专利名称：大豆二酰甘油酰基转移酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域中与油脂代谢相关的大豆二酰甘油酰基转移酶及其编码基因与应用。
背景技术：
人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位，棕榈油及油菜子油分别为第二及第三(如表1所示)。
表1世界上主要植物油的生产
目前，我国栽培大豆的品质不高。东北2341份大豆品种资源的油份含量为19.15％±2.03％。255个育成品种的油份含量为20.33％±1.18％。而美国西部大豆油份含量一般在21.5％左右，东部也在21％左右，较东北大豆高0.5-1.5个百分点。提高含油量是大豆品质改善所追求的目标之一。由于含油量是多基因控制的数量性状，使大豆含油量的提高具有一定的难度。
自然界中存在多种不同结构的脂肪酸，例如种子三酰甘油中就发现有300余种脂肪酸，它们的链长从8个碳到22个碳不等，双键数目和位置也各不相同。大豆油脂的用途和经济价值是由它们的脂肪酸组成决定。目前生产的植物油所含脂肪酸的90％是软脂酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、亚油酸和芥酸，特定脂肪酸所占的比例不高。因此，有必要对脂肪酸组成进行调整以提供新的更有价值的高品质油脂。
作为储藏脂类，三酰甘油(TAG)在大豆荚中被大量合成，它是食用豆油的主要成分。大豆中TAG的合成途径称为Kennedy Pathway。该途径以脂酰CoA为原料，在二酰甘油乙酰转移酶(Diacylglycerol acyltransferase，DAGAT)的催化下由DAG(二酰甘油)合成TAG，此代谢步骤是该途径的最后一步，DAGAT也是该代谢途径中最关键的酶。有关研究发现DAGAT定位于内质网膜上。
发明内容
本发明的目的是提供与大豆油脂代谢相关的一种大豆二酰甘油酰基转移酶及其编码基因。
一种大豆二酰甘油酰基转移酶，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或与序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列具有至少95％的同源性且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质，或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由498个氨基酸残基组成的蛋白质，与拟南芥、水稻、烟草和油菜的同类蛋白比较发现MBOAT(membrane bound O-acyl transferase)活性中心在C端，序列2中自氮端到碳端第206-485位氨基酸残基。
GmDAGAT的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1646个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第50位到第1546位碱基，包含1497个碱基对，在3’端有100个碱基对非翻译区。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmDAGAT的编码基因导入植物，可获得改良油脂成份的转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明GmDAGAT的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
GmDAGAT是可以影响优质含量这一性状的多基因之一，GmDAGAT的活性高低同大豆含油量、油脂积累速率成正相关。因此该基因的克隆及功能鉴定对改良作物油脂成份、特别是对于改良大豆油脂成份，培育含优质油脂大豆品种具有重要理论和现实意义。对改良大豆油脂成份、培育含优质油脂大豆品种具有重要理论和现实意义。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1GmDGAGT基因在大豆不同组织中的表达特性图2GmDGAGT基因在不同大豆品种及栽培和野生品种间的多态性分析具体实施方式
实施例l、大豆GmDAGAT编码基因的筛选及其cDNA的克隆科学家们1998年根据胆固醇乙酰转移酶(ACAT)的序列得到两个高同源性的鼠EST克隆，从而克隆第一个DAGAT基因。随后根据这一序列相继得到酵母、拟南芥、人、油菜、烟草等的DAGAT基因。
本研究中，根据拟南芥DAGAT序列在Genebank中检索，结果得到2个大豆EST序列，据此设计引物DAGAT P1 5’TCA ACC TCT GTA TAG TAG TC 3’DAGAT P2 5’GAA CAG GCA TAT TCC ACA TC 3’从栽培大豆8904豆荚cDNA中克隆得到860bp的DAGAT部分编码序列。
为了得到全长cDNA序列，据此序列设计RACE引物DAGAT 5’RACE Primer 5’GGA AAT ACC ACA AGA GAA AGA CAA CAC 3’DAGAT 5’RACE NUP 5’CCA GTC TCT CAA TGA CTT TGA GC 3’DAGAT 3’RACE Primer 5’TTA CGC CAT CGA GAG AGT TCT GAA GC 3’DAGAT 3’RACE NUP 5’GAG CTT CTT CGA TTT GGT GAT CGT G 3’利用ClONETECH SMART RACE cDNA Amplification Kit反转录大豆8904豆荚总RNA。PCR得到DAGAT 5’、3’端DNA片段，克隆T载体，测序。获得DAGAT 5’3’端cDNA碱基序列。
设计引物P1 5’GTT AGT AAA CAC GCT CGC TCG GTC 3’P2 5’CTG CCA TGG TAG ATG AAA GTA CTC GTG 3’。
PCR栽培大豆8904豆荚cDNA，获得1646bp的栽培大豆GmDAGAT全长cDNA序列，为序列表中的序列1，其ORF从第50bp→1546bp，编码序列表中序列2蛋白质。
实施例2大豆DGAGT基因GmDGAGT的组织表达特性应用RT-PCR技术测定了不同组织中DGAGT基因的表达特性。分别提取了嫩叶、老叶、花及开花后10、20和30天的总RNA，以Tublin为内对照，进行RT-PCR分析，结果如图1所示，从图中可以看出，GmDGAGT在花、老叶、开花20天后均有表达，而在嫩叶及花后10天的果实中没有表达，表明GmDAGAT的表达情况与大豆种子发育、成熟密切相关。
