽的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种重组技术制备HIV融合抑制肽的方法。
背景技术：
艾滋病(AIDS)是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染造成的。自从20世纪80年代首次报告艾滋病临床病例以来，艾滋病已成为人类前所未有的最具毁灭性的疾病。据不完全统计，至今已有近2000万人死于艾滋病。
抗HIV的药物尤其是鸡尾酒疗法的问世是人类治疗艾滋病的一大进步。目前被批准用于临床的十多种治疗AIDS药物主要分为病毒逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂和辅助治疗药物四大类。其中第一个HIV融合抑制肽Fuzeon(enfuvirtide，又简称T-20)是由Roche公司和Trimeris公司联合开发并于2003年3月被美国FDA批准上市。
Fuzeon(T-20)由HIV-1 gp160上第643-678位的36个氨基酸组成的人工合成多肽，其序列为AC-Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys AsnGlu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe-NH2。
T-20结合到细胞膜上与HIV-1 gp41 N端连接，中断了gp41超螺旋发夹结构前体的形成，从而阻断病毒通过包膜与宿主细胞融合。这种融合抑制剂可保护人体细胞避免感染HIV，从而起到抗病毒的作用。T-20的EC50约为1umol/L，临床副反应少。T-20和HIV逆转录酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂联合用药将增强了抗HIV能力、保护人体CD4细胞和大大减少了HIV用药后突变的机率。
Roche公司和Trimeris公司联合开发的Fuzeon(T-20)采用了化学合成多肽的技术，其生产过程需经106步反应，回收率仅为四十六之一，生产工艺复杂并且生产成本高。
发明内容
本发明的目的就是为了克服目前HIV融合抑制肽T-20的生产过程、回收率低、生产工艺复杂、成本高的缺点，提供一种基因工程技术制备HIV融合抑制肽的方法。
本发明采用基因工程发酵技术生产HIV融合抑制肽与化学合成肽相比，一方面保证了氨基酸的天然结构，另一方面工业化发酵成本大大降低。
本发明采用了CKS突变体融合表达技术。CKS为CMP-3-脱氧D-甘露-辛酮酸合成酶(CTPCMP-3-deoxy-D-manno-octulosonatecytidylyltransferase简称CKS)，仅见于革兰氏阴性细菌，由Kds B基因编码，CKS基因编码248个氨基酸。将CKS基因克隆在带Lac启动子和合成核糖体结合位点的载体上，在大肠杆菌中可得到高达细胞总量70％的表达量，在高表达状态20小时后，蛋白仍然稳定，且在此高表达水平下，蛋白不形成包涵体并均匀分布于整个胞质，也不影响宿主细胞的生长，是目前基因工程中获得的表达量最高的蛋白之一。
1990年Bolling首次采用CKS(去样3’端30nt)为N端融合伴侣，构建了带lac启动子和合成核糖体结合位点的表达载体，CKS与外源蛋白之间用Asp-Pro连接，便于酸解去除CKS，以此载体高效地表达了许多基因，如HIV-1 gp120-41，HIV-2 gp36，HSVI IgE2，tPA，HCVc33c等，并且表达CKS融合蛋白可作为有效的免疫检测用抗原。Abbott公司以此融合抗原制成了HIV及HCV诊断试剂盒。国内外尚没有报将CKS用作融合伴侣在酵母中表达。
本发明在国内外首次将CKS突变体(CKS C端最后一个Met突变为Thr，计算机分析表明突变后C端亲水性增加有利于融合表达)用作融合伴侣在甲醇营养型酵母Pichia中进行融合表达，获得高稳定高表达的工程酵母菌株。甲醇营养型酵母Pichia表达系统具有一些特殊的优点，如(1)应用Aox启动子，转录效率高，易于诱导调控；(2)表达质粒易于整合到基因，不易丢失，适于高密度发酵，产量高；(3)具备真核生物翻译加工的能力等。
本发明提供了一种基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法。本发明采用重组基因工程技术，较之化学合成多肽的技术，生产过程缩短，生产工艺更简单，成本大大降低。
本发明包括以下步骤通过人工合成HIV-1 gp160上第643-678位的36个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′端融合，中间含肠激酶识别切割位点，该融合基因克隆至酵母表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株，该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白，再经肠激酶切割后分离纯化获得重组HIV融合抑制肽。
上述重组肽体外试验表明具备抗HIV-1生物活性。
具体实施例方式
本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明实施例1CKSmut/HIV融合抑制肽基因的构建以下实验方法参照金冬雁等译《分子克隆实验指南》(1995年，科学出版社)。CKS基因由深圳大学生命科学学院微生物基因工程实验室按genebank序列从E.coli K12菌株中克隆，经序列分析与Genebank报道的E.coli K12株Kds B基因序列一致。通过定点突变将CKS C端最后一个Met密码子ATG突变为Thr密码子ATC，获得CKSmut基因。选择HIV-1 gp160上第643-678位36个氨基酸编码区Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn GluGln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe。
根据真核细胞常见密码子合成该段编码区基因。再将CKSmut和HIV-1gp160第643-678位人工合成基因用重叠PCR将两者连接，其5’端添加6His-tag，3’端添加终止密码TAG，中间添加肠激酶识别位点的基因，拼接后进行DNA序列分析，其结果如说明书后的SEQ ID NO.1。
实施例2
CKSmut/HIV融合抑制肽基因酵母表达的构建及工程酵母菌的筛选用PCR将上述CKSmut/HIV融合抑制肽基因5’端添加EcoRI 3’添加NotI位点，克隆至甲醇酵母Pichia分泌表达载体pPIC9EcoRI-NotI之间，构建甲醇酵母分泌表达载体pPIC CKS/HIV(方法参照金冬雁等译《分子克隆实验指南》1995年，科学出版社)。
