专利名称：石斑鱼胰岛素样生长因子Ⅰ受体基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种基因。
背景技术：
胰岛素样生长因子(IGFs)是一类多功能的细胞增殖因子，具有广泛的生物学效应，在胚胎和个体发育过程中起着重要作用。IGFs通过细胞表面两种类型的IGF受体发挥生物学作用。IGFs受体有两种，分别称为IGF-I受体(IGF-IR或称I型IGF受体)和IGF-II受体(IGF-IIR或称II型IGF受体)。IGFs对细胞的作用绝大多数都是通过与IGF-IR结合而实现的。IGF-IR为四聚体糖蛋白，由2个位于细胞外部的α亚基和2个跨膜β亚基组成。IGF-IR的结构与胰岛素受体极其相似。α亚基的半胱氨酸富集区是其配体的特异识别位点，细胞质部分的β链含有一个酪氨酸激酶活性区。一个α亚基和一个β亚基由二硫键连接起来形成一个半受体，两个半受体由α亚基上的二硫键构成一个完整的受体。IGF-I与IGF-IR结合会引发受体上位于细胞内的β亚基上的酪氨酸和丝氨酸残基的磷酸化，进而导致一系列的生物学效应。IGFs在鱼类的生长繁殖上起着重要作用，而仅仅对IGFs的研究是不足的，应该进一步了解IGFs与其受体的相互作用，这对于认识IGF的分子作用机理具有重要意义。而现有技术中，对IGFs受体的研究主要集中在哺乳动物中，对于鱼类的IGFs受体的研究很少。
石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，有30多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。石斑鱼的苗种培育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种生长的饵料添加剂。
发明内容
本发明的目的在于针对目前石斑鱼的苗种培育问题，提供一种重组石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因，利用该基因可以生产重组石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因I受体蛋白，该受体蛋白能够有效促进石斑鱼苗种的生长，在制备鱼苗促生长剂或添加剂中有着重要的应用。
本研究对斜带石斑鱼IGFs受体的cDNA进行克隆和序列分析，以完善IGFs与其受体作用的调控理论，为IGFs系统用于鱼类养殖、促进鱼类生长与繁殖提供理论基础。
氨基酸序列分析表明石斑鱼胰岛素样生长因子I受体前蛋白原氨基酸全序列为1413aa，成熟肽为1384aa。使用Clustalx算法，将斜带石斑鱼IGF-IR前蛋白原氨基酸全序列与其它物种的IGF-R序列进行同源性比较，发现两个主要的功能区即富含亮氨酸区和酪氨酸激酶区的保守性非常高，羧基端的变异性比较大，本发明的石斑鱼IGF-IR序列属于b型。
本发明的石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因是以石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR和Gene RACER方法扩增而得到的。
本发明用于表达石斑鱼IGF-IR重组蛋白的IGF-IR成熟肽基因序列是以石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的α亚基所对应的基因片段。
本发明还构建了上述表达石斑鱼IGF-IR重组蛋白的IGF-IR成熟肽基因序列的载体；特别是含有该基因的大肠杆菌克隆载体以及表达载体。这些载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点之间，即构建成所需的含有石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的表达载体。
上述含石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的大肠杆菌表达载体优选由本发明合成的石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因与大肠杆菌表达载体pET15b构建成的重组表达载体，命名为pET15b-IGF-IR。
本发明还用上述含有石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的相应表达载体分别构建了能高效表达石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的大肠杆菌重组株。
本发明的上述能表达石斑鱼胰岛素样生长因子I受体大肠杆菌重组菌株优选由含有石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的表达载体pET15b-IGF-IR转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为pET15b-IGF-IR-BL21。
本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产石斑鱼胰岛素样生长因子I受体的方法。先将将菌种接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200转/分培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，37℃，200转/分培养，10小时后收集菌体，经分离纯化得到重组石斑鱼胰岛素样生长因子I受体产品。
本发明的有益效果石斑鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，利用本发明的石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因，可以生产重组石斑鱼IGF-I受体蛋白，用于制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂，促进了鱼苗的快速生长，具有重大的经济效益。
图1是以石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的cDNA为模板的胰岛素样生长因子I受体基因中间片段PCR扩增产物的凝胶电泳分析图；图2是重组质粒PCR和酶切鉴定凝胶电泳分析图；图3是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因5’端片段合成的第一次PCR凝胶电泳分析图；图4是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；图5是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因5’端片段重组质粒PCR鉴定；
图6是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因IGF-IR酪氨酸激酶区第一轮PCR凝胶电泳分析图；图7是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因IGF-IR酪氨酸激酶区第二轮PCR凝胶电泳分析图；图8是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因IGF-IR酪氨酸激酶区片段重组质粒PCR鉴定；图9是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因3’端片段合成的第一轮PCR凝胶电泳分析图；图10是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因3’端片段合成的第二轮PCR凝胶电泳分析图；图11是石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因IGF-IR3’端片段重组质粒PCR鉴定；图12是重组石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot鉴定图谱；图13是大肠杆菌重组表达载体pET15b-IGF-IR的构建示意图。
