专利名称：一种中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法
技术领域：
本发明涉及利用PCR筛选方法从129sv小鼠基因组文库中克隆得到的神经胶质细胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)基因的大小为1.8kb的5’端调控区并利用该调控序列制备中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的一种制备方法。
背景技术：
中枢神经系统包括脑和脊髓，是人类各种机能活动的高级中枢，也是人类思想和意识活动的物质基础。1989年美国率先推出了全国性的以保护脑和防治脑疾病为重点的脑科学计划，并把本世纪的最后十年命名为“脑的十年”。这一举动立刻得到了国际脑研究组织和许多国际学术组织的响应。该计划也因此成为继人类基因组计划之后的另一国际性科研计划。随着功能基因组时代的到来，对基因功能特别是在中枢神经系统中发挥作用的基因的功能和作用机理的研究显得尤为迫切。传统的基因剔除和以后利用Cre/LoxP或Red重组系统介导的组织特异性剔除作为一种有效的研究手段已经在这个方面发挥了重要的作用，但是删除与胚胎发育相关的重要基因常常导致小鼠胚胎畸形或在胚胎早期即死亡而无法获得成体动物。采用Cre/LoxP或Red重组系统和昆虫激素诱导表达系统制备时空特异性表达的动物模型，分别从时间和空间上来控制某些重要基因的表达来研究其在不同发育阶段的作用无疑是一种更加切实有效的研究手段。
转基因技术始创于20世纪60年代末。1980年Gordon等人首先报道利用显微注射纯化DNA的方法获得了世界上第一只转基因鼠。此后，该技术几经发展完善，终于在1981年和1982年Brinster、Palmiter和RonEvans分别合作成功制备了具有里程碑性质的在肝脏中表达TK基因的超级小白鼠和整合表达大鼠GH基因的“巨型鼠”。[Brinster RL，Chen HY，Trumbauer M et al.Somatic expression of herpsthymidine kinase in mice following injection of a fusion gene intoeggs.Cell，1981，27223～231；Palmiter RD，Brinster RL，Hammer RE etal.Dramatic growth of mice that develop from eggs withmetallothionein-growth hormone fusion gene.Nature，1982，300611～615.]自此转基因动物模型以其能够最大限度地模拟体内某些基因发挥作用的真实环境从而更加容易和准确地探讨该基因的生物学功能及表达调控机制而倍受遗传学者们的青睐。
在建立转基因动物模型的过程中，存在许多影响转入基因表达效率和组织特异性的因素，其中首推指导转入基因表达的调控序列。调控序列的长短是影响外源基因表达的组织特异性和水平高低的关键因素之一。在指导外源基因表达的调控序列的选择过程中，调控序列的长度应该是越长越好，至少应该不少于1.8～2.0kb，这样才可能保证外源基因的表达表现出较好的组织特异性和较高的表达效率[Li S.Glucocorticoid regulation of rat whey acidic protein gene expressioninvolves hormone-induced alterations of chromatin structure in the distalpromoter region.Mol Endocrinol.1994，81328～1335；David IK.Regulation of beta-globin gene expressionstraightening out the locus.Curr Opin in Genntic&Dev.1996，6488～495；Loc Phi-Van.Dissectionof the ability of the chicken lysozyme gene 5′matrix attachment region tostimulate transgene expression and to dampen position effects.Biochemistry，1996，3510735～10742.]。