参照Faber(1994年)方法进行酵母转化。取GS115单菌落接种于2.0ml YEPD，28-30℃培养过夜后转接于200ml YEPD继续培养5hr，6000g×5min离心收集，菌体悬浮于含25mM DTT的25mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.0)，置30℃保温15min，离心收菌，以200ml含270mM蔗糖的10mM Tris-Cl(STM，pH7.0)洗涤菌体2次，所获菌体悬于0.5mlSTM后置-20℃保存备用。取60μl上述感受态酵母加进电激杯，加入线性化5-10μl DNA，置冰浴30min后用BioRad电激仪以1.5kv电激转化GS115，转化细胞涂于平皿上，30℃孵箱培养2天，筛选生长的His+阳性克隆子。采用PCR技术鉴定重组子。
将PCR筛选阳性和His+克隆接种于5ml YPD培养基中，30℃培养至OD600达4时离心弃上清，细胞沉淀中加入1.5ml YPD培养基中继续培养3天，并于每24h补充甲醇，使其终浓度为0.5％。诱导结束后取1ml菌液离心，细胞沉淀中加入0.2ml含1％蜗牛酶的消化液，37℃消化3h，将菌液离心上清和细胞沉淀消化液分别通过SDS-PAGE电泳检测，从而筛选出表达量高的菌株。
实施例3含CKSmut/HIV融合抑制肽基因工程酵母菌发酵及产物纯化生长培养基(g/L)酵母氮源碱基13.4，生物素4×10-4，蛋白胨20，酵母提取物10，pH6.0，发酵培养基(g/L)酵母氮源碱基13.4，生产素4×10-4，蛋白胨20，酵母提取物10，微量元素混合物5ml。
100ml生长培养基装于500ml三角瓶中，接种后在200r/min 28℃振荡培养。种子液OD600达到4.0后，再转种进5升自控式发酵罐中进行发酵。发酵罐采用发酵培养基，200-300r/min，28℃培养，以氨水控制pH值在6.0。通过观察溶氧来监测菌体生长情况，控制溶氧在25％之间。溶氧上升则添加2％的甘油，在培养大约48h后停加甘油，让菌体将剩余甘油消耗净，等溶氧上升到75％以后开始添加2％的甲醇诱导外源蛋白的表达，控制溶氧在25％之间。诱导48h之后停加甲醇，待诱导再次上升时表示甲醇已经消耗完全，离心，收获发酵液上清。进行SDS-PAGE分析，发现40KD左右有表达蛋白，约占上清总蛋白的30％，用6His-Tag单抗做免疫印迹试验证明是带6His-Tag表达的融合蛋白SEQ ID NO.2。
发酵液上清离心后，用0.2μm膜过滤后，调pH至8.0用Ni2+-Chelating Big Beads吸附后，用咪唑洗脱后硫酸铵沉淀后，透析至20mM TrisHCl(pH8.0)，用牛肠激酶或人肠激酶切割后，过Superdex 30，收集各个峰，进行SDS-PAGE分析，选择4KD左右的多肽。该多肽再经反相HPLC纯化后冻干。
实施例4该多肽经分析鉴定其氨基酸组成与T-20一致。冻干多肽产品用PBS溶解后依照Lawless MK(1996，Biochemistry 3513697)的方法做体外抗HIV试验表明，有抗HIV生物活性。
实际上，除本发明的上述实施例2外，含CKSmut与HIV融合抑制肽T-20的融合蛋白经合适的酶切纯化后，及含有SEQ ID NO.1的DNA序列的任何表达载体经表达、分离、酶切、纯化后，均可用于制备本发明的HIV融合抑制肽T-20。
除上述实施例的酵母菌外，含有SEQ ID NO.1表达载体的大肠杆菌，同样具有本发明的工业化生产的作用。由于本发明采用重组基因工程技术，在筛选出表达量高的基因工程酵母菌或大肠杆菌后，其工业化生产主要就是按实施例3的发酵和产物纯化工作，较之需反复合成、合成步骤达106步的化学合成来看，其生产过程缩短、生产工艺更简单、成本大大降低。
权利要求
1.一种基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法，包括以下步骤通过人工合成HIV-1 gp160上第643-678位的36个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′端融合，中间含肠激酶识别切割位点，该融合基因克隆至酵母表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株，该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白，再经肠激酶切割后分离纯化获得重组HIV融合抑制肽。
2.根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法，其特征在于融合基因序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法，其特征在于突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露-六酮糖酸合成酶CKS突变位点在于SEQ ID NO.2中的氨基酸序列219位由原Met甲硫氨酸突变为Thr苏氨酸。
4.根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法，其特征在于融合蛋白为SEQ ID NO.2。
5.根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法，其特征在于表达载体为含有SEQ ID NO.1序列的表达载体。
6.根据权利要求1或5所述的基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法，其特征在于表达载体为甲酵营养型宿主酵母Pichia。
全文摘要
本发明涉及一种基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法。通过人工合成HIV－1 gp160上第643－678位的36个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的CMP－3－脱氧－D－甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′端融合，中间含肠激酶识别切割位点，该融合基因克隆至甲酵营养型酵母Pichia表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株，该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白，再经肠激酶切割后分离纯化获得重组HIV融合抑制肽。该重组肽经试验表明具备抗HIV－1生物活性。
文档编号C12N15/62GK1673375SQ200410026438
公开日2005年9月28日 申请日期2004年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者刘志刚, 吉坤美, 高波 申请人:深圳大学