其中，图1中M100bp+1.5kb DNA Ladder；1双引物扩增产物；2正义引物扩增产物；3反义义引物扩增产物；4阴性对照；图2中M100bp+1.5kb DNA Ladder；1、2、3分别为不同质粒的扩增产物；图3中M100bp+1.5kb DNA Ladder；1扩增产物；2阴性对照；图4中M1kb DNA Ladder；1双引物扩增产物；2正义引物扩增产物；3反义义引物扩增产物；4阴性对照；图5中M1kb DNA Ladder；1、2、3分别为不同质粒的扩增产物；图6中M1kb DNA Ladder；1扩增产物；2阴性对照；图7中M100bp+1.5kb DNA Ladder；1扩增产物；2.阴性对照；图8中M100bp+1.5kb DNA Ladder；1、2、3分别为不同质粒的扩增产物；图9中M100bp DNA Ladder；1扩增产物；2阴性对照；图10中M100bp DNA Ladder；1扩增产物；2阴性对照；图11中M100bp DNA Ladder；1、2、3分别为不同质粒的扩增产物；图12中M分子量标准；1IPTG诱导Pet-15b-IGF-IR表达；3Pet-15b-IGF-IR蛋白的Western blot；2、4为阴性对照。
具体实施例方式
实施例1石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因中间片段的合成根据已经在GeneBank里登录的十二种物种的IGF-IR基因序列，用Dnassist软件对它们进行相似性比较，在保守区域设计合成一套用于嵌套PCR扩增的简并引物。正义引物Primer17035’T(G/T)AA(A/G)CC(C/T)TGGAC(A/C/T)CA(A/G)TA(C/T)GC3’(22bp)；
反义引物Primer29355’CACTGAA(A/G)TA(C/T)TC(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/C/G)AC3’(22bp)；反义引物Primer31005’TC(A/G)TT(A/C/G/T)AC(A/C/T)GTCTT(A/G/T)ATGGC3’(20bp)。反应条件为95℃预变性5分钟；下边为38个循环，分为两个阶段(1)95℃变性30秒，从50℃向37℃每两个循环降1℃，退火30秒，共28循环，72℃延伸1分钟；(2)95℃变性30秒，37℃退火30秒，共8循环，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。第一轮PCR结果Primer1703与Primer3100扩增出一条约1.4kb的条带，嵌套PCRPrimer1703与Primer2935扩增出一条约1.25kb的条带，大小与预期的石斑鱼IGF-IR cDNA中间片段相一致，如图1。
将1.25kb的PCR回收片段连接到pGEM-Teasy(Promega公司)载体上，转化DH5α后蓝白斑筛选重组子，随机挑选了10个重组子扩大培养，PCR鉴定后发现8个阳性克隆。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2。提取阳性质粒后进一步用EcoRI酶切鉴定质粒，选择PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的质粒进行测序。登录http//www.ncbi.nlm.nih.gov/网站，利用BLAST软件对已获得的序列和Genebank里已知的其它物种IGF-IR的序列进行同源性比较分析，结果表明所得的序列为石斑鱼的IGF-IR cDNA中间片段。
实施例2石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因5’端片段的合成操作按GeneRacer Kit Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的IGF-IR cDNA中间片段序列设计了两条特异性下游引物反义引物Primer 5R3365’CCTCTTCCTGGTCTCCCACACCTATG3’(26bp)，嵌套反义引物Primer 5R104n5’GGTGCGGATGTAGACCACTTTGC3’(23bp)。
根据GeneRacer Kit试剂盒的通用引物和这两条特异性下游引物做嵌套PCR，最后结果得到一条分子量约为2.4kb的条带。第一次PCR反应条件为95℃预变性5分钟；下边为40个循环，分为两个阶段(1)95℃变性30秒，从62℃向47℃每个循环降0.5℃，退火30秒，共32循环，72℃延伸1分钟；(2)95℃变性30秒，46℃退火30秒，共8循环，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为35个循环95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒；最后72℃延伸7分钟。二次PCR扩增产物的电泳鉴定图如图3和图4所示。
将2.4kb的PCR回收片段连接、转化后挑选了12个重组子，PCR鉴定后有6个阳性克隆，如图5，进一步用EcoRI酶切鉴定质粒，选择PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的质粒进行测序。利用BLAST软件对已获得的2.4kb序列和Genebank里已知的其它物种IGF-IR的序列进行同源性比较分析，结果表明所得的序列为石斑鱼IGF-IR cDNA的5’片段。
实施例3石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因酪氨酸激酶区片段的合成根据已得到的中间片段和已报道的其它物种的IGF-IRβ亚基的高度保守区域-酪氨酸激酶活性区的序列，设计两条特异性正义引物和一条简并反义引物，获取石斑鱼IGF-IR酪氨酸激酶活性区片段。正义引物Primer 3R7075’GCCGTTCACAGTTTACCGCATCG3’(23bp)，正义引物Primer 3R1109n5’CGTCCTCTACGCTATGATCTTCG3’(23bp)，反义引物Primer3RYR15’GGCTTGTTSTCMKCRCTGTAG3’(21bp)，第一次PCR反应条件为95℃预变性，5min，下边为30个循环，94℃变性，30sec；50℃-65℃退火，30sec；72℃延伸，1min30sec，最后72℃延伸，10min。第二次PCR以第一次PCR 52℃退火扩增的产物稀释50倍做为模板，反应条件为95℃预变性，5min，下边为30个循环，94℃变性，30sec；48℃-68℃退火，30sec；72℃延伸，1min，最后72℃延伸，10min。二次PCR扩增产物的电泳鉴定图如图6和图7所示。
将1.1kb的PCR回收片段连接、转化后挑选了9个重组子，PCR鉴定后有8个阳性克隆(图8)，进一步用EcoRI酶切鉴定质粒，选择PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的质粒进行测序。利用BLAST软件对已获得的1.06kb序列和Genebank里已知的IGF-IR的序列进行同源性比较分析，结果表明所得的序列为石斑鱼IGF-IR cDNA酪氨酸激酶活性区片段。
实施例4石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因3’端片段的合成根据获得的酪氨酸激酶活性区片段序列和几种鱼类的IGF-IR 3’非编码区序列，设计合成了两条3’特异性引物和与之配对的3’非编码区的特异性引物。正义引物Primer 3R37005’GTGTTGGCAGTACAATCCTAAG3’(22bp)，正义引物Primer3R3500n5’AGGGTTTGCTTCCTGTCCGATG3’(22bp)，反义引物Primer 3R60005’CCCACTGTGACATCAGGTTC3’(20bp)。第一次PCR反应条件为95℃预变性，5min，下边为35个循环，94℃变性，30sec；48℃-68℃退火，30sec；72℃延伸，1min，最后72℃延伸，10min。第二次PCR以第一次PCR 60℃退火扩增的产物稀释50倍做为模板，反应条件为95℃预变性，5min，下边为30个循环，94℃变性，30sec；48℃-68℃退火，30sec；72℃延伸，1min，最后72℃延伸，10min。二次PCR扩增产物的电泳鉴定图如图9和图10所示。
