专利名称：抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT－5'RZ cDNA、重组载体与核酶的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及抑制端粒酶活性的核酶基因、含该基因的重组载体及转录产物核酶和核酶的药学用途。
背景技术：
端粒是真核生物染色体末端的一种保护性结构，正常体细胞由于末端复制问题，端粒随细胞分裂而进行性缩短。端粒酶(telomerase)是一种特殊的核糖核酸蛋白质聚合物，它能以自身RNA作为模板合成端粒，以弥补复制造成的端粒缩短，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。另一方面，端粒酶是细胞周期重要的调控因素之一，影响着细胞周期的进程。肿瘤细胞由于端粒酶的激活，一方面维持了端粒的长度，使细胞获得永生；另一方面使细胞周期缩短，生长变快。大量的研究已表明，端粒酶的活化与癌症的发生密切相关，端粒酶已成为抗肿瘤治疗的一个新靶点。
核酶是具有一定结构的小分子RNA，能定点切割靶mRNA，从而抑制基因表达。刘柏林、屈艺等在“Ribozyme抑制端粒酶活性的肿瘤基因治疗”(见《中国科学(C辑)》第32卷第2期，P159-164，2002年4月)一文中公开了一种抑制端粒酶活性的teloRZ核酶，将该核酶导入体外培养肿瘤细胞和裸鼠移植瘤，可定点切割hTR(人的端粒酶RNA，即human telomerase RNA)，使之丧失合成端粒DNA的模板功能，从而抑制肿瘤细胞和肿瘤组织的生长。因此，开发高效、特异抑制端粒酶活性的核酶，是人类攻克癌症疾病的一项新战略和重要措施。
屈艺等在“端粒酶逆转录酶核酶hTERT-5’RZ抑制Hela细胞端粒酶活性的实验研究”(见《中华医学遗传学杂志》2002年10月第19卷第5期，P389-392)一文中公开了端粒酶逆转录酶核酶hTERT-5’RZ具有抑制Hela细胞端粒酶活性的效力，且其端粒酶活性抑制效力优于teloRZ核酶，但未公开端粒酶逆转录酶核酶基因hTERT-5’RZ cDNA与端粒酶逆转录酶核酶hTERT-5’RZ的结构等关键技术内容，致使所属技术领域的技术人员无法实施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制端粒酶活性的核酶基因——端粒酶逆转录酶核酶基因hTERT-5’RZ cDNA、含该基因的重组载体和重组载体转录的端粒酶逆转录酶核酶hTERT-5’RZ，以实现核酶作为肿瘤基因治疗药物的应用。
现有研究成果表明人类端粒酶由RNA和蛋白质组成，它的3个主要成分包括人端粒酶RNA(human Telomerase RNA，hTR)，端粒酶相关蛋白(Telomerase Protein 1，TPI)和端粒酶逆转录酶(human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)。hTR和hTERT与端粒酶活性具有密切相关性，hTERT是端粒酶的催化亚基和活性中心，是决定端粒酶活性的关键因素(见Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of humantelomerase activity with immortal cells and cancer.Science，1994，2662011-2015及Nakamura TM，Morin GB，Chapman KB，et al.Telomerase catalytic subunit homologs fromfission yeast and human.Science，1997，277955-959.)。
本发明的技术方案针对端粒酶逆转录酶hTERT mRNA 5’端区GUC切点设计合成端粒酶逆转录核酶基因，核酶基因由两条40nt的互补链组成。为便于构建重组载体，互补链两端分别设有内切酶位点序列和2～3个保护碱基，共长57bp。将两条互补单链退火形成核酶基因，该核酶基因命名为hTERT-5’RZ cDNA，其核苷酸序列如附图1所述。将合成的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA插入兼具体外转录功能的真核表达载体pcDNA3.1(+)的EcoRI-XhoI位点，即获重组载体，该重组载体命名为pcDNA3.1 hTERT-5’RZ。将重组质粒pcDNA3.1 hTERT-5’RZ用XhoI和EcoRI酶切使之线性化，采用T7/SP6体外转录试剂盒，经T7RNA聚合酶催化即可转录出本发明所述的端粒酶逆转录酶核酶，该核酶命名为hTERT-5’RZ，其二级结构如图3所述。核酶hTERT-5’RZ和核酶teloRZ组合可形成双核酶，核酶hTERT-5’RZ与核酶teloRZ的质量比为1∶1。
将本发明所述重组载体pcDNA3.1 hTERT-5’RZ转染至人宫颈癌Hela细胞株并进行端粒酶活性检测。检测结果表明，导入核酶hTERT-5’RZ后Hela细胞端粒酶活性显著下降，其端粒酶活性抑制效力优于TeloRZ核酶，大约为TeloRZ核酶的两倍左右。
将核酶hTERT-5’RZ和双核酶用于治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验，实验结果表明，核酶hTERT-5’RZ和双核酶均能有效地抑制肿瘤生长。
图1是本发明所述核酶基因hTERT-5’RZ cDNA的核苷酸序列；图2是将合成的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组载体的过程示意图；