实施例3 GmDGAGT基因在不同大豆品种及栽培和野生大豆间的多态性分析基于“等位基因挖掘法”的原理，以GmDGAGT核苷酸序列为探针，与分别用EcoRI，Pst I，Taq I，Hind III，Dra I酶完全酶解的不同品种的大豆基因组DNA杂交，以研究此基因在不同品种间的差异。结果发现不同栽培品种、不同酶切的杂交结果完全相同。
再以它为探针杂交与栽培大豆亲缘关系较远的半野生、野生大豆基因组DNA，发现不同品种的野生大豆杂交结果存在很大的差异，而不同品种的半野生大豆杂交结果相同。
进一步从栽培、半野生、野生大豆基因组中PCR DAGAT部分基因组DNA，测序发现栽培、半野生大豆DAGAT基因组DNA碱基序列完全相同，而野生大豆与他们存在一定差异，与Southern结果相同(如图2所示)。
通过RACE获得1.5Kb的大豆DAGAT全长编码序列。由此设计引物，PCR野生大豆cDNA得到全长野生大豆DAGAT序列。比较二者序列发现存在一定的差异。
实施例4、GmDGAGT的功能检验为了检验GmDAGAT合成TAG的能力，按照常规方法将全长的GmDAGAT cDNA序列构建酵母表达载体，转化入酵母细胞，筛选含有GmDAGAT表达载体的阳性克隆。
对筛选出的阳性克隆诱导表达，分析确定TAG高表达的诱导时间，采用Hara和Radin的正己烷/异丙醇萃取法提取样品中的总脂肪。利用气相色谱分析TAG在总脂中的含量，与转化空表达载体的酵母细胞中TAG的含量作对照，从而得出转化酵母细胞的GmDAGAT合成TAG的量。实验结果表明，转化GmDAGAT入酵母细胞后，酵母细胞的TAG含量可得到大幅度提高。
序列表<160>2<210>1<211>1646<212>DNA<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)<400>1ttatgcacat acaaactatg atatgagagc acttaccaaa tcagttgaaa agggagaagc 780tctgcccgat actctgaaca tggactatcc ttacaatgta agcttcaaga gcttagcata 840tttcctggtt gcccctacat tatgttacca gccaagctat cctcgcacac cttatattcg 900aaagggttgg ctgtttcgcc aacttgtcaa gctgataata tttacaggag ttatgggatt 960tataatagaa caatacatta atcccattgt acaaaattca cagcatcctc tcaagggaaa1020ccttccttac gccatcgaga gagttctgaa gctttctgtt ccaaatttat atgtgcggct1080ctgcatgttc tattgctttt tccacctttg gttaaatata ttggcagagc ttcttcgatt1140tggtgatcgt gaattctacc aggattggtg gaatgccaaa actgttgaag attattggag1200gatgtggaat atgcctgttc acaaatggat gatccgccac ctatattttc catgtttaag1260gcacggtata ccaaaggccg ttgctctttt aattgccttc ctggtttctg ctttattcca1320tgagctgtgc atcgctgttc cttgccacat attcaagttg tgggctttcg gtggaattat1380gtttcaggtt cctttggtct tcatcactaa ttatctgcaa aataaattca gaaactcgat1440ggttggaaat atgatttttt ggttcatatt cagtattctt ggtcaaccta tgtgcgtact1500gctatattac catgacttaa tgaataggaa aggcaaactt gactgaaggt gcacgtggat1560aagcttttct gtttttggag tgtataattg atgtcgatat gttgatcaat attggtttcc1620acgagtactt tcatctacca tggcag 1646<210>2<211>498<212>PRT<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)<400>2Met Ala Ile Ser Asp Glu Pro Glu Thr Val Ala Thr Ala Leu Asn His1 5 10 15Ser Ser Leu Arg Arg Arg Pro Thr Ala Ala Gly Leu Phe Asn Ser Pro20 25 30Glu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Gly Asp Asp Leu Ala Lys Asp Ser Gly35 40 45
Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Asp Ala Ala Asn Ser Gln Pro Gln Gln50 55 60Lys Gln Asp Thr Asp Phe Ser Val Leu Lys Phe Ala Tyr Cys Pro Ser65 70 75 80Val Pro Ala His Arg Lys Val Lys Glu Ser Pro Leu Ser Ser Asp Thr85 90 95Ile Phe Arg Gln Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Ile Val Val100 105 110Leu Val Ala Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Tyr115 120 125Gly Trp Leu Ile Lys Ser Gly Phe Trp Phe Ser Ser Lys Ser Leu Arg130 135 140Asp Trp Pro Leu