将560bp的PCR回收片段连接、转化后挑选了9个重组子，PCR鉴定后有9个阳性克隆，如图11，阳性率为100％，进一步用EcoRI酶切鉴定质粒，选择PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的质粒进行测序。利用BLAST软件对已获得的560bp序列和Genebank里已知的IGF-IR的序列进行同源性比较分析，结果表明所得的序列为石斑鱼IGF-IRcDNA的3’片段。
实施例5石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因全长序列的拼接将测序得到的正确IGF-IR中间片段、5’端片段、酪氨酸激酶活性区片段、3’端片段进行拼接得到石斑鱼IGF-IR cDNA全长序列，包括5’端595bp的非编码区，完整的α亚基，β亚基酪氨酸激酶保守区，3’非编码区71bp，总长度4908bp。开放阅读框4242bp，起始密码子从596bp处开始，到4837bp处的终止密码子结束。用DNAsist软件推测出相应蛋白质的氨基酸序列，长度为1413aa，包括29aa的信号肽和1384aa的成熟肽，分为N-末端区、富含半胱氨酸区、蛋白裂解位点、跨胞膜区、酪氨酸激酶区(TK)和羧基末端区等几个功能区。IGF-I受体基因全长和推测的氨基酸序列见序列表。
实施例6石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的合成根据在克隆IGF-IR 5’端序列时获得的包括完整α亚基部分的质粒序列，结合Pet-15b载体的多克隆位点，设计合成一对扩增α亚基片段的特异性引物。正义引物Primer Sen135’ACGCTCGAGCGACCCAGCATTGACATC3’(27bp)，反义引物Primer Anti17025’ATGGATCCGTGGCACCCGGCAAATG3’(25bp)，以克隆IGF-IR5’端序列时获得的包括完整α亚基部分的质粒(1∶100)为模板，扩增IGF-IR-α亚基片段。PCR反应条件为95℃预变性4分钟；下边为30个循环94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增后出现约1.6kb的亮带，与预期大小相一致，连接进pGEMT-easy载体(Promega公司)后取PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的克隆提取质粒，该质粒为pGEMT-IGF-IR。
实施例7含石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的大肠杆菌表达载体pET15b-IGF-IR的构建用BamHI和XhoI对分别Pet-15b(Novagen公司)和pGEMT-IGF-IR(实施例6所得)两种载体进行双酶切，将分别得到的5.7kb和1.6kb预期大小片段回收纯化，T4 ligase(Takara公司)连接后转化到DH5α，筛选阳性克隆提取质粒，送上海博亚生物公司测序，测序结果证明IGF-IR基因成功转进表达载体Pet-15b中，重组载体pET15b-IGF-IR成功构建，质粒构建图见图13。
实施例8能高效表达石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因的大肠杆菌重组株pET15b-IGF-IR-BL21的构建CaCl2法将pET15b-IGF-IR转化E.coli BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含pET15b-IGF-IR的重组转化子pET15b-IGF-IR-BL21。
实施例9利用大肠杆菌基因工程菌pET15b-IGF-IR-BL21生产重组石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因I受体挑取大肠杆菌基因工程菌pET15b-IGF-IR-BL21单菌落接种在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200转/分培养过夜，次日按1∶50接种量接种于适当体积的相同培养基中，37℃培养至A600为0.5～0.6，加入IPTG(终浓度为1.0mmol/l)，于37℃诱导培养10小时后收菌。合成的石斑鱼胰岛素样生长因子I受体在大肠杆菌基因工程菌pET15b-IGF-IR-BL21中已获得高效表达。
取少量细胞加2×电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳。结果见图12，显示经诱导的pET15b-IGF-IR-BL21在约61kD的位置上出现一条新的蛋白带，未诱导的pET15b-IGF-IR-BL21不出现此带，证明石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因子I受体已在pET15b-IGF-IR-BL21中诱导表达。
将重组石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因子I受体采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。使用Pet-15b本身序列His-tag的抗体作为一抗，羊抗鼠IgG-HRP做为二抗。结果见图12，显示重组蛋白具有特异的免疫活性。
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<221>sig_peptide<222>(596)..(682)<400>1cgactggagc acgaggacac tgacatggac tgaaggagta gaagatttta tccaggatat 60ttcgaaacaa acgtcgtgtc tttcacgcag gggagctgcg tattgattta atatgttact 120gaatcgcctg gacagcctct ttccatcaca tttttgaggg ggtttgaccc gtgttctgcc 180tccagagggt cctccagcag cgggacgttg aacgtttttc ctccagatat ggagtgtgaa 240gatgcggatt acagaggaat ccccgccgct agtttaaccg cattggtttc atcacacaca 300ccaatgcggc gttgtttttg tcaggaatag acccgaacta tgaattcaca ttttcacgcc 360agagggataa atcggtgatt tttttggagc acgactggac tcccattagg aaacgtgaga 420aagctacccc agctagcccg tttgtagtag ctattagctc cattagccgg ctaactgcta 480aaaggtgctg gctggagatt aaaaaagctt tttaataatt ctgagcaggt tttgtccacg 540tttcccccct caacatattt atttacagga tttgggagga tttactcatc cagga atg 598Met1agg tct cgt acg gaa agg agc cgc ttg acc ttg ttt tgg ggt ctg atg646Arg Ser Arg Thr Glu Arg Ser Arg Leu Thr Leu Phe Trp Gly Leu Met5 10 15ctg ggt ctg tcg tcc tgc ctc cgg ccc gcc acc gca gag atc tgt ggc694Leu Gly Leu Ser Ser Cys Leu Arg Pro Ala Thr Ala Glu Ile Cys Gly20 25 30ccc agc att gac atc ggg aat gac atc agt gaa ttc agg cgt cta gag742Pro Ser Ile Asp Ile Gly Asn Asp Ile Ser Glu Phe Arg Arg Leu Glu35 40 45aac tgc aca gtg