神经胶质细胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)为神经胶质细胞的主要骨架蛋白，该蛋白的表达主要局限于中枢神经系统的星形胶质细胞中，传统上被认为是神经胶质细胞的特异性标志物。它在神经系统发育早期神经胶质细胞分化成熟时即开始表达，在中枢神经系统受到损伤或处于疾病状态时表达量上调[MichaelBrenner，Albee Messing.GFAP transgenic mice.METHODSACompanion to Methods in Enzymology，1996，10351～364；J.GeorgeQuintana，Isabel Lopez-Colberg，Lee Anna Cunningham.Use ofGFAP-lacZ transgenic mice to determine astrocyte fate in grafts ofembryonic ventral midbrain.Development Brain Research，1998，105147～151；]。因此我们在制备中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的过程中，克隆了129sv小鼠GFAP基因5’端1.8kb调控序列用于指导Cre重组酶基因在中枢神经系统中的特异性高效表达。
该转基因鼠的获得为借助Cre/loxP重组系统在中枢神经系统中实现一系列基因重组操作、制备时空特异性表达动物模型来研究某些细胞因子(例如IGF-I)在中枢神经系统的不同发育阶段中的神经生物学功能及其表达模式提供一个极为有利的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案本发明首先利用PCR筛选的方法从129sv小鼠的基因组文库中克隆得到了GFAP基因5’端1.8kb调控序列，本序列已被GeneBank收录(Accession NumberAY279974)。该部分序列详见序列表。
将该调控序列用于中枢神经系统特异性表达Cre重组酶转基因载体的构建，该载体主要包括4个元件2.4Kb的两个β球蛋白绝缘子、1.8Kb的GFAP5’端调控序列、1.2Kb的Cre重组酶基因和2.1Kb含内含子的人生长激素基因的polyA，加之载体序列共11.3kb。利用NotI线性化pGFAP-Cre-hGH载体，去除3.7Kb的无关序列，低熔点琼脂糖电泳回收包含两个β球蛋白绝缘子、GFAP5’端调控序列、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA大小为7.6Kb的目的片段。该注射片段纯化后稀释至3ng/μl，经显微注射导入小鼠受精卵的雄原核，再将注射后的受精卵移植入受体假孕母鼠的输卵管伞部，最后发育为个体。通过PCR方法和Southern杂交鉴定出生的子代鼠，将两项鉴定结果均为阳性的Cre转基因小鼠进行传代建系。选用PCR检测和Southern杂交检测均为阳性的Cre重组酶转基因的首建者小鼠与ROSA26鼠交配检测Cre重组酶转基因阳性的首建者小鼠中Cre重组酶的活性和组织特异性。在ROSA26鼠的基因组中整合有包括SA启动子、两个Loxp序列锚定的neomycin基因、LacZ基因和牛生长激素基因polyA在内的一个表达框(见图4)。在没有Cre重组酶同时存在的情况下，其中SA启动子对LacZ基因的启动作用被两个Loxp序列锚定的neomycin基因阻断，不能被转录和编码出有活性的β-半乳糖苷酶；如果同时存在有活性的Cre重组酶，它就可以将Loxp序列之间的neomycin基因特异性删除，从而使SA启动子启动后面LacZ基因的表达。此时如果加入特异性的生色底物X-gal，即会呈现出特异性的蓝色。该方法通常称为LacZ染色。利用PCR检测F1代鼠中Cre基因和LacZ基因的携带情况在Cre基因上设计特异性引物C1和C2引物进行Cre基因的PCR检测；在LacZ基因上设计特异性引物L1和L2用于LacZ基因的PCR检测。经过上述检测，首先选取发育至13d的基因型为Cre+/-/LacZ+/-子代鼠的胚胎，经LacZ染色后制备石蜡切片观察其中Cre重组酶的表达情况；然后选取出生后约2周基因型为Cre+/-/LacZ+/-的子代鼠的不同组织制备冰冻切片后进行LacZ染色，观察Cre重组酶的活性和组织特异性。上述实验均选取基因型为Cre-/-/LacZ+/-的子代鼠作为阴性对照。
