专利名称：来自丝蛋白的功能性多肽的生产及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自丝蛋白的优良促进细胞生长和延展性等的功能性多肽组合物和其生产方法及其在药物、准标准药物(quasi drug)、化妆品领域作为皮肤护理、食品等材料的用途。
背景技术：
自从过去将丝线用作外科手术缝合，丝蛋白就被认为是生物适合材料，并且近来除了在制衣领域不断发展，在不同领域对丝线的新用途的开发也已变得活跃。
例如在适用的领域，丝线被溶解以形成丝蛋白水溶液(aqueous silkprotein solution)，再通过凝结、干燥、研磨等转变成用于化妆品添加剂的粉末；丝蛋白水溶液通过浇注在平板或类似物上制成用作细胞培养床、创伤被覆和敷涂材料的薄膜状材料；以及丝蛋白水溶液被制成用于食品和化妆品的凝胶状材料。这些用途的开发已有研究(见专利文献1至11)。
如上所述，丝材料经过处理在丝线被溶解形成丝蛋白水溶液后以粉末、薄膜、凝胶等的形式被使用。
在这些丝材料的处理过程中，主要使用中性盐溶解丝线。但是并没有关于丝蛋白的中性盐水溶液具有促进人细胞生长特性的描述。
进一步的，在新的丝材料的开发中，已认为丝蛋白具有多种功能例如细胞生长、抗氧化作用，杀菌作用、酒精消化(alcohol digestion)和血液的抗凝结作用。
本发明者注意到细胞生长功能与丝蛋白相关，并从事研究了解其功能以达到在将茧丝或丝线溶解再转变成粉末、薄膜、凝胶等之后用作创伤被覆材料的皮肤护理材料和化妆品的目的(见专利文献12至14)。
更进一步的，本发明者已经分离、纯化和回收了构成丝蛋白的成分，并评价了其功能，研究丝蛋白中哪个位点或结构负责细胞生长功能。结果发现丝心蛋白H-链(见专利文献15)和L-链(见专利文献16)和丝胶蛋白的成分a(见专利文献17)共同构成丝蛋白，对正常人皮肤来源的成纤维细胞有生长促进作用。
它们在细胞生长过程中尤其利于细胞粘附。
H-和L-链通过ss键连接在一起，分子量为370,000道尔顿的丝心蛋白和分子量为400,000道尔顿的丝胶蛋白a被称为未降解的丝蛋白。
另一方面，除了在制衣领域中，丝线在医疗(外科手术缝合)、化妆品(粉扑(puff))等领域中被用作纤维。
近来意识到在茧和生丝的处理过程中丝蛋白的分子量降低。
而且在将茧丝或丝线转变成粉末、薄膜、凝胶等的过程中(尤其在茧丝或丝线的溶解过程中)，发现丝蛋白的分子量降低(见专利文献18和19)。
经传统丝处理的分子量降低的丝蛋白的电泳图显示在10,000至200,000道尔顿分子量范围只有成片的不清晰宽带。
分子量低于约5,000道尔顿的丝蛋白降解产物在透析等过程中被除去了。因此认为在处理过程中丝蛋白的分子量被降低到了氨基酸和肽水平。在此，多肽指氨基酸残基不少于30，肽指氨基酸残基少于30。
此外，已发现以这种方式降低分子量的丝蛋白对人细胞的生长促进活性减小(见专利文献14)。
丝心蛋白和丝胶蛋白的细胞生长率在其未降解状态下显示最高值。当平均分子量降低到约200,000道尔顿时，细胞生长率只有其在未降解状态下时的大约一半，当分子量降低到20,000至40,000道尔顿时，几乎不具有促细胞生长活性。
原因可能是当其分子量减小时产生了抑制细胞生长的物质。
涉及丝蛋白抑制细胞生长的原因，认为蛋白的肽键通常由于酸、碱、光(紫外光、辐射等)、加热等以复杂状态异型断裂，导致其分子量减小，或发生氨基酸残基的侧链修饰(氧化作用、卤化作用、脱酰胺作用等)等。
换句话说尽管未降解的丝心蛋白和丝胶蛋白优良促进细胞生长，但在丝处理的步骤中用酸、碱、光、加热等处理后非特异肽键的断裂导致分子量减小以及增加了对细胞生长的抑制。
因此，为了利用丝蛋白促进细胞生长的的功能，优选使用未降解的丝心蛋白、丝胶蛋白、丝心蛋白的H-链(大约350,000道尔顿)和L-链和丝胶蛋白a(大约400,000道尔顿)等。
但是，考虑到丝蛋白的物理特性，溶液中的丝心蛋白和丝胶蛋白具有分子量越高，越容易在振动或搅拌时通过剪切成为纤维(结晶化)的特性。
转变成纤维的物质成为不溶于水的凝集物。
尤其未降解的丝蛋白(丝心蛋白和/或丝胶蛋白)在溶液中即使没有剪切也趋向于形成凝胶(含水的软晶体)。
用中性盐溶解的分子量不低于200,000道尔顿的丝蛋白的水溶液在脱盐中成为凝胶。
凝胶逐渐变硬，当受到搅拌时变得更硬。
通过如上所述的轻微剪切轻易发生的细(fine)纤维的形成导致软膏和化妆品(乳霜、乳化剂、调节剂等)的低实用性(触感、延展性(extensibility))，导致用作皮肤护理材料的低适用性。
例如当未降解的丝心蛋白的水溶液或分子量大于约300,000道尔顿的丝心蛋白的水溶液在手中轻微摩擦时，很容易形成不溶于水的约0.5至2mm的凝集物。即使其分子量为约200,000道尔顿或更大，摩擦剧烈时形成凝集物而缺乏延展性。
另一方面，丝蛋白的分子量降低时可能不会发生借助摩擦力等的纤维形成。
特别当丝蛋白的分子量低于200,000道尔顿，尤其在50,000至100,000道尔顿之间时，即使剧烈摩擦丝蛋白的水溶液也不会形成球形的纤维凝集物。因此丝蛋白可以成为用作化妆品等的具有优良物理特性的材料。
但是，在由传统茧处理获得的用于丝织品等的丝线中丝心蛋白的H-链不能被证实并且其L-链也降解到几乎不能证实的水平。
这种丝心蛋白的促细胞生长活性只有未降解丝心蛋白的一半或更少。
丝蛋白的细胞生长功能降低到低于或等于未降解丝心蛋白的一半。虽然在丝加工等过程中丝心蛋白和丝胶蛋白的分子量减小但其仍被使用。
换句话说，丝蛋白和丝胶蛋白的传统用途目的是其可被轻易使用和其实用性而不是其细胞生长特性，并且使用分子量低于200,000，主要低于100,000的丝心蛋白和丝胶蛋白。
Kokoku(Jpn.已审查的专利公开)No.40-24920[专利文献2]
Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.62-415[专利文献3]Kokoku(Jpn.已审查的专利公开)No.1-44320[专利文献4]Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.1-254164[专利文献5]Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.1-256351[专利文献6]Kokoku(Jpn.已审查的专利公开)No.4-202435[专利文献7]Kokoku(Jpn.已审查的专利公开)No.5-83292[专利文献8]Kokoku(Jpn.已审查的专利公开)No.6-4679[专利文献9]Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.8-143595[专利文献10]Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.11-139986[专利文献11]Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.11-276876[专利文献12]专利号2997758[专利文献13]专利号2990239[专利文献14]专利申请2002-230656[专利文献15]Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.2001-163899[专利文献16]专利申请2001-180169(WO02/102845A1WO公开)[专利文献17]Kokai(Jpn.未审查的专利公开)No.2002-128691 H.Yamada等人材料科学和工程(Materials Science & Engineering)，C，14，P.41-46(2001)[非专利文献2]K.Tsubouchi，H.Yamada，Y.Takasu日本养蚕协会科学学院期刊(TheJapanese Society of Sericulture Science academic joumal)Vol.71，No.1，P.1-5(2002)本发明解决的问题本发明的目的是提供来自丝蛋白的多肽组合物，它不仅具有与未降解的丝心蛋白和丝胶蛋白、丝心蛋白H-链和L-链、或丝胶蛋白成分a相关的优良的促细胞生长活性，而且具有分子量低于200,000的丝心蛋白和丝胶蛋白固有的优良的触感、延展性等。