gtg gag ggc tac cta cag atc ctc ctt atc ggt gac790Asn Cys Thr Val Val Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Leu Leu Ile Gly Asp50 55 60 65aaa aac aac aac aac gtc aac cag gaa gtc ctc cgc tcc ctc agt ttc838Lys Asn Asn Asn Asn Val Asn Gln Glu Val Leu Arg Ser Leu Ser Phe70 75 80cca aag ctg acc atg atc aca gac tac ccg ctg cta ttc cgg gtg tct886Pro Lys Leu Thr Met Ile Thr Asp Tyr Pro Leu Leu Phe Arg Val Ser85 90 95ggc ctg gac agt ctg agc aca ctc ttt ccc aac ctc acc gtc ata cga934Gly Leu Asp Ser Leu Ser Thr Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg
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Untitled.ST25Arg Ser Leu Arg Tyr Ile Asp Gly Glu Glu Leu Leu Asp Asp Met Tyr405 410 415gcc ttc ttg gca gtt gac aac cag cag ctc cag tat ctt tgg gac tgg1894Ala Phe Leu Ala Val Asp Asn Gln Gln Leu Gln Tyr Leu Trp Asp Trp420 425 430aag cag cac aac ctc acc atc aag gca gga aag ctg ttc ttc aga gcc1942Lys Gln His Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Leu Phe Phe Arg Ala435 440 445aac cca aaa ctg tgc atg tcc gag atc cgt aag atg tgg gag aag aca1990Asn Pro Lys Leu Cys Met Ser Glu Ile Arg Lys Met Trp Glu Lys Thr450 455 460 465ggc atc cag ggc cac ttt gat gag agt gat ttc cga aac aac ggc gac2038Gly Ile Gln Gly His Phe Asp Glu Ser Asp Phe Arg Asn Asn Gly Asp470 475 480aga gcc agc tgt gaa agt aca atc ctg aag ttt aag tcc aac agc acc2086Arg Ala Ser Cys Glu Ser Thr Ile Leu Lys Phe Lys Ser Asn Ser Thr485 490 495agc agt aca agg atc aaa ctg acc tgg cag cgc tac tgg ccc cct gac2134Ser Ser Thr Arg Ile Lys Leu Thr Trp Gln Arg Tyr Trp Pro Pro Asp500 505 510tac aga gac ctc atc agc ttt att gtc tac tac aag gag gcg cca tac2182Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Ile Val Tyr Tyr Lys Glu Ala Pro Tyr515 520 525cag aac ata aca gag ttc gag ggg cag gac ggc tgt ggc tac aac agc2230Gln Asn Ile Thr Glu Phe Glu Gly Gln Asp Gly Cys Gly Tyr Asn Ser530 535 540545tgg aat atg gtg gat gtg gag ctg agg ccg gac aaa gag aca gac ccc2278Trp Asn Met Val Asp Val Glu Leu Arg Pro Asp Lys Glu Thr Asp Pro550 555 560gga gtt ctg ctg tcc ggc ctg aag ccc tgg acg cac tac gct ata ttc2326Gly Val Leu Leu Ser Gly Leu Lys Pro Trp Thr His Tyr Ala Ile Phe565 570 575gtt aag gcc atc aca ctc atg gtg gag ggc aaa cat ttg ccg ggt gcc2374Val Lys Ala Ile Thr Leu Met Val Glu Gly Lys His Leu Pro Gly Ala580 585 590aag agc aaa gtg gtc tac atc cgc acc agc cct tcc gcg ccc tcc atg2422Lys Ser Lys Val Val Tyr Ile Arg Thr Ser Pro Ser Ala Pro Ser Met595 600 605cct cag gat gtg cga gcg tac tct aac tca tcc aca cag ttg gtg gtg2470Pro Gln Asp Val Arg Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Thr Gln Leu Val Val610 615 620 625cgt tgg tcg ccc cct gtc tca cca aat gga aac caa act tac tac ctg2518Arg Trp Ser Pro Pro Val Ser Pro Asn Gly Asn Gln Thr Tyr Tyr Leu630 635 640gtt aga tgg cag caa caa gca gaa gat cga gag ctg tat cag cac aat2566Val Arg Trp Gln Gln Gln Ala Glu Asp Arg Glu Leu Tyr Gln His Asn645 650 655tac tgc tct aaa gag ctg aag atc ccc ata agg att gcg gcc ata ggt2614Tyr Cys Ser Lys Glu Leu Lys Ile Pro Ile Arg Ile Ala Ala Ile Gly660 665 670gtg gga gac cag gaa gag gac acc aag ccc act aag cca gat ccc gac2662Val Gly Asp Gln Glu Glu Asp Thr Lys Pro Thr Lys Pro Asp Pro Asp675 680 685gga cca gac aaa ggc ccc tgt tgc ccc tgc ccc aaa tca gtc gag gtt2710Gly Pro Asp Lys Gly Pro Cys Cys Pro Cys Pro Lys Ser Val Glu Val690 695 700 705