图1为转基因载体pGFAP-Cre-hGH的构建图。
图2为PCR鉴定Cre转基因首建者小鼠的电泳结果。其中，1代表作为阴性对照的非转基因小鼠，2代表作为阳性对照的转基因载体，3、4、5、7和8分别代表GFAP-Cre转基因首建者小鼠，M代表DNA分子量标记物。
图3为Southern杂交鉴定Cre转基因首建者小鼠的杂交结果。其中，1代表作为阳性对照的注射片段，2代表作为阴性对照的非转基因小鼠，3、4、5、6、7和8分别代表不同的GFAP-Cre转基因首建者小鼠。
图4为GFAP-Cre转基因鼠与ROSA26的交配情况。
图5为PCR鉴定GFAP小鼠F1代Cre基因携带情况的电泳图。其中，1代表作为阴性对照的非转基因小鼠，2代表作为阳性对照的Cre转基因小鼠，4、5和8分别代表Cre基因携带小鼠，3、6和7分别代表未携带Cre基因的小鼠，M代表DNA分子量标记物。
图6为PCR鉴定GFAP F1代小鼠LacZ基因携带情况的电泳图。其中，1代表作为阴性对照的非转基因小鼠，2代表作为阳性对照的携带LacZ基因的小鼠，3、5、6和8分别代表LacZ基因携带小鼠，4和7分别代表未携带LacZ基因小鼠，MDNA分子量标记物。
图7为GFAP-Cre转基因鼠胚胎期13天LacZ染色后的石蜡切片图8为GFAP-Cre转基因鼠出生后两周不同组织LacZ染色后的冰冻切片。其中，A代表基因型为Cre+/-/LacZ+/-的小鼠的脑组织，B代表基因型为Cre-/-/LacZ+/-的小鼠的脑组织，另外，C、D、E、F、G、H和I分别代表基因型为Cre+/-/LacZ+/-的小鼠的心脏、肝脏、肺脏、胃、肠、肾脏和肌肉。
具体实施例方式
材料和方法1质粒与菌株胰腺特异性表达Cre重组酶质粒pRCH由本所周江博士惠赠，pBC1质粒、pGEM-5Z质粒、DH10β菌株由本实验室保存。
2工具酶与试剂所用限制性内切酶、Klenow fragment酶、T4DNA聚合酶、dNTP购自TaKaRa公司。T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自华美公司，蛋白酶K购自Merck公司。M2、M16、石蜡油购自Sigma公司。X-gal、Wizard DNA Clean-up System、Prime-A-Gene Labeling System购自Promega公司。QIAprep Spin Miniprep Kit购自QIAGEN公司。
3 pGFAP-Cre转基因载体的构建利用PCR方法筛选129sv小鼠的基因组文库，成功克隆到129sv小鼠神经胶质细胞酸性蛋白(GFAP)5’端侧翼区1.8Kb的调控序列(该部分资料待发表)。以129sv小鼠的胚胎干细胞基因组DNA为模板扩增获得1.8Kb的GFAP5’端调控序列。引物为GFAP-15’-CGCCATGTCGCTGGTATG GAGTATAGGCTG-3’，GFAP-25’-CGCGTCGACCCTGCCCTGCCTCTG CTGG-3’。PCR扩增条件94℃预变性5min；94℃变性30sec，68℃退火延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。将得到的1.8Kb的GFAP5’端调控序列克隆至pGEM-5Z质粒，序列测定确认无误。
pRCH质粒含有胰岛素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA。以Sal I和BamH I双酶切pBC1质粒，回收2.4Kb的含有两个β球蛋白绝缘子的片段，将其克隆至含有GFAP5’端调控序列的5Z质粒上的Spe I位点中，再利用上述两个片段两侧预留的SalI位点将连在一起的β球蛋白绝缘子与GFAP5’端调控序列切出，插入到胰岛素基因启动子和Cre重组酶基因之间的Sal I位点得到最后的pGFAP-Cre-hGH转基因载体，经鉴定完全正确。
PCR产物的回收、质粒DNA的提取、DNA片段的回收与连接、DH10β大肠杆菌感受态的制备、转化等操作均按《分子克隆》第二版进行。
4受精卵的显微注射回收并纯化注射片段，按常规进行显微注射和受精卵移植。实验用昆明白小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。
5转基因小鼠的基因型鉴定5.1 PCR检测取出生后10～14d的小鼠，剪下尾尖约0.5cm置于1.5cm离心管中，加入400μl组织裂解液