图3是核酶hTERT-5’RZ的二级结构图；图4是重组载体的电泳鉴定图；图5是端粒酶活性检测的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图中，1表示第1组(hTERT-5’RZ+teloRZ)，2表示第2组(hTERT-5’RZ)，3表示第3组(teloRZ)，4表示第4组(control RNA)，5表示阴性对照(lysis-buffer)。
具体实施例方式
实施例1核酶基因hTERT-5’RZ cDNA的设计、合成针对端粒酶逆转录酶hTERT mRNA 5’端区GUC切点，借助计算机辅助设计成核酶基因序列，核酶基因由两条40nt的互补链组成(如图1所示)。为了便于克隆，在核酶基因的5’和3’末端分别设有EcoRI和XhoI酶切点的序列，并加2～3个保护碱基。采用固相亚磷酰胺三酯法(Pon R.T.，Buck G.A.，Hager K.M.et al.DeoxynucleosidephosphoramidatesA new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis.Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)，用ABI 3900高通量DNA合成仪(PE公司、BIO-RAD公司有售)合成。使用的固相支持物为可控微孔玻璃珠(购自NEW Life Science公司)，单体为核苷亚磷酰胺(购自PE Applied Biosystems公司)。从90年代起，国内外有关核苷酸序列的合成均已专业化、商品化。因此，也可将所设计的核酶基因序列交由有关专业公司合成(本发明中的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA曾交由GIBCO-BRL生命技术公司合成)。
实施例2重组载体的构建构建重组载体的过程如图2所示。取实施例1合成并纯化的单链核酶基因hTERT-5’RZ cDNA片段各33μg，退火成互补双链。用EcoRI和XhoI(均购自TakaRa公司)双酶切、凝胶电泳回收大片段。载体pcDNA3.1(+)(可从Invitrogen公司购买)，用EcoRI和XhoI酶切后，电泳回收大片段。载体与核酶基因按摩尔比1∶4用DNA Ligationkit ver.2(购自TakaRa公司)方法连接，转化感受态菌JM109(购自TakaRa公司)，用氨苄青霉素筛选出转化子。用柱式抽提试剂盒(购自TakaRa公司)提取质粒，酶切鉴定重组子并测序，得到重组质粒pcDNA3.1 hTERT-5’RZ。随机挑选6个pcDNA3.1 hTERT-5’RZ菌落扩增培养并抽提质粒，经EcoRI和XhoI酶切后，10％聚丙烯酰胺(PAGE，系Fluka公司产品)凝胶电泳均呈现46bp条带(见图4)，与预期的核酶基因hTERT-5’RZcDNA片段大小一致。挑选克隆1进行测序，结果与设计合成的核酶基因hTERT-5’RZcDNA序列完全一致。
实施例3体外转录反应获取核酶hTERT-5’RZ重组质粒pcDNA3.1 hTERT-5’RZ用上述XhoI和EcoRI酶切使之线性化，采用T7/SP6体外转录试剂盒(购自宝灵曼公司)，经T7RNA聚合酶(购自GIBCO-BRL公司)催化以转录出相应的小片段核酶hTERT-5’RZ，用紫外检测法进行定量，得率为3.5μg RNA/μg质粒。核酶hTERT-5’RZ的二级结构如图3所示。
实施例4双核酶的制备将实施例3所获取的核酶hTERT-5’RZ与核酶teloRZ按质量比1∶1配料，即核酶hTERT-5’RZ10μg、核酶teloRZ10μg与40μl脂质体Lipofectamine(购自Roche公司)混合即可制成双核酶hTERT-5’RZ-teloRZ。
核酶teloRZ按刘柏林、屈艺等在“Ribozyme抑制端粒酶活性的肿瘤基因治疗”(见《中国科学(C辑)》第32卷第2期，P159-164，2004年4月)一文中公开的方法制备。
实施例5细胞转染在6孔板中接种5×104个人宫颈癌Hela细胞/孔(人宫颈癌Hela细胞可从ATCC公司购买)，用1640培养基(购自GIBCO-BRL公司)常规培养2天后，换用OPTi-MEM培养基(购自Roche公司)2ml培养。实验分为4组，第1组为10μg hTERT-5’RZ+10μgteloRZ+40μl Lipofectamine；第2组为15μg hTERT-5’RZ+40μl Lipofectamine；第3组为15μg teloRZ+40μl Lipofectamine；第4组为对照，加入空载体pcDNA-3.1(可从Invitrogen公司购买)/XhoI转录合成的小片段RNA与40μl Lipofectamine。上述各实验组中的脂质体Lipofectamine(购自Roche公司)与小片段核酶RNA(溶于160μl OPTi-MEM中)混合后，室温静置20min，滴入6孔板培养液中，6小时后改用含10％胎牛血清的1640培养基培养。每24h重复转染一次，72h后收集细胞，用于端粒酶活性检测。