特别的，目的是利用具有上述优良特性的来自丝蛋白的多肽的水溶液作为药物、准标准药物(quasi drug)、化妆品等的材料或食品材料等。
解决问题的方式本发明预先发现来自丝心蛋白特定位点的肽链具有促细胞生长功能，并且积累了特定氨基酸序列的肽链具有促细胞生长功能的知识，该特定序列存在于一条或多条分别选自构成来自家蚕的丝心蛋白的H-链的N-末端部分(I)、非结晶部分(A)和C-末端部分(a)的肽链，以及来自天蚕(Antheraeayamamai)的丝心蛋白的非结晶部分的肽链，这些发现已用来申请专利。
基于这些认识，发现只要肽链保留有与上述促细胞生长功能相关的特定的氨基酸序列，即使丝蛋白的分子量减小到200,000或更少，丝蛋白的促细胞生长功能也不会丢失太多，这就促使了本发明的完成。
即本申请的第一个特点是提供一种生产来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽组合物的方法，其中(1)将来自家蚕或天蚕(Antheraea yamamai)的生丝蛋白材料(raw silk protein material)溶解于中性盐水溶液，其中生丝蛋白材料的平均分子量大于200,000并且在该生丝蛋白材料来自家蚕的情况下丝心蛋白的至少部分或全部的H-链和L-链和丝胶蛋白a保持未降解，和(2)随后用肽键断裂试剂处理该溶液使丝蛋白的特定氨基酸残基之间的肽键断裂。
本申请的第二个特点是提供一种根据上述第一特点所述的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中该生丝蛋白材料由一种或多种选自家蚕或天蚕吐(spun)的茧丝、茧丝处理材料的生丝和丝线，以及丝织物和丝织品的未脱胶材料、半脱胶材料和脱胶材料组成。
本申请的第三个特点是提供一种根据上述第一特点所述的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中生丝蛋白材料的中性盐水溶液用肽键断裂试剂处理后再对生成的多肽组合物进行脱盐处理。
本申请的第四个特点是提供一种根据上述第一特点所述的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中肽键断裂试剂是酶、羟胺或稀酸。
本申请的第五个特点是提供一种根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中肽键断裂试剂是羟胺。
本申请的第六个特点是提供一种根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中肽键断裂试剂是酶，选自赖氨酰内肽酶，胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
本申请的第七个特点是提供一种根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中特定的氨基酸残基之间的肽键是Asn-Gly键。
本申请的第八个特点是提供一种根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽组合物是水溶液形式的。
本申请的第九个特点是来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽的水溶液，其中该功能性多肽经下列步骤获得(1)将来自家蚕或天蚕(Antheraeayamamai)的生丝蛋白材料溶解于中性盐水溶液，所述的生丝蛋白材料平均分子量大于200,000并且在该生丝蛋白材料来自家蚕的情况下丝心蛋白的至少部分或全部的H-链和L-链和丝胶蛋白a保持未降解，和(2)随后用肽键断裂试剂处理该溶液使丝蛋白的特定氨基酸残基之间的肽键断裂再进行脱盐处理。
本申请的第十个特点是提供一种利用来自丝蛋白的功能性多肽用于皮肤护理药物、准标准药物和化妆品材料的方法，通过下列处理(1)将来自家蚕或天蚕(Antheraea yamamai)的生丝蛋白材料溶解于中性盐水溶液，所述的生丝蛋白材料平均分子量大于200,000并且在该生丝蛋白材料来自家蚕的情况下丝心蛋白的至少部分或全部的H-链和L-链和丝胶蛋白a保持未降解，(2)随后用肽键断裂试剂处理该溶液，使丝蛋白的特定氨基酸残基之间的肽键断裂，再在断裂后将该溶液进行脱盐处理获得来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽的水溶液，以及(3)将该功能性多肽的水溶液转变成薄膜、粉末、凝胶或乳剂。
附图简介附
图1附图1表示试验样品2至4的电泳图。
附图2附图2表示试验样品7至9的电泳图。
实现本发明的最佳模式本发明的来自丝蛋白的功能性多肽组合物通过下列的基本步骤(1)至(3)制备(1)将来自家蚕(domesticated silkworm)或天蚕(Antheraea yamamai)的未降解丝蛋白或平均分子量不小于200,000并且在该生丝蛋白材料来自家蚕的情况下丝心蛋白的至少部分或全部的H-链和L-链和丝胶蛋白a保持未降解的生丝蛋白材料溶解于中性盐水溶液。
(2)随后将肽键断裂试剂(酶、羟胺或稀酸)加入上述的丝蛋白中性盐水溶液进行处理，使丝蛋白的特定氨基酸残基(Asn-Gly键)之间的肽键断裂以形成分子量减小的多肽，其平均分子量不低于10,000并且不高于200,000。
(3)对分子量减小的平均分子量不低于10,000并且不高于200,000的多肽的中性盐水溶液进行脱盐处理以纯化。
将得到的多肽水溶液根据所需用途转变成薄膜或粉末形式或以凝胶或乳液等的形式使用。
既然本发明中的生丝蛋白材料和特定肽键断裂的条件是重要因子，首先，这一方面将在下文中详细描述。
为了利用丝心蛋白的促细胞生长活性，所使用的原材料是保留了丝心蛋白的H-链和L-链和丝胶蛋白a成分的丝蛋白。
这些丝蛋白在特定氨基酸残基之间断裂而使丝蛋白的分子量减小。
换句话说，丝蛋白中肽键的复杂断裂不会发生或几乎不发生。
优选使用酶或可选择的化学制品在特定氨基酸残基间断裂丝蛋白。
通常在温和条件下用蛋白酶进行蛋白质的断裂，因此，氨基酸侧链的修饰不会发生。
同时由非特异断裂造成的复杂片段也可被避免。
因此，达到氨基酸水平或接近该水平的蛋白酶解很少发生。
这些蛋白酶包括赖氨酰内肽酶(1ysyl endopeptidase)、丝氨酸蛋白酶、金属内切蛋白酶、精氨酰内肽酶、金属蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase、胃蛋白酶、肾素(rennin)、胰酶制剂、弹性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶、二肽酶等。
除了酶，化学制品高特异性的多肽断裂方法也是适用的。
高特异性的多肽化学断裂方法中使用的化学制品包括溴化氰、N-溴丁二酰亚胺(N-bromosuccinimide)、BNPS-3-甲基吲哚(2-(2-亚磺酰硝基苯(nitrophenylsulfenyl))-3-甲基-溴吲哚、二甲亚砜、O-亚碘酰基苯甲酸、羟胺、稀酸等。
通常丝加工过程中丝蛋白分子量的减小在电泳图上给出了不清晰的宽带，而通过酶或可选化学制品的方式将丝蛋白断裂成较小分子新确定除了丝蛋白成分外的一条窄(sharp)带。
优选可确定较多窄带。
因此减小了分子量的丝蛋白保持了在未降解的丝蛋白中呈现的细胞生长活性。