，50℃保温过夜，按《分子克隆》第二版制备基因组DNA作为PCR模板。
Cre重组酶特异性引物C 1(5’-TTGCCTGCATTACCGGTCGATGC-3’)和C2(5’-TTGCAC GTTCACCGGCATCAACG-3’)由本所国家生物医学分析中心DNA合成和序列分析实验室合成，可扩增Cre重组酶基因354bp的片段，用于转基因小鼠的PCR检测。PCR扩增条件94℃预变性5min；94℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
5.2 Southern杂交检测取保存的pRCH质粒，用Sal I和EcoR I进行酶切，回收1.2kb片段，用TE(pH7.4)稀释到25ng/μl，备用。
选用PCR鉴定为阳性的Cre转基因小鼠的鼠尾DNA，经Sma I酶切过夜，0.8％琼脂糖凝胶电泳36h后转移至硝酸纤维素膜上。Southern杂交方法参见《分子克隆》第二版进行。
6 Cre重组酶活性与组织特异性检测这里我们利用了ROSA26工具鼠来检测Cre重组酶转基因阳性的首建者小鼠中Cre重组酶的活性和组织特异性。在ROSA26鼠的基因组中整合有包括SA启动子、两个Loxp序列锚定的neomycin基因、LacZ基因和牛生长激素基因polyA在内的一个表达框(见图4)。在没有Cre重组酶同时存在的情况下，其中SA启动子对LacZ基因的启动作用被两个Loxp序列锚定的neomycin基因阻断，不能被转录和编码出有活性的β-半乳糖苷酶；如果同时存在有活性的Cre重组酶，它就可以将Loxp序列之间的neomycin基因特异性删除，从而使SA启动子启动后面LacZ基因的表达。此时如果加入特异性的生色底物X-gal，即会呈现出特异性的蓝色。该方法通常称为LacZ染色。
选用PCR检测和Southern杂交检测均为阳性的Cre重组酶转基因的首建者小鼠与ROSA26鼠交配。利用PCR检测F1代鼠中Cre基因和LacZ基因的携带情况利用前述的C1和C2引物进行Cre基因的PCR检测；在LacZ基因上设计特异性引物L1(5’-TTCCATGTTGCCACTCGCTTTA-3’)和L2(5’-GTTTCGGGTTTTCGACGTTCAG-3’)，可扩增226bp的片段，用于LacZ基因的PCR检测。经过上述检测，首先选取发育至13d的基因型为Cre+/-/LacZ+/-子代鼠的胚胎，经LacZ染色后制备石蜡切片观察其中Cre重组酶的表达情况；然后选取出生后约2周基因型为Cre+/-/LacZ+/-的子代鼠的不同组织制备冰冻切片后进行LacZ染色，观察Cre重组酶的活性和组织特异性。上述实验均选取基因型为Cre-/-/LacZ+/-的子代鼠作为阴性对照。图4显示Cre重组酶转基因鼠与ROSA26鼠交配情况。
结果2.1中枢神经系统特异性表达Cre重组酶转基因载体pGFAP-Cre-hGH的构建我们所构建的中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因载体主要包括4个元件2.4Kb的两个β球蛋白绝缘子、1.8Kb的GFAP5’端调控序列、1.2Kb的Cre重组酶基因和2.1Kb含内含子的人生长激素基因的polyA，加之载体序列共11.3kb(图1)。
2.2 GFAP-Cre转基因小鼠的建立利用Not I线性化pGFAP-Cre-hGH载体，去除3.7Kb的无关序列，低熔点琼脂糖电泳回收包含两个β球蛋白绝缘子、GFAP5’端调控序列、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA大小为7.6Kb的目的片段。该注射片段纯化后稀释至3ng/μl，经显微注射导入小鼠受精卵的雄原核，再将注射后的受精卵移植入受体假孕母鼠的输卵管伞部，最后发育为个体。共注射受精卵191枚，移植卵176枚，分别移植到8只受体鼠中，其中6只怀孕，获得子代鼠25只，假孕母鼠怀孕率为75％，移植胚胎成功率为14.2％。
经PCR检测和Southern杂交检测，从25只仔鼠中共筛选出7只携带Cre转基因的小鼠，转基因首建者阳性率为28％。图2显示PCR鉴定Cre转基因首建者小鼠的部分结果，图3显示Southern杂交鉴定Cre转基因首建者小鼠的部分结果。