Untitled.ST25ctg gaa gct gaa gct gct gat gcc tcc tac aga aaa gtc ttt gaa aac2758Leu Glu Ala Glu Ala Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Lys Val Phe Glu Asn710 715 720ttc ctg cac aac tcc att ttt aca cca agg cca cca gat cgt cgc cgt2806Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Thr Pro Arg Pro Pro Asp Arg Arg Arg725 730 735aga gat ctc ttt ggc ata gcc aat gcc act cac ccc cgc cgg aac cgg2854Arg Asp Leu Phe Gly Ile Ala Asn Ala Thr His Pro Arg Arg Asn Arg740 745 750ctg cac acc aac agc acc agc agc agc acc atc cct tct ctc cta gcc2902Leu His Thr Asn Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ile Pro Ser Leu Leu Ala755 760 765gct ggt aac agc agc acc tca gac gtg gag cca gct gac aga gag ttt2950Ala Gly Asn Ser Ser Thr Ser Asp Val Glu Pro Ala Asp Arg Glu Phe770 775 780 785gag ttc ata gag caa gcg gtg aca gag cga gag ctg cag atc ttt ggc2998Glu Phe Ile Glu Gln Ala Val Thr Glu Arg Glu Leu Gln Ile phe Gly790 795 800ctg cag ccg ttc aca gtt tac cgc atc gac att cat gcc tgc aat cgg3046Leu Gln Pro Phe Thr Val Tyr Arg Ile Asp Ile His Ala Cys Asn Arg805 810 815cag gtc caa cgc tgc agc gct gca gag ttt gtc ttc tcc aga acc aag3094Gln Val Gln Arg Cys Ser Ala Ala Glu Phe Val Phe Ser Arg Thr Lys820 825 830cct gca gaa aag gca gac gac ata cct ggc cca gtg acc tgg gag ggc3142Pro Ala Glu Lys Ala Asp Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Gly835 840 845cat gag gac tgg gtg ttt ctg cgc tgg cca gag cct cct cac ccc aac3190His Glu Asp Trp Val Phe Leu Arg Trp Pro Glu Pro Pro His Pro Asn850 855 860 865gga ctc atc ctc atg tat gag atc aag ttt aaa ctg gct gct gag acc3238Gly Leu Ile Leu Met Tyr Glu Ile Lys Phe Lys Leu Ala Ala Glu Thr870 875 880gag aag cac gaa tgt gtc tct ggt cag atg tat cac aca cag cgt ggt3286Glu Lys His Glu Cys Val Ser Gly Gln Met Tyr His Thr Gln Arg Gly885 890 895gtt cgg ctg tcc aac ctc agt cca gga aac tac tca gtc aga gtg aga3334Val Arg Leu Ser Asn Leu Ser Pro Gly Asn Tyr Ser Val Arg Val Arg900 905 910gcc acg tca ctg gct ggc aac ggc tcc tgg aca cac gct ctg gat ctc3382Ala Thr Ser Leu Ala Gly Asn Gly Ser Trp Thr His Ala Leu Asp Leu915 920 925tac gtg gcc gaa cga tat gaa aac gtc ctc tac gct atg atc ttc gtt3430Tyr Val Ala Glu Arg Tyr Glu Asn Val Leu Tyr Ala Met Ile Phe Val930 935 940 945ccc atc gtc atc atc ctc gtc atc tgt ctt tta gtc tca atg ctg gtg3478Pro Ile Val Ile Ile Leu Val Ile Cys Leu Leu Val Ser Met Leu Val950 955 960gtc ctc agc agg aaa aga aac agt gac cgg ctc gga aat gga gtc ctg3526Val Leu Ser Arg Lys Arg Asn Ser Asp Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu965 970 975tac gcc tca gtt aac cca gag tac ttc agc gct gca gaa atg tac gtg3574Tyr Ala Ser Val Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Glu Met Tyr Val980 985 990cct gat gag tgg gag gtg gca cgg gag aag atc acc ctg agt cgt gag3622Pro Asp Glu Trp Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Leu Ser Arg Glu995 1000 1005
Untitled.ST25ctt ggc cag ggg tcc ttt ggc atg gtg tac gag ggc ttg gca aag3667Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Leu Ala Lys10101015 1020ggt gtg gtc aaa gac gaa cca gag acg cgt gtg gcc att aag act3712Gly Val Val Lys Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr102510301035gtc aac gag tcg gcc agc atg agg gag agg ata gag ttt ctc aat3757Val Asn Glu Ser Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn104010451050gaa gcc tca gtc atg aag gag ttc aac tgt cac cat gtg gtt cgt3802Glu Ala Ser Val Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg105510601065ctc ctg gga gtg gtt tct cag gga caa cca acc ctg gtc atc atg3847Leu Leu Gly Val Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met107010751080gag ctg atg acg aga gga gac ctg aag agc tac ctg cgc tcc ctc3892Glu Leu Met Thr Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu108510901095cga cct aaa gag caa cag tgg tcg agc ctg tct ctc cct cct cta3937Arg Pro Lys Glu Gln Gln Trp Ser Ser Leu Ser Leu