例如，来自家蚕的丝心蛋白H-链的分子量是约350,000，当H-链在特定氨基酸残基间断裂时在电泳图上出现与原H-链带一样窄的分子量低于H-链的较多新条带。
换句话说重要的是在通常茧处理中丝蛋白分子量减小的情况下电泳图上不会只出现不清晰的宽条带，而是出现与H-链和L-链的条带一样窄的单个或优选多个(2或更多)的条带。
一般酶的分子量大于大约10,000。
另一方面，对于肽断裂有特异性的化学制品的分子量小于大约10,000。
解决问题优选是用于断裂丝蛋白肽键的试剂的分子量很低。
例如当丝蛋白和断裂试剂通过透析加以分离时，断裂试剂的分子量低于大约10,000可通过其分子量使断裂试剂轻易的从来自丝蛋白的断裂多肽中分离出来，因为来自丝蛋白的断裂多肽的分子量大部分都大于约10,000。
从这点来说，用分子量低于10,000的试剂的断裂优选于用酶进行断裂，以使丝蛋白肽键的断裂一致。
羟胺(NH2OH)和稀酸是特别优选的。
酶具有大于约10,000的分子量，在其断裂肽键后，就被变性和灭活。
酶是蛋白质，因此可被变性，例如通过高温(约90℃)处理。该方法根据每种使用的酶在一定范围内变化，而且即使如果在来自丝蛋白的多肽中含有失活的酶，将其作为皮肤护理物质也不会有功能的问题。
然后，丝蛋白肽键在特异氨基酸残基间断裂后，断裂肽的平均分子量应如预期的低于200,000，以使得不会由于摩擦、振动等通过剪切使其水溶液形成凝集物。
在150,000至200,000的分子量范围内几乎不能通过轻度剪切形成凝集物。进一步的优选分子量低于150,000。
在10,000至150,000的分子量范围内即使通过强烈剪切也几乎不能形成凝集物。
另一方面，分子量大于10,000，优选大于40,000就使得在将来自丝蛋白的断裂多肽的水溶液进行透析后有效形成凝胶，并且也可以轻易的形成进一步具有强度和弹性的非晶体薄膜。
在本发明中，通过酶断裂方法或化学断裂肽键的方法，丝蛋白的分子量减小到10,000至低于200,000，优选40,000至150,000，同时不损坏存在于丝心蛋白H-链和L-链以及丝胶蛋白a成分的促细胞生长功能，并且来自丝蛋白的多肽水溶液即使在通过摩擦等对溶液进行剪切时也不会形成凝集物，而具有优良的触感并用作皮肤护理物质。
进一步，这被转变成粉末、薄膜、凝胶等或经乳化生成创伤被覆材料和化妆品材料。
肽键的断裂可在中性盐溶解材料，溶解材料的透析中或透析后的任何阶段进行。
优选断裂肽键的试剂在丝蛋白为溶解状态(丝蛋白在溶液中为非晶体或不定形状态)时起作用。
此外，很多断裂试剂可被使用。
优选当使用酶作为断裂试剂时在断裂后酶被灭活。
下文将详细描述上述的方法。
A.原料通常蚕将丝分泌到体内腺体腔中，这种丝被称为液体丝。
家蚕的液体丝由丝心蛋白和丝胶蛋白(这些被称为丝蛋白(silk protein))组成，家蚕的液体丝心蛋白分子量约为370,000[Tasiro Yutaka和Otsuki Eiichi，细胞生物学期刊(Journal of cell Biology)，Vol.46，P1(1970)]。
这被称为未降解的丝心蛋白。
进一步的分子量370,000的丝心蛋白分为分子量约350,000的单元(H-链)和分子量约25,000的单元(L-链)。
丝胶蛋白由4种成分组成，优良促进细胞生长活性的成分的分子量是400,000(见专利文献18)。
具有这样分子量大小的丝胶蛋白被称为未降解的丝胶蛋白。
在此，主要由丝胶蛋白或99％或更多丝胶蛋白组成的茧丝也可作为原料(raw material)，其中所述丝胶蛋白由丝胶蚕(例如Sericin Hope)制得。
尽管丝胶蚕是家蚕的变种，正常和变种的丝胶蛋白质没有差别。
另一方面，来自野生蚕的丝蛋白也可作为生丝材料(raw material)。
野生蚕属于天蚕属(Antheraea)，如Cricula trifenestrata，Samia cynthiaricini，Antheraea pernyi(包括Antheraea mylitta等)，天蚕(Antheraea yamamai)形成类似的丝蛋白成分。
例如，在来自Cricula trifenestrata的丝蛋白[H.Yamada和K.Tsubouchi，野生蚕蛾和丝的国际期刊(International Journal of Wild Silkmoth & Silk)，Vol.6，P.47-51(2001)]中丝心蛋白显示分子量为350,000的物理特性，其中分子量约为180,000的单元经S-S键结合在一起。
另一方面，丝胶蛋白形成约为400,000的分子量。
蚕在结茧期吐液体丝以形成茧(由茧丝和蛹组成)。
在茧丝中，中心是丝心蛋白，外围是丝胶蛋白，已知其比率为70-80％(丝心蛋白)20-30％(丝胶蛋白)。
生丝是由几个至几十个茧丝纺(spin)成的。
用生丝织成的织品被称为生丝织品(raw silk fabric)。
本发明的原材料包括由如家蚕和野生蚕的蚕种纺成的所有蛋白纤维。蛋白纤维是，例如茧丝、生丝、丝织品和织物(knif)、丝线(丝心蛋白纤维)、上述丝的残留物或其未脱胶材料，半脱胶材料和脱胶(degummed)材料、纤维、粉末、薄膜等。
但是必须要求这些来自家蚕的丝心蛋白H-链部分，丝胶蛋白a的相关成分等原材料保持未降解。
确认丝心蛋白H-链和成分a的存在可通过观察其电泳图上相应条带的存在进行。
因此使用分子量(分子量平均)不低于200,000的生丝蛋白材料。
将丝胶蛋白从茧丝、生丝或生丝织品中除去的过程称为脱胶，脱胶后的纤维是丝线或丝心纤维。
应当指出不对丝胶蚕茧进行脱胶。
通过干燥和煮沸由从事养蚕的桑农生产的茧制备丝线，然后抽卷生丝，再将生丝或生丝织品脱胶以得到丝线或丝织品。
该过程中形成的絮片是残留的线。
茧的干燥通过在115℃至120℃的逐渐降低至约80℃的温度下干燥茧超过5至6小时进行。
煮茧通过用100℃至105℃的水蒸气和热水处理约10分钟进行，茧被热水充满。
当茧经过这种生产生丝(茧生产)的传统工艺处理时，多半的丝心蛋白H-链被降解了。
B.脱胶进行脱胶是为了除去原材料中的丝胶蛋白，其最传统的方法是在含有碱性钠盐和肥皂的水溶液中煮沸(碱皂脱胶)。
其它方法包括只用碱性钠盐脱胶(碱脱胶)，通过沉浸于加压的热水中(例如120℃的热水)脱胶(高压脱胶)，用酶脱胶(酶脱胶)等。
有一种只在热水中煮沸进行脱胶的情况，但是该方法不很普遍因为留下了很大部分的丝胶蛋白。丝线就是通过这样的脱胶获得的。
但是，当生丝用常规的碱皂(例如在0.05％的碳酸钠水溶液中于95℃至99℃脱胶2小时)脱胶，丝心蛋白的H-链和L-链很大程度上被降解了，其分子量减小到约50,000至100,000。
当丝蛋白的肽键通过上述的传统茧生产工艺异型断裂并导致分子量减小时，丝蛋白的促细胞生长活性也降低了，因此，本发明中必须避免由传统工艺导致的分子量减小。
未进行脱胶的情况被称为未脱胶，脱胶不完全的情况被称为半脱胶。尽管半脱胶材料通常也称为丝线，而不被称为丝心蛋白纤维。
这里的丝心蛋白纤维指多于99％的丝心蛋白。
这些也是茧加工工艺的一部分。
本发明中用于原材料脱胶的碱性水溶液包括碱性钠盐水溶液如碳酸钠、碳酸氢钠、硅酸钠、偏硅酸钠、磷酸钠、氢氧化钠。
在碱脱胶的情况下，碳酸氢钠是优选的，因为其提供了适当的缓冲效果。
进一步的本发明在脱胶中可保留丝胶蛋白。
这相应于半脱胶或未脱胶。
更进一步，可在溶解时加入来自丝胶蚕茧的纤维以提高丝胶蛋白的比例。
重要的是丝心蛋白的H-链和丝胶蛋白的成分a保留在原材料中。
因此，进行温和的脱胶以留下丝胶蛋白成分a获得保留丝胶蛋白的原材料(见专利文献17)。
对于温和的脱胶，例如，茧丝沉浸于接近中性(pH6至8)的水中煮沸约一小时或经受另外与此相应的处理。
例如，当使用碳酸氢钠时，其浓度调节至约0.05％，茧丝煮沸约10分钟并充分搅拌。
另一方面，当大部分丝胶蛋白被除去(多于99％的丝心蛋白)，进行脱胶使丝心蛋白的H-链尽可能的保持未降解(见专利文献15)。