2.3 GFAP-Cre转基因小鼠中枢神经系统特异性表达Cre重组酶为了检测GFAP-Cre转基因小鼠中表达Cre重组酶的活性和组织特异性，将其与ROSA26鼠交配。ROSA26鼠基因组中已经鉴定整合有两个Loxp序列锚定的neomycin基因序列，因此可借此检测GFAP-Cre转基因小鼠中表达Cre重组酶能否正确介导两个Loxp间的重组以及组织表达情况。正确表达的Cre重组酶能够介导两个Loxp间的重组而删除neomycin基因，从而是后面的LacZ基因表达β-半乳糖苷酶，经LacZ染色后可见特异性蓝色。
首先，我们选取子代鼠13d的胚胎，经PCR检测鉴定基因型后，选取基因型为Cre+/-/LacZ+/-的胚胎，另外选取基因型为Cre-/-/LacZ+/-的胚胎作为阴性对照，进行LacZ染色制备石蜡切片。图5显示PCR鉴定子代鼠中Cre重组酶基因的携带情况的部分结果，图6显示PCR鉴定Cre转基因首建者小鼠的部分结果，染色后的结果见图7。在同时携带有Cre基因和LacZ基因的阳性胚胎头部的第四脑室处可见到LacZ染色产生的特异性蓝色印记(图中黑色箭头标记处)，而在阴性对照胚胎的任何部位均未见蓝色印记。上述结果显示，在我们的发育至5-13d GFAP-Cre转基因小鼠胚胎的头部的确表达出了具有活性的Cre重组酶，并且成功介导了两个Loxp间的重组。
我们还选取了出生后两周的子代鼠检测Cre重组酶表达的组织特异性。同样利用PCR检测鉴定基因型，选取同一只同时携带有Cre基因和LacZ基因的子代鼠的脑、心脏、肝脏、肺脏、胃、肠、肾脏和肌肉，另外选取只携带LacZ基因的子代鼠的脑作为阴性对照，将上述组织制备冰冻切片后进行LacZ染色，染色后的结果见图8。在在同时携带有Cre基因和LacZ基因的阳性子代鼠的脑部观察到了LacZ染色产生的大量蓝色斑点，而在同一只阳性子代鼠心脏、肝脏、肺脏、胃、肠、肾脏和肌肉切片中均未观察到LacZ染色产生的蓝色斑点，同样，在在阴性对照鼠脑的切片中也未观察到蓝色斑点。上述结果证明出生后两周的GFAP-Cre转基因小鼠仅在脑部表达出了具有活性的Cre重组酶，在其他脏器组织中均未见表达，表现出较好的组织特异性。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>一种在中枢神经系统中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1778<212>DNA<213>
<400>1catgtcgctg gtatggagta taggctgttg ctatgacagg aactcagggg tcttaactgg60cttgagcgct gggagggggc aagcagccag gccttgtctg taagctgaag acctggcagt120gctgagctgg tcacccccca ggacctcctt ttgtgcccaa cgagtgactc accttggcat180agacataatg gtcaggggtg ggcacgcagc ctgcttcccg ctgtgctcca ggcctccttc240gatgctttcc gagaagtcta ttgagctggg agcttgtact gcacccgggg ctgacatcct300ggcatcctgg gataaaagca gcccacgggg ctgcccttgc catatgcctc actggcggca360gaggacaagg ctctattcag caagtgccct ggagtagaca ccagaagccc aagcatgggc420agaggaaggc aggggttggg gggagcagag ctgtctgtgt tccagaagcc caaggacaca480gatggctaag gcgcctggga gggacctgag tggaagagat agatgggcct gaagtctcaa540gcagcaacag cctcctcccc gccattggtg agggtggggt ttggtttccc ggacctacat600atccctcaga ggcctggtgt gtaggaattt aaaggaggta aatctcctga gagaatgagg660ggtacccagg aagacggggt gttacagaaa gactccagca tgcacagcca actcactcaa720aactactctg tcaggggctg ccgggggcca ggctcggggt ggggggtggg ggggcaaaga780gaagctggac