专利名称：中国明对虾抗脂多糖因子基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及抗脂多糖因子，具体地说是一种中国明对虾抗脂多糖因子基因及其克隆方法。
背景技术：
抗脂多糖因子(Anti-LPS factor，ALF)是最初发现于鲎(Limulus)体内的一种具有抗菌活性和内毒素结合活性的免疫因子。鲎是甲壳动物中免疫系统研究最多的动物之一。1964年Levin和Bang发现鲎血细胞溶解物能特异性地被LPS(lipopolysaccharide)激活而发生成胶反应。以后，从鲎细胞中陆续发现和分离出许多对内毒素、细菌等有抑制或灭活作用的蛋白及多肽分子，包括外源性凝集素、凝固因子、LEBP-PI(Limulusendotoxin-binding protein-protease inhibitor)和LALF(Limulus Anti-LPSfactor)等，其中LALF是一种很重要的免疫相关因子。
Tanaka等于1982年从美洲鲎(Limulus polyphemus)体内纯化了LALF，此后测定了它的氨基酸序列并进行了一系列试验，证明它具有抗内毒素作用。LALF为单链的蛋白质分子，分子量约为11.5KD，由102个氨基酸组成，N端有20个高度疏水的氨基酸残基，该蛋白在Cys32～Cys53间形成二硫键，正电荷残基主要集中在二硫桥内。研究表明用正电荷氨基酸取代二硫桥内的中性或带负电荷的氨基酸会提高LALF对LPS的结合能力，并能增强它的抗菌活性。此蛋白的pI值在10左右。LALF对革兰氏阴性细菌，尤其是粗糙型菌具有强烈抑制作用，已证明LALF能够结合LPS的类脂A部位并在体外中和LPS的生物学活性。如以LALF与LPS事先温育则可显著地降低LPS对大鼠的致死活性，并可显著降低脑膜炎球菌LPS对家兔的毒性反应。近来的研究很多是针对LALF的LPS中和活性和抗菌活性而进行的，研究最多的是LALF35-52的环肽部分，因为此结构被认为是LPS的结合与活性中和功能域，此部位与LPS结合后可以阻止整个炎症细胞因子级联反应的原始刺激。Vallespi等研究发现，合成的环肽LALF31-52有助于保护小鼠免受内毒素的攻击，能够在体外调节细胞因子的分泌。在研究革兰氏阴性细菌引起的腹膜脓血症模型时发现，用LALF31-52预处理小鼠可消除系统TNF-α反应，减少组织损伤，提高感染小鼠的存活率(参见Vallespi M.G.，Alvarez-Obregon J.C.，Rodriguez-Alonso I.，Montero T.，Garay H.，etal.A Limulus anti-LPS factor-derived peptide modulates cytokinegene expression and promotes resohtion of bacterial acute infectionin mice.International Immunopharmacology，2003，3247-256.)。故此LALF31-52被认为具有免疫调控的功能，对急性细菌感染和脓血症的预防与治疗有重要意义，尤其可以防止或改善上述疾病情况下的免疫失调。Paus等根据天然LALF氨基酸序列合成的基因成功地在酵母中表达了一种有活性的蛋白，并称之为内毒素中和蛋白(rENP)。对rENP的研究发现，它与阳离子抗菌蛋白有很多相似之处，例如它所表现出的对革兰氏阴性及阳性细菌的毒性，以及其具有的LPS和肝素结合序列。rENP的肝素结合区位于半胱氨酸环内，与LPS的结合位点相同(参见Paus，E.J.，Willey，J.，Ridge，R.J.，Legg，C.R.，Finkelman，M.A.，Novitsky，T.J.，Ketchum，P.A.Production of recombinant endotoxin neutralizing protein inPichia pastoris and methods for its purification.Protein Expressionand Purification.2002，26202-210)。
和其他抗菌肽一样，抗脂多糖因子的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗药性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新的抗生素的发现极其困难的情况下，抗脂多糖因子为开发新的抗菌药物开辟了广阔的前景。总之，抗脂多糖因子以及其他类型抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的应用潜力，因此，它已成为当今生物医药研究的热点之一。
发明内容
本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3’-RACE)以及5’端cDNA快速扩增(5’-RACE)的方法，对中国明对虾抗脂多糖因子基因进行了研究，首次从中国明对虾中克隆到了一种抗菌活性较强的免疫因子抗脂多糖因子基因，用于抗脂多糖因子基因的重组表达和基因转移，并为对虾病防治和进一步开发为医药产品奠定基础。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下中国明对虾抗脂多糖因子基因具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其克隆方法(1)从中国明对虾的血细胞中提取总RNA；(2)然后进行cDNA第一链合成；(3)根据中国明对虾EST序列设计引物进行PCR反应，得到对虾抗脂多糖因子基因片段，正向引物F15’GCACGAGGGAGCTTCATATT 3’，反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’；(4)又用一条特异性正向引物F25’GCTGTGGAGGAACGAGAAA3’，进行cDNA3’末端快速扩增3’RACE；(5)然后用两条反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’和R25’GCGTGTTTTGGCTTCTCCT 3’，利用5’RACE进行抗脂多糖因子cDNA5’末端快速扩增；(6)最后通过拼接3’RACE和5’RACE所得结果获得全长基因片断。