例如，当通过在0.05％的碳酸钠水溶液中煮沸对茧丝脱胶时，脱胶进行大约30分钟内，优选约10分钟内。
在可选的情况下，相应的条件都可应用。
C.原材料的溶解本发明来自丝蛋白的多肽是通过如下溶解上述的原材料获得的作为生丝线增溶剂的中性盐包括，例如氯化钙、乙二胺铜、硫氰酸钠、硫氰酸锂、溴化锂、硝酸镁等。
中性盐优选饱和水溶液或浓度不低于50％饱和[重量(g)/体积(ml)]。
在含有丝心蛋白和丝胶蛋白的情况下，例如茧丝、未脱胶材料、半脱胶材料等以与溶解丝线类似的方式利用上述的中性盐进行溶解。
另一方面，当如在来自丝胶蚕的茧丝的情况下丝胶蛋白占98％或更多，用8M的尿素于70℃至90℃溶解约10分钟。
可选的，用浓度不低于7M的溴化锂于45℃在约20分钟内进行溶解。
在溶解原材料于中性盐水溶液中的步骤中可将例如甲醇、乙醇和丙醇的醇类加入中性盐。
当用氯化钙作为中性盐时，在不高于94℃的温度下进行溶解，优选范围是75℃至85℃。
当使用溴化锂时，原材料在低于约50℃的温度下进行溶解。因此根据使用的中性盐，溶解条件是变化的，丝心蛋白H-链和丝胶蛋白成分a保留或其分子量保持200,000或更高的方法可用于溶解。
在上述的溶解情况下，通过搅拌加速溶解。
低温时溶解困难。
尽管较高温度促进溶解，但也可能发生分子量的剧减。
用中性盐溶解的原材料的溶液中除了丝心蛋白或丝心蛋白和丝胶蛋白的混合物外还含有中性盐、醇等。
从此溶液中，不溶物质首先被除去，然后利用透析薄膜或透析设备除去分子量低于10,000的化合物。
必须注意到即使使用分离水平为约10,000的透析薄膜进行分子分离，分子量5,000左右的化合物由于其分子形状不能被分离而可能保留。
通过这种透析获得丝蛋白水溶液。
在该丝蛋白水溶液中，容许中性盐保留在0.001至0.2M。
D.肽键的断裂肽键断裂进行是通过将断裂特定肽键的试剂加入用例如中性盐作为增溶剂溶解的丝蛋白溶液。
这种情况中，可使用多种断裂试剂。
酶，或化学物质如稀酸和羟胺可用作断裂试剂。
稀酸中，可使用浓度不大于2N的盐酸或硫酸，优选甲酸。
在使用羟胺的情况下，加至0.1至3M。
当羟胺的浓度被稀释，肽键的断裂不规律发生，导致不一致的断裂。
当浓度过高，肽键断裂的特异性被破坏。
断裂的条件，用碱(例如1NNaOH)调节溶液接近pH9(pH8.0至pH10.0)并在约45℃(30℃至50℃)处理4小时(3至6小时，优选3至5小时)以使得丝蛋白中天冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)之间的肽键断裂。
在断裂处理后，用稀酸(例如甲酸)调节pH到2至3以终止反应。
因此获得了几种丝蛋白中Asn和Gly之间特异断裂的多肽片段。
同时，丝心蛋白前体蛋白的氨基酸序列以GenBank No.P05790登记H-链和以GenBank No.P21828登记L-链。
H-链由主要含有甘氨酸(G)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)的称为结晶部分的重复和富含其他氨基酸残基称为非结晶的部分组成。
H-链中结晶部分占了很大的区域，并且该结晶部分有时分为具有相对结晶度高的部分和结晶度相对低的部分。这两部分都主要由(G-X)(其中X主要代表Ala，Ser，Tyr和Val)的重复组成，因此这被认为是不需要加以区分的结晶部分。
非结晶部分的氨基酸残基数目为28至32，H-链中有11个非结晶部分。其中8个部分含有Asn-Gly键。
因此如果丝心蛋白前体精确的在8个部分的Asn-Gly键处断裂，可计算出形成一组氨基酸残基分别为688，1259，985，644，539，391，347，607和378的9个片段。
必须注意到距离丝心蛋白前体的N-末端起始肽到底多远的氨基酸残基涉及组成茧丝是未知的。
此外，C-末端具有116个氨基酸残基的片段经S-S键结合到L-链上。
因此，即使9个片段的100％的Asn-Gly键断裂，688个残基的片段使得片段的残基数较少而116残基的片段使得片段的残基较多。
假定一个氨基酸残基的分子量约为110，大部分片段的分子量在约40,000至100,000的分子量范围内，并且在该范围内电泳图上出现9个窄带。
但是，也可接受除了组成丝蛋白的每个成分在电泳图上出现如其一样窄的一个或多个条带，它们的平均分子量降低为10,000至低于200,000，因为50％或更多的Asn-Gly键断裂，甚至100％的键没有断裂。
用酶断裂肽键，赖氨酰内肽酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等是优选的。
在赖氨酰内肽酶的情况下，肽键特异的在赖氨酸残基的羧基侧断裂。
丝蛋白用酶处理时是以水溶液状态或用4M或更低的尿素水溶液溶解的状态。
加入的酶是丝蛋白的1％(重量)，然后在pH8.0至10，30至40℃处理30分钟至4小时。
进一步的该酶(赖氨酰内肽酶)在50℃或温度更高时不稳定，并在70℃或温度更高时失活。
丝蛋白中肽键断裂的要点是1)断裂的丝蛋白片段保持未降解丝蛋白优良的促细胞生长活性。换句话说来自丝心蛋白和丝胶蛋白的多肽的细胞生长率分别不低于未降解丝心蛋白和未降解丝胶蛋白的50％；2)多肽水溶液不会由于例如摩擦的剪切而形成凝集物；以及进一步优选3)多肽溶液静置时，在数天内(1-7天)转变成凝胶。
为了达到这些条件，所有断裂片段的分子量应当大部分降低到100,000至200,000之间。除了组成未降解的丝蛋白的各个成分之外，在电泳图上将会观察到分子量范围低于200,000的窄条带。
E.来自丝蛋白的多肽水溶液的制备在断裂处理肽键后，通过脱盐等方法从溶液中除去除了来自丝蛋白的多肽之外的其他物质。
在肽键是通过酶断裂的情况中，脱盐后将来自丝蛋白的多肽水溶液加热到70-90℃，使酶失活。
可以在层析柱(SephadexG-25)中进行脱盐。
在用水进行透析的情况中，通过每2-4小时更换作为外部透析液的50倍体积的水4次或者更多次，或采用其他等效的方法来实施透析。
通过这种方式，获得来自丝蛋白的多肽的水溶液，其中虽然丝蛋白的分子量下降，但是保留了优良的未降解的丝蛋白的促细胞生长活性，而且也不容易通过剪切从中形成凝集物。
可以在脱盐过程中将断裂试剂加到丝蛋白水溶液中断裂肽键。
而且，也可以在脱盐之后将断裂试剂加到丝蛋白水溶液中。
断裂的方法可以根据断裂试剂而改变。无论是何种断裂试剂，都必须在断裂之后，通过透析或者其他方法除去盐、断裂试剂(稀酸或者NH2OH)等。当断裂试剂是一种酶时，优选使酶灭活。
当氯化钙用作中性盐时，将一滴硝酸银滴到部分外部透析液体中来判断脱盐程度。当滴加部分几乎不变为白色时，表示脱盐已经完成。此外，也可以通过测定外部透析液的传导率来进行判断。
F.薄膜、粉末和凝胶的制备从以非晶态溶解的来自丝蛋白的多肽水溶液制备得到薄膜、粉末、凝胶等。
得到的薄膜、粉末、凝胶等可以用作皮肤护理材料。
1)薄膜形成在上述E所描述的多肽水溶液中，丝蛋白的特定肽键已经用肽键断裂试剂断裂，将其加到平板上，空气干燥得到薄膜。
可以通过改变多肽水溶液的浓度、加到平板上时每单位面积上多肽水溶液的体积等，来改变薄膜的厚度。
当制备非晶态的薄膜时，薄膜应具有100μm的厚度，优选为不大于60μm。
如果厚度很大，需要花费时间来干燥薄膜，会导致结晶。
特别地，非晶态的薄膜特别适合于皮肤护理材料，例如创伤被覆。
另一方面，薄膜可以是结晶态的，但是结晶态的薄膜不能用作创伤被覆材料。
通过上述方式得到的非结晶或者结晶的薄膜研磨之后成为来自丝蛋白的多肽的非晶态或结晶态粉末。
2)粉末形成非晶态粉末不仅可以通过按F.1)中的描述研磨薄膜得到，而且可以通过喷雾干燥或者冷冻干燥E中所述的多肽水溶液，再经过研磨、搅拌，加入乙醇、冷冻处理等，然后干燥、研磨等得到。
3)凝胶形成为了形成凝胶，来自丝蛋白的多肽水溶液优选为自然放置(静止放置)。