cagggagaaa tggcccacta ggctggatat gaggccacag aggggctcag840gaatgaagcc tgctgtctta ccctattagg atctgcgtgc ataccttctg ctgtgcactc900taaacacaca gccagaggct caagttgacc ctggagtcac agagagggct ccaaccttag960ccctccactc ctgaactcca ggaatgagaa gatagagttg gagcgattca ggggagagga1020ctctgttgag aatgggggcc acaggaaact gtaatatagg ttgatcccgg aggaagggaa1080taggttcttc aagttcctag catctcacag gcccccagag aaggacagag ttggggtggt1140cctggcttac aggctctaag aactggaagc tgattacccc accaagctgt gcactctctg1200tctctgtctc tgtctctgtg tgtgcgcgct cgtgcacact tatcacacaa atgttcatgt1260gtgtgcacat agatgagttg agaccagagg tcaacctcag gcactgttgc cttggttttc1320tgagagagca tttctctctg gacctggaac tcgccaatta gtgagagcca ggaagtctgc1380tgattttcac tgcccagcac tggagtttac aagtatgcac tgtcaaccca ggccttttgt1440attcattctg cagctagaac ttgggtgggt cttcatgctt gacaggcaag caatttatgg1500
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权利要求
1.一种利用129sv小鼠GFAP5’端1.8Kb的调控序列制备中枢神经特异性表达Cre重酶的转基因小鼠的制备方法，主要包括以下三方面(1)利用PCR筛选129sv小鼠基因组文库的方法克隆得到了GFAP5’端1.8Kb的调控序列；(2)利用得到的GFAP5’端调控序列构建了包括该调控序列、β球蛋白绝缘子、Cre重组酶基因和人生长激素polyA(hGHpolyA)在内的中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的表达载体(pGFAP-Cre-hGH)；(3)利用构建的表达载体成功制备了基因组中整合有该表达载体的转基因小鼠。
2.转基因小鼠基因组中整合的Cre重组酶基因只在中枢神经系统中表达具有活性的Cre重组酶，而且能够正确介导两个LoxP序列间的特异性重组。
全文摘要
本发明涉及的制备方法包括利用从129sv小鼠基因组文库克隆得到的1.8kb的神经胶质细胞酸性蛋白(GFAP)基因的5’端调控序列，构建含有两个β球蛋白绝缘子、GFAP5’端调控区、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pGFAP－Cre－hGH。以显微注射的方法将7.6kb的转基因片段βglobin insulator－pGFAP－Cre－hGH引入191枚小鼠受精卵，其中176枚分别移植至8只假孕母鼠的输卵管中使其发育，共获得子代小鼠25只，经PCR和Southern杂交鉴定其中7只小鼠基因组上整合有Cre基因，整合率为28％。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上整合有LoxP位点和LacZ表达框的ROSA26鼠杂交，以检测Cre酶介导的重组及其活性和组织特异性。LacZ染色结果表明GFAP－Cre转基因小鼠只在中枢神经系统中表达Cre重组酶并能在体内成功介导LoxP位点间的重组。
文档编号C12N15/12GK1559202SQ200410039590
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月18日 优先权日2004年2月18日
发明者绳纪坡, 邓继先, 杨晓 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 中国人民解放军军事医学科学院生物工