另外，所述引物还可以为序列列表中SEQ ID NO.1碱基序列片断。
本发明有如下优点1.采用本发明中所述方法，能够从中国明对虾血细胞中克隆到1种抗脂多糖因子基因(称为中国明对虾抗脂多糖因子基因)，采用本发明对对虾抗脂多糖因子基因的成功克隆和测序，首次搞清了它的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因(所以可以不用以上引物和方法)，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。
2.通过网上相似性和同源性检索，提示对虾抗脂多糖因子可以抑制革兰氏阴性细菌生长，具有中和内毒素的作用。采用本发明使通过生物工程手段提高对虾抗病能力，阻止由某些病原微生物引起的对虾疾病的大规模爆发成为可能，从而能大大促进对虾养殖业。另外本抗脂多糖因子与病原微生物的作用不会引起抗药性，有很大的药用开发的前景。
3.意义深远。通过本发明可深入了解对虾免疫机制，发现新型免疫marker，为对虾抗病品系选育以及防治对虾细菌性疾病提供依据。由于海洋生物的特殊性，海洋药物的开发已初具规模，对虾抗菌活性物质的研究有望为药物的开发和利用提供新的思路。
具体实施例方式
实施例1.一种克隆的中国明对虾抗脂多糖因子基因，具有如下序列同系基因一(1)SEQ ID NO 1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度615碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)(2)SEQ ID NO.2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度123氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽序列描述SEQ ID NO.1
1TCG GCA CGA GGG AGC TTC ATA TTT TAG AAG ATG CGA GTT TCC GTG45M R V S V 546 TTG GCA AGC CTG GTG CTG GTG GTG TCC CTG GTG GCA CTC TTC GCC906 L A S L V L V V S L V A L F A 2091 CCG CAG TGC CAG GCT CAA GGG TGG GAG GCT GTG GCA GCG GCC GTC13521P Q C Q A Q G W E A V A A A V 35136 GCC GTC AAG ATT GTT GGG CTG TGG AGG AAC GAG AAA ACC GAA CTC18036A V K I V G L W R N E K T E L 50181 CTC GGC CAC GAG TGC AAG TTC ACC GTC AAG CCT TAC ATT AAG AGG22551L G H E C K F T V K P Y I K R 65226 TTC CAG TTG TAC TAC AAG GGG AGG ATG TGG TGC CCA GGC TGG ACG27066F Q L Y Y K G R M W C P G W T 80271 GCC ATC AGA GGA GAA GCC AAA ACA CGC AGT CGG TCC GGG GTG GCT31581A I R G E A K T R S R S G V A 95316 GGA AGG ACA GCC AAA GAC TTC GTC CGG AAA GCT TTC CAG CAA GGT36096G R T A K D F V R K A F Q Q G 110361 CTC ATC TCT CAA CAG CAG GCT AAC CAG TGG CTT AAC TCA TAG GCC405111 L I S Q Q Q A N Q W L N S406 CTT TGC TCT ATG AAG AAT TAC CAT TTG GAT CTC TTG TGT GAA GGC450451 ATT CAT TAT GTT AAA TTT TTG CTG TAC ACA AAA TAC TAT ATC AAA495496 AAC TTG TTA TAA TCT GTC TTA GAA GGA TTC TTA GAC TCT GCT GTC540541 ATT AAC CTA CAA TAA ATT CTT TGG AAT GTG ACG GAT ATT AGT AAA585586 CAA CTG TTG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 615序列描述SEQ ID NO.25 15 25 35 4555MRVSVLASLV LVVSLVALFA PQCQAQGWEA VAAAVAVKIV GLWRNEKTEL LGHECKFTVK65 75 85 95105 115PYIKRFQLYY KGRMWCPGWT AIRGEAKTRS RSGVAGRTAK DFVRKAFQQG LISQQQANQWLNS实施例2.中国明对虾抗脂多糖因子基因的克隆方法1.总RNA提取用注射器从中国明对虾第一腹节基部腹窦取血淋巴，并加入等体积抗凝剂(27mM sodium citrate，336mM NaCl，115mM glucose，9mM EDTA，pH7；Rodriguez et al.，1995)。血淋巴在4℃，800g离心10min，收集血细胞用于RNA的提取。总RNA的提取使用上海博星生物公司的Unizol RNA提取试剂，提取方法参照使用说明书。
2.cDNA第一链合成据上海生工生物工程技术服务有限公司cDNA合成试剂盒说明书进行。
3.对虾抗脂多糖因子cDNA片段克隆(1)根据cDNA文库大规模测序所得EST序列设计引物，用于PCR扩增，得到对虾抗脂多糖因子基因片段。