假定当水凝胶中的多肽浓度超过一定水平，一条多肽链和其他邻近的含水多肽链之间形成氢键，这些肽链松散结合在一起构成三维网眼，从而发生凝胶形成。
凝胶形成是含有大量水分的多肽的结晶(β)，其被称作水凝胶。
这种水凝胶很容易损坏，以至于其凝胶状态轻易就受到外力的破坏。
某些种类的凝胶具有通过搅拌部分凝胶可溶解在水中的特性。这种凝胶指水凝胶。
为了制备水凝胶，当来自丝蛋白的多肽水溶液被自然放置时，通过使温度高于室温(低于约30℃)加速凝胶形成，但是如果温度大于或者等于100℃，趋向发生分子量降低。
进一步的，由于进行多肽剪切，建议避免煮沸多肽水溶液。
适合的凝胶形成温度为40-90℃，优选为50-80℃。
而且，来自丝蛋白的多肽水溶液的浓度越高，越早发生凝胶形成。因此，适合的浓度为不低于0.1％，优选为不低于3％。
另外，浓度必须低于25％。
浓度必须小于25％的原因在于，如果在溶解原料、断裂肽键、脱盐等过程中多肽不能转变成液体状态，该过程就不可能有效地进行。
适合的多肽水溶液的浓度为0.1-15％，优选为3-10％。
来自丝蛋白的多肽水溶液的水凝胶可以通过，例如等电点方法、在多肽水溶液中略微地促进多肽结晶的方法等来获得。但是，如果多肽水溶液用作皮肤护理材料，优选静置该溶液至转变成凝胶。
G.来自丝蛋白的多肽水溶液或其水凝胶的乳化可以通过添加油成分、接着搅拌来乳化上述多肽水溶液及其水凝胶。
用于乳化的油成分包括例如橄榄油、山茶油(camellia oil)、鳄梨油(avocado oil)、椰子油、葵花籽油、桃仁油、棕榈油和蓖麻油等植物油，和动物油，蜡等以及例如jojoba油和蜂胶等，如在化妆品成分标准中描述的油和蜡等的油成分。
各种油成分之间乳化的特性差别不大。
1)来自丝蛋白的多肽水溶液的乳化已经发现来自丝蛋白的多肽水溶液可以用作乳化剂。
至于乳化，可以通过适当地调节与多肽水溶液的浓度和体积相关的油成分的比例来制备目的乳化物质。
通过混合多肽水溶液和油成分进行乳化的多种方法，包括搅拌方法、研磨-混合方法等；然而，任何方法都可使用。
根据多肽水溶液的浓度和油的比例，适合使用各种机器来乳化。
被乳化物质的粘性根据来自丝蛋白的多肽水溶液的浓度而变化。
如果多肽水溶液的浓度低，那么其细胞生长活性也低。
因此，用于乳化的多肽水溶液的浓度不低于0.1％，优选为不低于0.5％。
另外，当多肽水溶液的浓度很高时，其在皮肤上的铺展性(延展性)变得很差，导致适用性降低。
因此，适合的浓度为不高于15％，优选不超过10％。
如果来自丝蛋白的多肽水溶液的浓度低(不高于约3％)，被乳化的物质为液体，适合于作为乳剂。
当多肽水溶液的浓度升高(不低于约3％)，溶液变得粘稠，适合于乳霜和药膏。
如果多肽水溶液的浓度低，其细胞生长活性低，如果多肽水溶液浓度高，则铺展性差等事实都可以在下述水凝胶的乳化中应用。
2)水溶性多肽凝胶的乳化已经发现，当与油成分混合时，来自丝蛋白的多肽的水凝胶可以作为一种乳化剂。
乳化的方法与在1)中描述的多肽水溶液的乳化方法相同。
当凝胶状态的多肽浓度为约6％或者更高时，混合凝胶和油成分以及搅拌该混合物很困难。
当浓度升高，在搅拌时加入水便于搅拌和乳化。
需要多肽重量的1-2倍的水。
也就是说，应将5-20g水加入到100g浓度为10％的凝胶中并搅拌。
与乳化多肽水溶液时相比，在凝胶形成后乳化多肽水溶液在工业上是不利的，因为有许多凝胶形成过程。
但是，水溶性多肽凝胶被乳化具有优势，其油成分的比例小于足够乳化多肽水溶液的油成分的比例。
也就是说，当水含量相同时，采用水凝胶能够比使用多肽水溶液使油成分和多肽之间的比例更宽地变化，产生可得到具有不同特性的乳化物质的优势。
可以设想不是所有多肽链都必须与油成分结合，因为由于多肽水溶液形成凝胶，多肽分子间已经松散地结合。
更不用说，在不影响本发明的作用和效力的范围内，油成分如油和蜡、pH调节剂、防腐剂、粘性改良剂、增湿剂(moisturizer)、杀菌剂、抗炎剂、染料(dye)、香料化学物、抗氧化剂、紫外线吸收剂、维生素、有机或无机粉末、乙醇、碳水化合物等，或常用于皮肤护理的药膏、化妆品的成分等，，都可以根据需要混合到本发明的来自丝蛋白的多肽的被乳化的物质中。
H.来自丝蛋白的多肽的用途通过上述方法可以水溶液、薄膜、粉末、凝胶和乳剂等形式得到保持了优良的未降解丝蛋白的促细胞生长活性的来自丝蛋白的多肽。
这些物质可以激发皮肤细胞，促进其生长。因此，它们在下列用途中是特别有效的。
(1)被覆材料来自丝蛋白的多肽可以作为被覆材料用于促细胞生长活性降低的丝(例如，通过碱处理得到的结晶丝粉末)和其他材料(例如，如滑石粉的体用粉末，(body powder)如陶瓷粉末的有机和无机粉末，与活体接触的元件如眼镜、手表、戒指、穿耳的耳饰、注射器针头，和如与活体相接触的，手术器械的医疗设备)。
当多肽用作被覆物质时，通过将材料浸泡到来自丝蛋白的多肽的水溶液中，用来自丝蛋白的多肽包覆材料表面来改进材料的性能，给该材料的原有特性增加促细胞生长的功能。
为了增加该功能，薄膜的厚度为0.01-3mμ(.)，优选为0.1-1mμ(.)。
为了增强来自丝蛋白的多肽的附着，包覆时可使用粘合剂。
通过这种方式得到的改进的粉末特别适合作为体用粉末和粉底。
此外，当多肽用于穿耳的耳饰和注射器针头时，其可能抑制机体感染。
(2)薄膜非晶态薄膜吸收水分和防腐溶液(antiseptic solution)等而被溶解或者部分溶解。因此，该薄膜可以被单独使用或与织物或其他薄膜组合用作皮肤护理物质，粘附到皮肤上或以溶液形式被覆在皮肤上，或作为创伤被覆剂。
此外，吸收了皮肤水分的非晶态薄膜通过体温等释放水分，在约10-30分钟后变干。
如果该薄膜用作面膜等，由于干燥的薄膜中含有皮肤上不需要的油脂、脏物等，因此可以除去皮肤上不需要的细小物质。而且，当薄膜稀薄地留在皮肤上并且摩擦不能剥离时，就让其留在上面。
(3)粉末上述改进的粉末或通过研磨薄膜得到的粉末可单独用于创伤愈合或化妆，或被加入到其他创伤愈合药品和化妆品中作为皮肤护理粉末使用。
(4)凝胶凝胶通过加入到食品或胶凝剂和凝胶食物中使用。
(5)乳化物质乳化物质单独使用或作为创伤愈合剂和皮肤护理化妆品的添加剂。
特别地，作为药膏、乳霜、乳剂和调节剂的原料，本发明的从来自丝蛋白的多肽中制备的乳化物质具有优良的促皮肤细胞生长性、触感、附着性和铺展性。
当多肽用作乳化物质时，将来自丝蛋白的多肽、油成分和水在下述重量比例范围内混合，其中当来自丝蛋白的多肽的浓度为1％时，油成分为1-20％，水为80-90％，优选油成分是3-45％，水为55-97％，更优选油成分为7-30％，水为70-93％。
当来自丝蛋白的多肽的浓度为10％时，油成分和水在一定范围内混合，其中油成分为15-50％，水为50-85％，优选油成分为20-35％，水为75-80％。
从上述组合物的比率可以适当地确定其他比例。
这些组合物的比率与Kokai(日本，未审查的专利公开)No.2001-364489(参见专利文献14)中描述的大致相同。
本发明的来自丝蛋白的多肽的细胞生长率不低于未降解的丝心蛋白的50％，并且大部分不低于75％。
另一方面，在上述Kokai(日本，未审查的专利公开)No.2001-364489中描述的细胞生长率低于未降解的丝心蛋白的50％；因此，本发明的多肽细胞生长活性优良。
根据本发明的乳化物质的用途制备的乳化化妆品和准标准药物包括，例如，清洁化妆品(美容肥皂、洗面奶(facial wash)、洗发精、洗液等)，护发产品(头发染料、头发化妆品等)，基本化妆品(普通乳霜、乳剂、剃须膏、调节剂、古龙香水(cologne)、剃须洗液、化妆用油、面膜等)、化妆用化妆品(粉底(foundation)、眉笔、眼霜、眼影膏(eye shadow)、染眉油等)，芳香化妆品(香水等)，防晒(tanning and sunscreen)化妆品(防晒霜、防晒液、防晒油等)，指甲化妆品(指甲油等)，眼线膏化妆品(眼线膏等)，唇部化妆品(唇膏(lipstick)、唇油(lip cream)等)，口腔护理品(牙膏等)，沐浴化妆品(沐浴产品等)等。