Pro Pro Leu110011051110aag aag atg ctt cag atg gcc ggg cag atc gct gac ggc atg gct3982Lys Lys Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Ile Ala Asp Gly Met Ala111511201125tac ctc aac gcc aac aag ttt gtc cac aga gac ctg gca gcc agg4027Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg113011351140aac tgc atg gtg gcc gag gac ttc acc gtt aag ata gga gac ttt4072Asn Cys Met Val Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe114511501155ggc atg acc aga gac atc tat gag aca gat tac tac cgc aaa ggt4117Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly116011651170ggt aag ggt ttg ctt cct gtc cga tgg atg tcg ccc gag tct ctg4162Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu117511801185aag gat gga gtc ttc acc acc acc tct gat gtc tgg tca ttt gga4207Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Thr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly119011951200gtt gta ctg tgg gaa att gcc act ctg gca gaa cag ccc tac caa4252Val Val Leu Trp Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln120512101215ggt ctg tcc aat gag cag gtg ctc cgc ttt gtc atg gag gga ggg4297Gly Leu Ser Asn Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly122012251230ctg ctg gag aaa cca cag aat tgt cct gac atg ctg ttc gag ctg4342Leu Leu Glu Lys Pro Gln Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu123512401245atg cga atg tgt tgg cag tac aat cct aag atg cgt cca tcc ttc4387Met Arg Met Cys Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe125012551260gtg gag atc atc agc agc tta aag gat gag ctg gaa cca gct ttc4432Val Glu Ile Ile Ser Ser Leu Lys Asp Glu Leu Glu Pro Ala Phe126512701275aga gag gtt agt ttc ttc tac agt gcg gac aac aag ccg cct gat4477Arg Glu Val Ser Phe Phe Tyr Ser Ala Asp Asn Lys Pro Pro Asp
Untitled.ST25128012851290gct ccg cag ctc cac ctg gac aag atg gac aac atg gat gat gtt 4522Ala Pro Gln Leu His Leu Asp Lys Met Asp Asn Met Asp Asp Val129513001305cct ctg gag ccc ccc tct tcc acg cag cca cag caa acc cca gtc 4567Pro Leu Glu Pro Pro Ser Ser Thr Gln Pro Gln Gln Thr Pro Val131013151320ccc caa cag acc cca ccc tcc ccg aac tca gag gct cca ccc gtc 4612Pro Gln Gln Thr Pro Pro Ser Pro Asn Ser Glu Ala Pro Pro Val132513301335ccc tcg tta gcc ccc agc tcc ccc tcc tct ccc tgt acg tcg acc 4657Pro Ser Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ser Ser Pro Cys Thr Ser Thr134013451350gct gcc atg gac aag cag ccc tct ggc cag cag gca gcc aat ggg 4702Ala Ala Met Asp Lys Gln Pro Ser Gly Gln Gln Ala Ala Asn Gly135513601365ctg tcg ggg gcg ggt cta gca gca ggg tca ggg gcg gtg cgg ccg 4747Leu Ser Gly Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ser Gly Ala Val Arg Pro137013751380tct ctg gac gaa ctg ccg ccg tac gca cac atg aac gga gga cgc 4792Ser Leu Asp Glu Leu Pro Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg138513901395aaa aat gaa cgc gcc atg ccc ctc cca cag tcc tct gcc tgc 4834Lys Asn Glu Arg Ala Met Pro Leu Pro Gln Ser Ser Ala Cys140014051410tgatgggaca gagacaccca ccggactgca aaccctgcca cctacatctc tacagaacct 4894gatgtcacag tggg 4908<210>2<211>1413<212>PRT<213>斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)<400>2Met Arg Ser Arg Thr Glu Arg Ser Arg Leu Thr Leu Phe Trp Gly Leu1 5 10 15Met Leu Gly Leu Ser Ser Cys Leu Arg Pro Ala Thr Ala Glu Ile Cys20 25 30Gly Pro Ser Ile Asp Ile Gly Asn Asp Ile Ser Glu Phe Arg Arg Leu35 40 45Glu Asn Cys Thr Val Val Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Leu Leu Ile Gly50 55 60Asp Lys Asn Asn Asn Asn Val Asn Gln Glu Val Leu Arg Ser Leu Ser65 70 75 80Phe Pro Lys Leu Thr Met Ile Thr Asp Tyr Pro Leu Leu Phe Arg Val85 90 95Ser Gly Leu Asp Ser Leu Ser Thr Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile100 105 110Arg Gly Arg Asn Leu Phe Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met