正向引物F15’GCA CGA GGG AGC TTC ATA TT3’，反向引物R15’GAG CAAAGG GCC TAT GAG TTA3’，聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件10xTaq DNA聚合酶缓冲液5μl模板 cDNA 1μlMgCl2 4μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP)4μlExTaq DNA聚合酶 0.25μl灭菌水33.75μlPCR反应程序为94℃预变性4min，然后进入下列循环94℃ 40s，57℃45s，72℃ 60s，35个循环，最后72℃延伸10min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)反应产物纯化利用德国QIAGEN公司产品(QIAquick GelExtraction Kit)，操作步骤按产品说明书进行。
(3)基因片断的克隆纯化的PCR产物与pMD 18-T载体连接，转化TOP 10菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，以F2、R2为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。
4.抗脂多糖因子cDNA 3’端快速扩增(3’-RACE)根据得到的抗脂多糖因子基因片段序列，又设计一条特异性正向引物F25’GCTGTGGAGGAACGAGAAA 3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’-RACE试剂盒说明书进行。
取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的配制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F2与3’接头引物AOLP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)16(A/C/G) 3’，进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。
5.抗脂多糖因子cDNA 5’端快速扩增(5’-RACE)(1)第一链cDNA合成以RNA为模板，R1为引物进行反转录得到第一链cDNA。反应体系为20μl无RNase水9μl，1.5μg/μl DNase处理过的总RNA 2μl，10pmol/LAp1引物1μl，5×反转录酶buffer 4μl，10pmol/μL dNTPs 2μl 40U/μlRNase inhibitor 1μl，200U/L M-MLV Reverse Transcriptase 1μl。反应条件先将无Rnase的超纯水、RNA和引物加入薄壁管，70℃ 6min使RNA变性，冰上放置5min。然后依次加入反转录buffer、dNTPs、RNase inhibitor和反转录酶，42℃温浴2h，95℃ 5min使反转录酶失活。
(2)加尾
反转录产物用ConcertTM Rapid PCR Purification System纯化，除去未结合引物及酶。纯化后的cDNA用TdT酶(Promega公司产品)和dATP加尾，连接dA多聚核苷酸，方法参考试剂盒说明书。
(3)第一轮PCR扩增模板用上述加尾cDNA，正向引物为AOLP，逆向引物为R1，其余试剂与上述PCR反应相同。反应条件为94℃4分钟，然后进入下列循环94℃ 40s，55℃ 45s，72℃ 60s，25个循环，最后72℃延伸10min；(4)嵌套式PCR以20倍稀释的第一轮PCR产物为模板，进行第二轮扩增，正向引物为AP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’，逆向引物为R25’GCGTGTTTTGGCTTCTCCT 3’。反应体系同前，反应条件采用Touchdown程序1个循环，94℃，4min；10个循环94℃ 40s，65℃，30s(每个循环温度降低0.5℃)，72℃ 60s；25个循环94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 60s；最后72℃延伸10min(5)反应产物纯化、克隆和测序同前。
6.抗脂多糖因子cDNA序列验证根据拼接得到的对虾抗脂多糖因子cDNA全序列的5’和3’端特异性序列，设计1对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。
通过网上相似性和同源性检索，提示对虾抗脂多糖因子可以抑制革兰氏阴性细菌生长，具有中和内毒素的作用。抗脂多糖因子的分子量较小，不会引起人体产生免疫反应，不会引起抗药性，有很大的药用开发的前景，或者用于对虾病的防治。
另外，所述引物(F1，F2，R1和R2)还可以采用序列列表中SEQID NO.1碱基序列片断。
多糖因子SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120>中国明对虾抗脂多糖因子基因及其克隆方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>615<212>DNA<213>中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)<220>
<221>mRNA<222>(1)..(615)<223>
<220>
<221>CDS<222>(31)..(399)<223>
<400>1tcggcacgag ggagcttcat attttagaag atg cga gtt tcc gtg ttg gca agc54Met Arg Val Ser Val Leu Ala Ser1 5ctg gtg ctg gtg gtg tcc ctg gtg gca ctc ttc gcc ccg cag tgc cag102Leu Val Leu Val Val Ser Leu Val Ala Leu Phe Ala Pro Gln Cys Gln10 15 20gct caa ggg tgg gag gct gtg gca gcg gcc gtc gcc gtc aag att gtt150