作为药物，乳化物质可以用作创伤被覆剂例如药膏。
为了激发皮肤细胞，将本发明的来自丝蛋白的多肽的水溶液、薄膜、粉末、凝胶或乳化物质添加到传统的皮肤护理材料中是有效的。
不用说，在不影响本发明的作用和效力的范围内，可以根据需要混合如油脂和蜡的油成分、pH调节剂、防腐剂、粘性改良剂、增湿剂、杀菌剂、抗炎剂、染料、合成香料、抗氧化剂、紫外线吸收剂、维生素、有机或无机粉末、乙醇、碳水化合物等，或常用于皮肤护理的药膏、化妆品的成分等。
实施例1 用羟胺(NH2OH)断裂丝蛋白中的Asn-Gly键，断裂产物的电泳图，和平均分子量的测定。
以家蚕形成的1个星期的生茧作为原料。作为“试验样品1”。
将生茧的茧壳(100g)在80℃4000g 8M尿素中浸泡和脱胶7分钟。
在上述步骤中，充分搅拌除去丝胶蛋白。
该步骤中失重(脱胶失重)为24.7％。
为了检测存留的丝胶蛋白，将脱胶的蚕茧壳在4000g 0.05％碳酸钠水溶液中煮沸60分钟，结果脱胶失重0.7％。
可以认定在8M尿素中脱胶后的蚕茧壳的不低于99％是丝心蛋白纤维(丝线)。
这作为“试验样品2”。
接着，将通过在8M尿素中脱胶得到的15g丝线放入200ml 9M LiSCN中，在室温下(25℃)溶解。
将约30ml 50％羟胺加入到该溶液中，随后加入约6ml 1N NaOH来调节pH为9，然后将溶液的温度提高到45℃，溶液放置4小时。
之后，将16ml 99％甲酸加入该溶液，调节pH为2来阻断羟胺对Asn-Gly键的断裂。用水透析得到的溶液(在室温下)。
使用透析袋UC36-32-100(Sanko Junyaku Co.，Ltd生产)，100体积水用作外部透析液，每3小时更换5次水来进行透析。
在透析过程中充分搅拌水。
得到的来自丝心蛋白的多肽作为“试验样品3”。
如上所述，将通过在8M尿素中脱胶得到的15g丝线放入200ml 9MLiSCN中，在室温下溶解。
将该溶液放入透析膜(membrane)中，用水透析。用与上述相同的方式，将约30ml 50％羟胺加入到得到的丝心蛋白水溶液中。随后用1N NaOH调节pH为9。
该溶液在45℃下放置4小时并在用甲酸调节pH为2之后用水透析。
这样得到的来自丝心蛋白的多肽在此作为“试验样品4”。
在将试验样品2-4溶解在9M LiSCN中之后，用8M尿素置换并用2-巯基乙醇断裂S-S键，对试验样品进行电泳。
如下用电泳图和凝胶色谱柱测定Asn-Gly键断裂的丝蛋白片段的分子量。
用于电泳的凝胶为2-15％丙烯酰胺梯度凝胶。凝胶电泳后用CBB(染色液)染色，与对照标记物的分子量比较观察电泳图上的条带。
电泳图如附图1所示。
附图1中，试验样品2中可以清晰地识别出丝心蛋白的H-链和L-链条带。试验样品3中不能识别出H-链和L-链的条带，但是可以见到数条如H-链和L-链条带同样窄的条带，其在具有与H-链和L-链不同的分子量的部分。
当丝线用传统蚕茧生产方法加工时，例如丝线用碳酸钠等进行脱胶或者当丝线用如氯化钙等中性盐溶解，电泳图显示仅有的一片宽条带，区别于试验样品3的条带。
至于试验样品3，可以识别到7个清晰的条带。根据它们的分子量，每个条带分别对应约140、85、75、35、24、22和9kDa。
此外，略微地识别到一片分子量范围小于200,000kDa的宽条带。从试验样品3的电泳图可以认定，丝心蛋白中的大部分Asn-Gly键已经被断裂。
另一方面，与试验样品3的条带相比，试验样品4的由Asn-Gly键断裂产生的条带不清晰。但是，可以识别到85和9kDa的条带。
从试验样品3和4的电泳图可以推定，当LiSCN用作丝线的溶解剂(solubilizer)时，丝蛋白用LiSCN溶解，比由羟胺实现的Asn-Gly键的断裂产生更专一的断裂。
用凝胶色谱柱(Superdex 200 Pre grade，Pharmacia)进行分子量的测定。试验样品用8M尿素/40mM Tris-H2SO4(pH8)洗脱(0.6ml/min)，于275nm测定。
这些试验样品平均分子量的结果如表1所示。
将试验样品2-4溶解在9M LiSCN中，然后加到透析膜中，随后用水透析。将如此得到的丝蛋白和来自丝蛋白的多肽的水溶液放到手掌中揉搓，其中试验样品2的水溶液形成球形凝集物；但是试验样品3和4触感非常好，没有形成凝集物。
表1.每个试验样品的分子量
实施例2 来自丝蛋白的多肽的细胞生长活性如下测定实施例1中的试验样品1-4的细胞生长活性。
首先，如下将每个试验样品铺覆到细胞培养皿上。
将0.01g每个试验样品溶解到1ml的9M LiSCN中，用50体积的水透析每种溶液4次来制备各种试验样品的水溶液。
将1ml 0.0025％每种试验样品的水溶液加到细胞培养皿中(35mm.Falcon)，空气干燥，用2ml PBS洗涤3次，再次空气干燥，然后浸泡在70％乙醇中杀菌。
所用的细胞为人皮肤成纤维细胞(Kurabo Industries Ltd.生产)。
所用的培养基是人皮肤成纤维细胞生长用的低血清培养基(KuraboIndustries Ltd.生产，10ml LSGS加到500ml培养基106S中)。
至于培养，每个培养皿中加2ml培养液，接种70,000个细胞，培养3天。
至于细胞计数，每个培养皿中加入2ml培养基和0.1ml阿拉明蓝(Alamer Blue)(IWAKI)，在37℃下培养2小时。根据570nm和600nm下的吸收值计算出的阿拉明蓝的减少量与生长细胞的数量相关。
以在没有铺覆任何试验样品的培养皿中生长细胞的数量作为对照(100％)，铺覆了试验样品的培养皿中的细胞生长率如表2所示。
表2表明试验样品1-3都具有几乎相同的优良的促细胞生长活性。
与其他试验样品相比，试验样品4的细胞生长率稍低；但其细胞生长率与试验样品1、2和3的接近，并且任何试验样品都具有优良的促细胞生长活性。
表2.蚕茧壳(试验样品1)、丝线(试验样品2)、在用LiSCN溶解丝线的过程中用羟胺处理丝蛋白产生的多肽(试验样品3)和在丝线用LiSCN溶解和脱盐后用NH2OH处理丝蛋白产生的多肽(试验样品4)的细胞生长率。
实施例3 来自丝蛋白的多肽的凝胶形成和乳化将部分实施例1中的试验样品2-4的各种水溶液浓度调整到5％，70℃下放置。
试验样品2的水溶液在透析完成时转变成凝胶。
另一方面，试验样品3和4的各个水溶液在70℃下放置2-3天后转变成凝胶。
当用手轻轻揉搓凝胶物质时，试验样品2的凝胶立刻形成小的球形凝集物，但是试验样品3和4没有形成凝集物。
随后，将20g橄榄油加到70g试验样品3和4的各种凝胶中，接着用咖啡磨(coffee mill)(Personal Mill SCM-40A(Shibata Scientific Technology，Ltd.生产))搅拌该混合物30秒，从试验样品3和4都得到乳脂状的乳化物质。
即使将这些乳化物质涂抹到皮肤上，剧烈揉搓，也不会形成球形凝集物，该物质具有优良的铺展性、附着性和触感等。
实施例4 氯化钙溶解的丝线的脱盐过程中的NH2OH处理将200g由家蚕吐而成的生茧壳在煮沸的4g碳酸钠和8kg水的混合溶液中(约100℃)浸泡10分钟脱胶(“试验样品5”)。
上述步骤中，充分搅拌混合物。
将50g丝线(试验样品5)浸泡到约80℃的160g氯化钙、133g乙醇和207g水的混合液中，充分搅拌。
丝线在20分钟内溶解。
将该溶液放入透析袋(dialysis membrane)中，用水透析。
透析过程中，20体积的水作为外部透析液，每30分钟更换3次。
此时处于透析中期，完成了大约一半的脱盐。
在透析中期，往100g丝心蛋白溶液(浓度约6％)(45℃)中加入10cc 50％羟胺，接着再加入甲酸调节pH为9。
溶液放置4小时后，加入甲酸调节pH为2，并放入透析袋中，再用水透析。
透析结束后，将水溶液放到塑料盘中，干燥得到薄膜。该薄膜作为“试验样品6”。
用与实施例1相同的电泳方法，测定试验样品5和6的分子量。