Untitled.ST25115 120 125Thr Ser Leu Lys Asp Ile Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Cys130 135 140Gly Ala Ile Arg Ile Glu Lys Asn Pro Glu Leu Cys Tyr Leu Asp Ser145 150 155 160Ile Asp Trp Ser Leu Ile Leu Asp Ala G1u Phe Asn Asn Tyr Ile Ala165 170 175Gly Asn Lys Gln Ser Lys Glu Cys Ser Asp Val Cys Pro Gly Ile Met180 185 190Glu Asn Asn Pro Gln Cys Arg Lys Thr Met Phe Asn Asn Asn Tyr Asn195 200 205Tyr Arg Cys Trp Asn Ser Asn His Cys Gln Lys Glu Cys Pro Glu Lys210 215 220Cys Val Arg Arg Ala Cys Thr Ala Asp Gly Glu Cys Cys His Pro Gln225 230 235 240Cys Leu Gly Ser Cys Thr Val Pro Gly Ser Asp Thr Ala Cys Ala Ala245 250 255Cys Val His Tyr Tyr His Gln Gly Arg Cys Val Ala Asp Cys Pro Pro260 265 270Gly Thr Tyr Lys Phe Glu Gly Trp Gln Cys Ile Ser Ala Glu Leu Cys275 280 285Ser Lys Val His Leu Pro Asp Phe Asn Ser Phe Ile Ile His Gly Gly290 295 300Glu Cys Met Ser Glu Cys Pro His Gly Tyr Met Gln Thr Ala Pro Asn305310 315 320Ser Met Phe Cys Thr Ala Cys Asp Gly Leu Cys Asp Lys Val Cys Glu325 330 335Glu Lys Val Ile Asp Ser Met Asp Ala Ala Gln Ser Leu Lys Gly Cys340 345 350Thr Val Ile Lys Gly Asn Leu His Ile Asn Ile Arg Arg Gly His Asn355 360 365Ile Val Ala Glu Leu Glu Ser Phe Thr Gly Leu Ile Gln Arg Val Thr370 375 380Gly Asn Val Trp Ile Arg His Ser His Thr Leu Ser Ser Leu Ala Phe385 390 395 400Leu Arg Ser Leu Arg Tyr Ile Asp Gly Glu Glu Leu Leu Asp Asp Met405 410 415
Untitled.ST25Tyr Ala Phe Leu Ala Val Asp Asn Gln Gln Leu Gln Tyr Leu Trp Asp420 425 430Trp Lys Gln His Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Leu Phe Phe Arg435 440 445Ala Asn Pro Lys Leu Cys Met Ser Glu Ile Arg Lys Met Trp Glu Lys450 455 460Thr Gly Ile Gln Gly His Phe Asp Glu Ser Asp Phe Arg Asn Asn Gly465 470 475 480Asp Arg Ala Ser Cys Glu Ser Thr Ile Leu Lys Phe Lys Ser Asn Ser485 490 495Thr Ser Ser Thr Arg Ile Lys Leu Thr Trp Gln Arg Tyr Trp Pro Pro500 505 510Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Ile Val Tyr Tyr Lys Glu Ala Pro515 520 525Tyr Gln Asn Ile Thr Glu Phe Glu Gly Gln Asp Gly Cys Gly Tyr Asn530 535 540Ser Trp Asn Met Val Asp Val Glu Leu Arg Pro Asp Lys Glu Thr Asp545 550 555 560Pro Gly Val Leu Leu Ser Gly Leu Lys Pro Trp Thr His Tyr Ala Ile565 570 575Phe Val Lys Ala Ile Thr Leu Met Val Glu Gly Lys His Leu Pro Gly580 585 590Ala Lys Ser Lys Val Val Tyr Ile Arg Thr Ser Pro Ser Ala Pro Ser595 600 605Met Pro Gln Asp Val Arg Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Thr Gln Leu Val610 615 620Val Arg Trp Ser Pro Pro Val Ser Pro Asn Gly Asn Gln Thr Tyr Tyr625 630 635 640Leu Val Arg Trp Gln Gln Gln Ala Glu Asp Arg Glu Leu Tyr Gln His645 650 655Asn Tyr Cys Ser Lys Glu Leu Lys Ile Pro Ile Arg Ile Ala Ala Ile660 665 670Gly Val Gly Asp Gln Glu Glu Asp Thr Lys Pro Thr Lys Pro Asp Pro675 680 685Asp Gly Pro Asp Lys Gly Pro Cys Cys Pro Cys Pro Lys Ser Val Glu690 695 700Val Leu Glu Ala Glu Ala Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Lys Val Phe Glu705 710 715 720
Unti tled.ST25Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Thr Pro Arg Pro Pro Asp Arg Arg725 730 735Arg Arg Asp Leu Phe Gly Ile Ala Asn Ala Thr His pro Arg Arg Asn740 745 750Arg Leu His Thr Asn Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ile Pro Ser Leu Leu755 760 765Ala Ala Gly Asn Ser Ser Thr Ser Asp Val Glu Pro Ala Asp Arg Glu770 775 780Phe Glu Phe Ile Glu Gln Ala Val Thr Glu Arg Glu Leu Gln Ile Phe785 790 795 800Gly Leu Gln Pro Phe Thr Val Tyr Arg Ile Asp Ile His Ala Cys Asn805 810 815Arg Gln Val Gln Arg Cys Ser Ala Ala