Phe Met Cys Cys Leu Ser Leu Val Val Phe Pro Phe145 150 155 160Ala Ala Phe Ile Val Glu Lys Leu Ala Gln Gln Lys Cys Ile Pro Glu165 170 175Pro Val Val Val Val Leu His Ile Ile Ile Thr Ser Ala Ser Leu Phe180 185 190Tyr Pro Val Leu Val Ile Leu Arg Cys Asp Ser Ala Phe Leu Ser Gly195 200 205Val Thr Leu Met Leu Phe Ala Cys Val Val Trp Leu Lys Leu Val Ser210 215 220Tyr Ala His Thr Asn Tyr Asp Met Arg Ala Leu Thr Lys Ser Val Glu225 230 235 240Lys Gly Glu Ala Leu Pro Asp Thr Leu Asn Met Asp Tyr Pro Tyr Asn245 250 255Val Ser Phe Lys Ser Leu Ala Tyr Phe Leu Val Ala Pro Thr Leu Cys260 265 270Tyr Gln Pro Ser Tyr Pro Arg Thr Pro Tyr Ile Arg Lys Gly Trp Leu275 280 285Phe Arg Gln Leu Val Lys Leu Ile Ile Phe Thr Gly Val Met Gly Phe290 295 300
Ile Ile Glu Gln Tyr Ile Asn Pro Ile Val Gln Asn Ser Gln His Pro305 310 315 320Leu Lys Gly Asn Leu Pro Tyr Ala Ile Glu Arg Val Leu Lys Leu Ser325 330 335Val Pro Asn Leu Tyr Val Arg Leu Cys Met Phe Tyr Cys Phe Phe His340 345 350Leu Trp Leu Asn Ile Leu Ala Glu Leu Leu Arg Phe Gly Asp Arg Glu355 360 365Phe Tyr Gln Asp Trp Trp Asn Ala Lys Thr Val Glu Asp Tyr Trp Arg370 375 380Met Trp Asn Met Pro Val His Lys Trp Met Ile Arg His Leu Tyr Phe385 390 395 400Pro Cys Leu Arg His Gly Ile Pro Lys Ala Val Ala Leu Leu Ile Ala405 410 415Phe Leu Val Ser Ala Leu Phe His Glu Leu Cys Ile Ala Val Pro Cys420 425 430His Ile Phe Lys Leu Trp Ala Phe Gly Gly Ile Met Phe Gln Val Pro435 440 445Leu Val Phe Ile Thr Asn Tyr Leu Gln Asn Lys Phe Arg Asn Ser Met450 455 460Val Gly Asn Met Ile Phe Trp Phe Ile Phe Ser Ile Leu Gly Gln Pro465 470 475 480Met Cys Val Leu Leu Tyr Tyr His Asp Leu Met Asn Arg Lys Gly Lys485 490 495Leu Asp
权利要求
1.一种大豆二酰甘油酰基转移酶，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或与序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列具有至少95％的同源性且具有与SEQ ID№2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质，或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的大豆二酰甘油酰基转移酶，其特征在于所述大豆二酰甘油酰基转移酶是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
3.大豆二酰甘油酰基转移酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因为具有序列表中SEQ ID №1碱基序列的DNA片段。
5.含有权利要求3所述基因的表达载体和细胞系。
6.权利要求3所述基因在植物育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的基因，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.根据权利要求7所述的基因，其特征在于所述植物为大豆。
全文摘要
本发明公开了大豆二酰甘油酰基转移酶及其编码基因与应用，本发明所提供的大豆二酰甘油酰基转移酶，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或与序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列具有至少95％的同源性且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质，或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。本发明基因的克隆及功能鉴定对改良作物油脂成分、特别是对于改良大豆油脂成分，培育含优质油脂大豆品种具有重要理论和现实意义。
文档编号C12N9/10GK1712527SQ20041004963
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月22日 优先权日2004年6月22日
发明者陈受宜, 张劲松, 王会文 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所