证实试验样品5中丝心蛋白的H-链和L-链与实施例1中试验样品2的H-链和L-链一样明显。
在试验样品6的电泳图上，可以确定85、75和9kDa的条带。
试验样品6的水溶液置于70℃下形成凝胶。
当如实施例3中将橄榄油和水加入凝胶物质中进行乳化时，得到触感、铺展性和附着性等优良的乳化物质。
实施例5 用8M溴化锂(LiBr)溶解的丝线的NH2OH处理将50g实施例4中的丝线浸泡到400g 45℃的8M LiBr中，充分搅拌，使丝线在约10分钟内溶解。
将该溶液放入透析袋中，用水透析获得丝心蛋白水溶液。将该丝心蛋白水溶液的温度升高到45℃。往该溶液中加入50ml 50％NH2OH，接着再加入1N NaOH调节pH为9，溶液放置4小时。
此后，用甲酸调节溶液pH为2，放入透析袋中，用水透析。
在透析后得到的来自丝蛋白的多肽的分子量，用与实施例1相似的方式电泳检测。
结果，确定分别为85、75、35、22和9kDa的条带。
进一步的，透析结束后，将部分这种溶液浓度调节到5％，在70℃下放置，2天后形成凝胶。
将15g橄榄油加到50g这种凝胶材料中，用咖啡磨搅拌该混合物，得到乳脂状的乳化物质，其具有优良的触感、铺展性和附着性。
更进一步的，透析后将该溶液放到丙烯酸平板上，室温下空气干燥形成薄膜。
得到的薄膜(厚度约40μm)显示出水溶性(室温下按重量计为96％或更高溶于水)，并且用作来自非晶态丝心蛋白的多肽的薄膜。
实施例6省略比较实施例1丝胶蛋白的异型肽键断裂引起的分子量降低和促细胞生长活性将20g来自家蚕蚕茧(生蚕茧)的茧壳浸泡在100cc 80℃的8M尿素中15分钟，充分搅拌溶解蚕茧丝胶蛋白。
蚕茧壳的脱胶失去的为21.2％。
将蚕茧丝胶蛋白的水溶液放入透析袋中，用40体积水(60℃)作为外部透析液进行透析。
通过2天内换水8次进行透析。
煮沸透析后的丝胶蛋白水溶液(100℃)，加入碳酸钠(Na2CO3)使其浓度为0.05％。
在加入碳酸钠后煮沸0、2、5、10和30分钟时，取出部分丝胶蛋白水溶液，放入透析袋中，用水透析来制备用于分子量测定的试验样品。
进一步的，透析溶液用作细胞培养的试验样品。
用与实施例1和2中相同的方法测定得到分子量和细胞生长率。
不添加丝蛋白成分的情况设为对照(100％)。
结果如表3所示。
表3相应于时间的在0.05％碳酸钠水溶液中煮沸的丝胶蛋白的分子量和细胞生长率
实施例7 丝胶蚕的蚕茧壳的NH2OH处理在200cc 9M LiBr中，加入4g丝胶蚕(Sericin Hope)的蚕茧壳，在约45℃下充分搅拌约15分钟内溶解。
该溶液具有极高粘性。
将该溶液的1/3放入透析袋中，用水透析。
透析开始后的1天内，该溶液在透析过程中形成凝胶。
这种凝胶物质作为“试验样品7”。
将10cc 50％NH2OH加入到剩下的2/3该溶液中，进一步加入1N NaOH调节pH为9，接着将该溶液分成两份。分开的溶液在45℃下放置。
45℃下放置1小时和4小时后，用甲酸将各个溶液的pH调节到2，并将各个溶液放入透析袋中，用水透析(室温下)脱盐。
当在1小时时用甲酸调节pH为2，该溶液在透析结束时转变成凝胶。
这种凝胶物质作为“试验样品8”。
当在4小时时周甲酸调节pH为2，在透析结束时未观察到凝胶形成。
该溶液中的多肽作为“试验样品9”。
试验样品7-9的电泳图如附图2所示。
该电泳图是通过与实施例1中相同的方法获得的。
在试验样品7的电泳图上，可以确定丝胶蛋白的各个成分，a、d、b、c。
在试验样品8中不能确定丝胶蛋白的各个成分，a、d、b，也未观察到任何其他的窄条带。
在试验样品9中，可以确定分别对应36、14和6kDa部分的窄条带。
当将透析过程中的试验样品7-9放到手掌中揉搓，试验样品7和8形成球形凝集物；而试验样品9中未形成凝集物。
用与实施例2中相同的方法测定用作功能性多肽的试验样品9的细胞生长活性，与设定为100％的对照组细胞生长率相比，其显示为247％，得到具有优良的促成纤维细胞生长的来自丝胶蛋白的多肽。
将10g橄榄油加到30g试验样品9的水溶液中，用咖啡磨搅拌该混合物30秒，成为柔软的乳霜，对皮肤具有优良的触感、铺展性和附着性。
实施例8 被覆材料如下制备结晶丝的超细粉末。
来自家蚕的生丝在50倍生丝重量的0.1％碳酸钠水溶液中煮沸1小时以脱胶制备丝线。
将100g这种丝线浸泡在含有50g碳酸钠、2500g水和5g连二亚硫酸钠(sodium hydrosulfite)的溶液中，110℃(1.46个大气压)下放置5小时。
然后用水洗涤，干燥后研磨。
用装有1mm滤器的可旋转的撞击磨(percussion mill)(Fuji Denki KogyoK.K.生产，Sample mill KI-1)进行研磨，并进一步用装有间距为0.1mm的金属丝网的滤器进行研磨。
接着，在用搅拌式研磨装置(Ishikawa型)摩擦碾碎得到的粉末后，进一步用当前类型的研磨机(Nisshin Flour Milling Co.Ltd.生产，Current jet CJ-10)研磨该粉末，得到平均粒径为2.2μm的结晶超细丝粉末。
将50g该结晶超细丝粉末与50g上述实施例1中的来自丝心蛋白(试验样品3)的多肽的水溶液(浓度为4％)混合，干燥并研磨。
用装有1mm滤器的可旋转的撞击磨[Sample mill KI-1(FujiDenki KogyoK.K.生产)]进行研磨，随后进行摩擦碾碎(搅拌式研磨装置)，接着用装有间距为0.1mm的金属丝网的滤器进一步研磨。
得到的粉末的平均粒径为2.9μm，具有优良的触感、附着性和可塑性。
实施例9 丝心蛋白酶消化后的细胞生长活性(1)酶消化丝心蛋白、接着分离和分级剪切来自家蚕的蚕茧除去蚕蛹，将蚕茧壳(20g)浸泡在90℃的30倍蚕茧壳重量的8M尿素中10分钟，除去丝胶蛋白。
提取的残留物用水洗涤，干燥得到丝心蛋白。
将10g丝心蛋白浸没在100ml 9M LiscN中使之溶解，然后加入100ml蒸馏水，再以3,000rpm离心10分钟。
用50体积的水透析上清液。
使用半透薄膜进行透析，每30分钟换水4次。
透析后，再对溶液进行离心，往上清液中加入0.1M磷酸氢二钠(disodium hydrogenphosphate)(pH8.5)来调节pH为7至8。
往溶液中加入丝心蛋白含量的1/100的胰凝乳蛋白酶，在40℃下放置1小时。
该上清液中存在的蛋白作为“试验样品10”。
测定上清液中蛋白质的浓度。
(2)铺覆在细胞培养皿上加入70％乙醇，将试验样品10的水溶液的浓度调节为0.025％。取1ml该溶液加到由聚苯乙烯制成的培养皿(35mm，Faclon)中，空气干燥。
作为对照的培养皿仅含有1ml 70％乙醇，并空气干燥。
(3)细胞培养所用的细胞是冷冻的来自成年人的人皮肤成纤维细胞(SankoJunyakuCo.Ltd.的产品)。
所用的培养基是用于人皮肤成纤维细胞生长的低血清培养基(购自Kurabo Industries Ltd)。
在每个培养皿中加入2ml培养基，接种80,000个细胞培养3天。
(4)用阿拉明蓝染料测定活细胞数量在每个培养皿中加入2ml培养基和0.1ml阿拉明蓝(IWAKI)，37℃培养2小时。根据570nm和600nm下的吸收值计算出的阿拉明蓝染料的减少量获得活细胞数量。
上述对细胞生长率的测定按实施例1中的方法进行。
(5)分子量按照实施例1的描述测定试验样品10的分子量。
与没有添加任何丝蛋白成分的对照(100％)比较，铺覆了试验样品10的培养皿中人皮肤成纤维细胞的生长率以及试验样品10的分子量如表4所示。
表4铺覆了试验样品10的培养皿中人皮肤成纤维细胞的生长率及其分子量
铺覆了丝蛋白成分的培养皿中的细胞生长率高于对照，显示与未降解的丝心蛋白相似的值。
将上述(1)中描述的上清液中的试验样品10的蛋白浓度调节到3.5％，在80℃下放置3天内转变成凝胶。
另外，当该上清液(浓度3.5％)与30％(重量)的试验样品9混合，室温下放置2天内形成凝胶。