多糖因子Ala Gln Gly Trp Glu Ala Val Ala Ala Ala Val Ala Val Lys Ile Val25 30 35 40ggg ctg tgg agg aac gag aaa acc gaa ctc ctc ggc cac gag tgc aag198Gly Leu Trp Arg Asn Glu Lys Thr Glu Leu Leu Gly His Glu Cys Lys45 50 55ttc acc gtc aag cct tac att aag agg ttc cag ttg tac tac aag ggg246Phe Thr Val Lys Pro Tyr Ile Lys Arg Phe Gln Leu Tyr Tyr Lys Gly60 65 70agg atg tgg tgc cca ggc tgg acg gcc atc aga gga gaa gcc aaa aca294Arg Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr Ala Ile Arg Gly Glu Ala Lys Thr75 80 85cgc agt cgg tcc ggg gtg gct gga agg aca gcc aaa gac ttc gtc cgg342Arg Ser Arg Ser Gly Val Ala Gly Arg Thr Ala Lys Asp Phe Val Arg90 95 100aaa gct ttc cag caa ggt ctc atc tct caa cag cag gct aac cag tgg390Lys Ala Phe Gln Gln Gly Leu Ile Ser Gln Gln Gln Ala Asn Gln Trp105 110 115 120ctt aac tca taggcccttt gctctatgaa gaattaccat ttggatctct439Leu Asn Sertgtgtgaagg cattcattat gttaaatttt tgctgtacac aaaatactat atcaaaaact 499tgttataatc tgtcttagaa ggattcttag actctgctgt cattaaccta caataaattc 559tttggaatgt gacggatatt agtaaacaac tgttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 615<210>2<211>123<212>PRT<213>中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)<400>2Met Arg Val Ser Val Leu Ala Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Val1 5 10 15Ala Leu Phe Ala Pro Gln Cys Gln Ala Gln Gly Trp Glu Ala Val Ala20 25 30Ala Ala Val Ala Val Lys Ile Val Gly Leu Trp Arg Asn Glu Lys Thr35 40 45Glu Leu Leu Gly His Glu Cys Lys Phe Thr Val Lys Pro Tyr Ile Lys50 55 60Arg Phe Gln Leu Tyr Tyr Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr65 70 75 80
多糖因子Ala Ile Arg Gly Glu Ala Lys Thr Arg Ser Arg Ser Gly Val Ala Gly85 90 95Arg Thr Ala Lys Asp Phe Val Arg Lys Ala Phe Gln Gln Gly Leu Ile100 105 110Ser Gln Gln Gln Ala Asn Gln Trp Leu Asn Ser115 120
权利要求
1.一种中国明对虾抗脂多糖因子基因，其特征在于具有序列表中SEQID NO.1碱基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.一种按照权利要求1所述中国明对虾抗脂多糖因子基因的克隆方法，其特征在于(1)从中国明对虾的血细胞中提取总RNA；(2)然后进行cDNA第一链合成；(3)采用下列引物进行PCR反应，得到对虾抗脂多糖因子基因片段，正向引物F15’GCACGAGGGAGCTTCATATT 3’，反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’；(4)又用一条特异性正向引物F25’GCTGTGGAGGAACGAGAAA3’，进行cDNA 3’端快速扩增3’RACE；(5)然后用两条反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’和R25’GCGTGTTTTGGCTTCTCCT 3’，利用5’RACE进行对抗脂多糖因子cDNA 5’端克隆；(6)最后通过拼接3’RACE和5’RACE所得结果获得全长基因片断。
3.按照权利要求2所述中国明对虾抗脂多糖因子基因的克隆方法，其特征在于步骤(3)(4)(5)中所述引物还可以为序列表中SEQ ID NO.1碱基序列片断。
全文摘要
本发明涉及抗脂多糖因子，具体地说是一种中国明对虾抗脂多糖因子基因及其克隆方法；它具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；克隆方法包括1)从中国明对虾的血细胞中提取总RNA；2)进行cDNA第一链合成；3)利用3’－RACE和5’－RACE克隆得到对虾抗脂多糖因子基因。本发明首次从中国明对虾血细胞中克隆到了1种抗脂多糖因子，搞清了它的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，使通过生物工程手段阻止由某些病原微生物引起的对虾疾病的大规模爆发成为可能，为对虾，甚至人类的抗菌药物的开发提供了理论依据。
文档编号C12N15/10GK1740320SQ200410050330
公开日2006年3月1日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者相建海, 柳峰松, 李富花, 董波 申请人:中国科学院海洋研究所