Glu Phe Val Phe Ser Arg Thr820 825 830Lys Pro Ala Glu Lys Ala Asp Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu835 840 845Gly His Glu Asp Trp Val Phe Leu Arg Trp Pro Glu Pro Pro His Pro850 855 860Asn Gly Leu Ile Leu Met Tyr Glu Ile Lys Phe Lys Leu Ala Ala Glu865 870 875 880Thr Glu Lys His Glu Cys Val Ser Gly Gln Met Tyr His Thr Gln Arg885 890 895Gly Val Arg Leu Ser Asn Leu Ser Pro Gly Asn Tyr Ser Val Arg Val900 905 910Arg Ala Thr Ser Leu Ala Gly Asn Gly Ser Trp Thr His Ala Leu Asp915 920 925Leu Tyr Val Ala Glu Arg Tyr Glu Asn Val Leu Tyr Ala Met Ile Phe930 935 940Val Pro Ile Val Ile Ile Leu Val Ile Cys Leu Leu Val Ser Met Leu945 950 955 960Val Val Leu Ser Arg Lys Arg Asn Ser Asp Arg Leu Gly Asn Gly Val965 970 975Leu Tyr Ala Ser Val Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Glu Met Tyr980 985 990Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ala Arg Glu Lys ILe Thr Leu Ser Arg995 10001005Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Leu Ala101010151020
Untitled.ST25Lys Gly Val Val Lys Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys102510301035Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu104010451050Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val105510601065Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile107010751080Met Glu Leu Met Thr Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser108510901095Leu Arg Pro Lys Glu Gln Gln Trp Ser Ser Leu Ser Leu Pro Pro110011051110Leu Lys Lys Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Ile Ala Asp Gly Met111511201125Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala113011351140Arg Asn Cys Met Val Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp114511501155Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys116011651170Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser117511801185Leu Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Thr Ser Asp Val Trp Ser Phe119011951200Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr120512101215Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly122012251230Gly Leu Leu Glu Lys Pro Gln Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu123512401245Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser125012551260Phe Val Glu Ile Ile Ser Ser Leu Lys Asp Glu Leu Glu Pro Ala126512701275Phe Arg Glu Val Ser Phe Phe Tyr Ser Ala Asp Asn Lys Pro Pro128012851290Asp Ala Pro Gln Leu His Leu Asp Lys Met Asp Asn Met Asp Asp
Untitled.ST25129513001305Val Pro Leu Glu Pro Pro Ser Ser Thr Gln Pro Gln Gln Thr Pro131013151320Val Pro Gln Gln Thr Pro Pro Ser Pro Asn Ser Glu Ala Pro Pro132513301335Val Pro Ser Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ser Ser Pro Cys Thr Ser134013451350Thr Ala Ala Met Asp Lys Gln Pro Ser Gly Gln Gln Ala Ala Asn135513601365Gly Leu Ser Gly Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ser Gly Ala Val Arg137013751380Pro Ser Leu Asp Glu Leu Pro Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly138513901395Arg Lys Asn Glu Arg Ala Met Pro Leu Pro Gln Ser Ser Ala Cys140014051410
权利要求
1.一种石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.如权利要求1所述的石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因，其核苷酸序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.权利要求1的石斑鱼胰岛素样生长因子受体基因在制备鱼苗促生长剂或添加剂中的应用。
4.如权利要求3所述的石斑鱼胰岛素样生长因子受体基因在制备石斑鱼鱼苗促生长剂或添加剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因，该基因是以石斑鱼下丘脑总RNA为模板，经RT－PCR和Gene RACER方法而得到的具有石斑鱼胰岛素样生长因子I受体基因cDNA序列的基因片段。利用本发明可以获得来源稳定、成本便宜的石斑鱼胰岛素样生长因子I受体的重组蛋白，在制备鱼苗促生长剂或添加剂中有着重要的应用。
文档编号C12N15/12GK1597954SQ20041005160
公开日2005年3月23日 申请日期2004年9月24日 优先权日2004年9月24日
发明者李文笙, 邝月媚, 林浩然 申请人:中山大学