将12g橄榄油加入各种50g这些凝胶物质中并混合，得到触感优良并且不形成任何球形凝集物的乳霜。
实施例10 来自丝蛋白的功能性多肽作为添加剂生丝(150g)用碳酸钠(20g)、漂白剂(亚硫酸纳(hydrosulfite)1.5g)、螯合剂(Clewat，Teikoku Chemical Industries Co.，Ltd.2g)和水(6,000g)的煮沸溶液(约100℃)处理1小时，用水洗涤，干燥得到丝线(A)。
将丝线(A50g)用氯化钙(131g)、水(170g)和乙醇(108g)的溶液(约80℃)溶解1小时，然后用水透析脱盐制备丝心蛋白溶液(试验样品11)。
另外，家蚕编织(spun)5天的未经过加热等处理的蚕茧的茧丝(100g)，用碳酸钠(2g)和水(4,000g)的煮沸溶液(约100℃)处理10分钟，随后用水洗涤，干燥得到丝线(B)。
该丝线(B20g)在45℃的9M溴化锂(200ml)中溶解30分钟，加入50％羟胺(5ml)，接着加入1N氢氧化钠调节溶液pH为9。
将该溶液在45℃下放置4小时并用甲酸调节pH为2后，将得到的溶液放入半透薄膜中，水中透析，生成丝心蛋白溶液(试验样品12)。
试验样品12是本发明的来自丝蛋白的功能性多肽。
将试验样品11和12的浓度分别调节到约5％，将15g试验样品11和5g试验样品12混合(试验样品13)并在塑料平板上空气干燥。
得到的薄膜是水溶性的。
这种薄膜溶解得到的溶液铺展性和泡沫形成极佳。
试验样品11的电泳图上，丝心蛋白的H-链和L-链都不能被确认出，其平均分子量约为100,000。
至于丝线B，丝心蛋白的H-链和L-链都能被确认，其平均分子量约为250,000。
至于试验样品12，丝心蛋白的H-链不能被确认，而能略微地确认出L-链。除此之外，确认到分子量为约50,000、22,000、15,000和9,000等的新条带。
实施例11 对来自丝蛋白的功能性多肽的补充说明将家蚕编织5天的未经过加热等处理的蚕茧茧丝30g，在0.5g碳酸钠和1,000ml水的混合液中煮沸(约100℃)10分钟，对蚕丝进行脱胶。
将脱胶溶液放入半透薄膜中，用水透析获得丝胶蛋白溶液(试验样品14)。
为了将丝胶蛋白用作增湿剂，将2g丝胶蛋白溶液(试验样品14)加到10g丝心蛋白溶液(试验样品12)中混合，然后在塑料平板上空气干燥。
得到的薄膜是水溶性的。
混合溶液和该薄膜在水中溶解得到的溶液的铺展性和泡沫形成都极佳并且增强皮肤的保湿(moisture)感。
另外，将1g异三十烷(squalane)加到20g丝心蛋白溶液中(试验样品12)并混合，接着在塑料平板上空气干燥。
得到的薄膜是水溶性的。
此时，该混合溶液和该薄膜在水中溶解得到的溶液的铺展性和泡沫形成以及皮肤的保湿感也都极佳。
本发明的效果本发明的来自丝心蛋白的多肽具有10,000到低于200,000的范围内的平均分子量，以及与未降解的丝蛋白一样优良的促皮肤细胞生长活性。
而且，即使受到如摩擦的剪切，其溶液也区别于未降解的丝蛋白不会形成凝集物，并且具有优良的延展性。
它还可以用作乳化剂。
因此，从来自丝心蛋白的多肽得到的薄膜、粉末、水溶液、凝胶和乳化剂对于作为皮肤护理材料的药物、准标准药物、化妆品等来说都是非常有用的。
工业实用性本发明涉及促细胞生长活性、延展性等极佳的来自丝蛋白的功能性多肽组合物及其制备方法，以及该组合物作为皮肤护理材料在药物、准标准药物、化妆品等领域中的用途；只要不背离本发明实质，本发明可以应用于其他生物领域。
权利要求
1.一种生产来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽组合物的方法，包括将来自家蚕或天蚕的生丝蛋白材料溶解于中性盐水溶液，所述的生丝蛋白材料具有平均分子量大于200,000并且在该生丝蛋白材料来自家蚕的情况下至少部分或全部丝心蛋白的H-链和L-链和丝胶蛋白a未降解；随后用肽键断裂试剂处理该溶液；以及使丝蛋白的特定氨基酸残基之间的肽键断裂。
2.根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中该生丝蛋白材料由一种或多种选自家蚕或天蚕编织的茧丝、茧丝处理材料的生丝和丝线、以及丝织物和丝织品的未脱胶材料、半脱胶材料和脱胶材料组成。
3.根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中生丝蛋白材料的中性盐水溶液用肽键断裂试剂处理，然后对生成的多肽组合物进行脱盐处理。
4.根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中肽键断裂试剂是酶、羟胺或稀酸。
5.根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中肽键断裂试剂是羟胺。
6.根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中肽键断裂试剂是酶，选自赖氨酰内肽酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。
7.根据权利要求1的生产来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其中特定的氨基酸残基之间的肽键是Asn-Gly键。
8.根据权利要求1的生产功能性多肽组合物的方法，其中来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽组合物是水溶液形式的。
9.来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽的水溶液，经下列步骤获得将来自家蚕或天蚕的生丝蛋白材料溶解于中性盐水溶液，所述的生丝蛋白材料平均分子量大于200,000并且在该生丝蛋白材料来自家蚕的情况下至少部分或全部丝心蛋白的H-链和L-链和丝胶蛋白a未降解；随后用肽键断裂试剂处理该溶液；使丝蛋白的特定氨基酸残基之间的肽键断裂；以及断裂后对该溶液进行脱盐处理。
10.利用来自丝蛋白的平均分子量不低于10,000和不高于200,000并具有优良的促细胞生长活性和延展性等的功能性多肽水溶液作为皮肤护理药物、准标准药物和化妆品材料的方法，包括薄膜形成；粉末形成；凝胶形成；和乳化作用，其中的溶液经下列步骤获得将来自家蚕或天蚕的生丝蛋白材料溶解于中性盐水溶液，所述的生丝蛋白材料平均分子量大于200,000并且在该生丝蛋白材料来自家蚕的情况下至少部分或全部丝心蛋白的H-链和L-链和丝胶蛋白a未降解；随后用肽键断裂试剂处理该溶液；使丝蛋白的特定氨基酸残基之间的肽键断裂；断裂后对该溶液进行脱盐处理；以及转变成薄膜、粉末、凝胶或乳剂。
全文摘要
本发明目的在于提供来自丝蛋白的多肽组合物，其不仅具有优良的与未降解的丝心蛋白和丝胶蛋白、丝心蛋白的H－链和L－链、或者丝胶蛋白的成分相关的促细胞生长活性，而且具有分子量不高于200,000的丝心蛋白和丝胶蛋白所固有的优良的触感、延展性等。一种用于制备来自丝蛋白的功能性多肽组合物的方法，其具有不低于100,000和不高于200,000的平均分子量，具有优良的促细胞生长活性、延展性等，该方法包括将来自家蚕或者天蚕(Antheraea yamamai)的生丝蛋白原料溶解在中性盐水溶液中，在生丝蛋白原料来自家蚕的情况下，其平均分子量超过200,000，并且丝心蛋白的至少部分或全部H－链和L－链以及丝胶蛋白a未被降解；随后用肽键断裂试剂处理该溶液；并断裂丝蛋白上特定氨基酸残基之间的肽键。
文档编号C12P21/06GK1570128SQ200410045129
公开日2005年1月26日 申请日期2004年3月15日 优先权日2003年3月14日
发明者坪内纮三 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所