实施例6端粒酶活性检测离心收集HeLa细胞，并用无K+、Ca2+的PBS(购自GBC-BRL公司)洗二次，加入100μl TRAP-lysis buffer[10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、1mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、0.1mmol/L PMSF、5mmol/L β-硫基乙醇，0.5％CHAPs，10％甘油]，充分混匀后冰上放置30min，12000r/min 4℃离心20min，收集上清液，按说明书方法进行考马斯亮兰染色，于紫外分光光度计(751-GW分光光度计，惠普上海分析仪器有限公司，产品编号910389)波长595nm处测定蛋白质浓度并稀释为2μg/μl，-70℃冻存备用。采用kim报道的TRAP法(见Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomeraseactivity with immortal cells and cancer.Science，1994，2662011-2015)，用端粒酶检测试剂盒(购自Oncogene公司)进行端粒酶活性测定。各实验组分别取2μg蛋白提取物，加反应液[5μlTRAP-buffer，50umol/L dNTP，1μl TS引物，PCR-Grade Water]至终体积50μl。室温孵育30min，以完成端粒酶介导的在TS引物3’末端进行的端粒延伸反应。97℃ 10min灭活端粒酶，在冰上向反应体系加入1μl Primer Mix和2u Taq酶。在PCR扩增仪(PERKINELMER CETUS公司)中进行35次循环扩增，循环参数94℃，30s；50℃，30s；72℃，90s，最后一次循环再在72℃延长10min。并以裂解缓冲液替代细胞裂解液作为阴性对照，取40μl PCR产物行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，SYBR Green染料(购自FMCBioproducts公司)染色，36bp带显示定量内标，梯度带显示端粒酶活性。用凝胶扫描分析仪(GIS-1000数码凝胶图象分析系统)对电泳胶条带灰度进行扫描计数，36bp带灰度计为A1，端粒酶梯度带灰度总计为A2，则A2/A1为细胞端粒酶相对量。
端粒酶活性检测的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图5所示，各实验组经扫描定量分析所得到的HeLa细胞端粒酶相对量见表1。
表1
从图5和表1可以看出，导入核酶hTERT-5’RZ后HeLa细胞端粒酶活性显著下降，其端粒酶抑制效力明显优于核酶teloRZ。两种核酶的混合物对端粒酶活性的抑制效果优于单个核酶。
实施例7核酶治疗人肝癌裸鼠移植瘤1.材料与方法1.1试剂与材料人肝癌细胞株SMMC-7721(可从ATCC公司购买)为本室传代培养。BALB/C裸鼠(重约20g/只)购于四川省抗生素研究所。
RNA转染试剂TransMessangerTMTransfection Reagent为Qiagen公司产品。
1.2SMMC-7721裸鼠移植瘤的建立与程控光照饲养构建肝癌裸鼠移植瘤，瘤块至55mm3大小时用于实验。
1.3用药实验将裸鼠分为4组，每组6只(雌雄各半)。第1组为对照组，每日瘤体内多点注射5μg/只对照RNA(5μg Control RNA+10μl Enhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)，第2组为teloRZ组，每日瘤体内多点注射5μg/只teloRZ(5μg teloRZ+10μl EnhancerR+TransMessanger Reagent 25μl)，第3组为hTERT-5’RZ组，每日瘤体内多点注射5μg/只hTERT-5’RZ(5μg hTERT-5’RZ+10μl Enhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)，第4组为双核酶组，每日瘤体内多点注射5μg/只双核酶(5μg双核酶hTERT-5’RZ与teloRZ的质量比为1∶1+10μlEnhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)。连续注射14天，14天后统一用断颈法处死动物，测量肿瘤湿重。
2.结果用药14天后核酶对裸鼠移植瘤生长的影响见表2。
表2
从表2可以看出，注射核酶的三组裸鼠其瘤块生长速度明显慢于对照组裸鼠的瘤块生长速度。其中，hTERT-5’RZ组、双核酶组的瘤块小于teloRZ组。hTERT-5’RZ组的抑瘤率为61％、双核酶组的抑瘤率为63％、teloRZ组的抑瘤率51％。表明，核酶hTERT-5’RZ和双核酶较核酶teloRZ能更好地抑制肿瘤生长。
权利要求
1.一种抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA，其特征在于它具有附图1所述的核苷酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于它含有权利要求1所述的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA插入序列。
3.一种抑制端粒酶活性的核酶hTERT-5’RZ，其特征在于它具有附图3所述的结构。
4.一种抑制端粒酶活性的双核酶，其特征在于主要由核酶hTERT-5’RZ和核酶teloRZ组成，核酶hTERT-5’RZ与核酶teloRZ的质量比为1∶1。
全文摘要
本发明公开了一种抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT－5’RZ cDNA、含该基因的重组载体和重组载体转录的核酶hTERT－5’RZ。核酶基因由两条40nt的互补链组成，将两条互补单链退火即形成核酶基因，其核苷酸序列如附图1所述。将核酶基因hTERT－5’RZcDNA插入载体pcDNA3.1(+)的EcoRI－XhoI位点，即获重组质粒pcDNA3.1 hTERT－5’RZ。将重组质粒pcDNA3.1 hTERT－5’RZ用XhoI和EcoRI酶切使之线性化，采用T
文档编号C12N9/22GK1597958SQ200410040520
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者刘柏林, 屈艺, 刘菽秋 申请人:四川大学