一种新的人分泌蛋白hPAP21的制作方法

专利名称：一种新的人分泌蛋白hPAP21的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因工程学、肿瘤学、细胞生物学领域。具体地，本发明涉及一种新的分泌蛋白hPAP21蛋白及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。
背景技术：
分泌蛋白是一类功能非常重要的蛋白，对多细胞生物的生长、发育、细胞分化增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导中发挥着重要作用。人体中分泌蛋白占人类蛋白质组的十分之一，它们参与了信号途径、血液凝固、免疫防御、癌症发生等多种过程，如消化酶、胞外基质与血浆中的很多主要因子，以及激素、神经肽、细胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潜在的临床应用价值，并已在实际上得到了广泛的应用，如生长激素、干扰素和白细胞介素等分泌蛋白是由信号肽(signal peptide)介导，进入内质网，然后分泌到细胞外。蛋白质分子中的信号肽研究开始于20世纪60年代，这方面的工作是在研究分泌蛋白的基础上进行的，当时的研究旨在了解，在核糖体上合成的新生肽链是通过何种途径被分泌到细胞外的。德裔美国科学家布洛贝尔(G.Blobel)，因对蛋白质分子中信号肽的开创性研究，获得了1999年度诺贝尔生理学或医学奖。
分泌蛋白区别于其他胞质蛋白的唯一共同的特征就是氨基末端信号肽序列。信号肽在各个蛋白中都不相同，但有一些较类似的性质。起始的甲硫氨酸后是一些多为亲水的带正电荷的残基，该区为n区，然后是7-15个残基的疏水区h区，该区富含亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸，最后的c区包含信号肽蛋白酶的剪切位点。在剪切位点的-1和-3多为倾向为丙氨酸或其他带短侧链的氨基酸，而在-4和-6位则为有助于剪切的脯氨酸。因此针对信号肽发展了许多遗传算法来进行信号肽的分析预测。预测信号肽和蛋白质结构域近年来得到迅猛发展，这极大地归功于机器学习方法的改善和更多的序列信息来训练这些算法。这其中比较有效的模型就是神经网络模型和隐藏的马科夫模型。
SignalP是目前最有效的预测信号肽和剪切位点的方法。该软件综合了神经网络模型和隐藏的马科夫模型，前者预测是否含信号肽蛋白，后者预测剪切位点。通过大量的序列样本进行训练(非同源的原核生物蛋白266个革兰氏阴性菌序列，141个革兰氏阳性菌序列；真核生物蛋白1011个非同源蛋白序列)，得到较高的准确性，真核生物准确性为78％，原核生物为89％。
用SignalP2.0对人蛋白数据库进行信号肽预测，结合pSORT分析，初步确定后选基因。RT-PCR获得目的基因，构建到真核表达载体中使其表达，WESTERN BLOT验证生物信息学分析结果，确定基因是否表达分泌蛋白。
通过上述生物信息学预测与实验验证结合的方法，获得了1个新分泌蛋白hPAP21。而且通过其保守的功能结构域预测，hPAP21可能是一个新的胞外蛋白酶。通过去糖基化酶、糖链抑制剂处理，及定点突变分析进一步确定hPAP21是糖蛋白，而且糖链对蛋白的分泌很重要。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种新的人分泌蛋白hPAP21；本发明的另一目的在于提供了上述新的人分泌蛋白hPAP21的制备方法；本发明的再一目的在于提供了与上述新的人分泌蛋白hPAP21特异结合的抗体。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的本发明公开了一种分离的人分泌蛋白hPAP21，所述分泌蛋白包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。优选的，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本发明还公开了一种制备上述的分离的人分泌蛋白hPAP21的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤(a)将编码具有人分泌蛋白hPAP21活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hPAP21蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸69-635位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hPAP21蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hPAP21蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hPAP21蛋白活性的多肽。
优选的，上述步骤(a)中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸69-635位的核苷酸。
本发明还公开了能与权利要求1所述的人分泌蛋白hPAP21多肽特异性结合的抗体。
本发明的hPAP21可能是一个新的胞外蛋白酶。通过去糖基化酶、糖链抑制剂处理，及定点突变分析进一步确定hPAP21是糖蛋白，而且糖链对蛋白的分泌很重要。并且分泌蛋白是一种功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞分化增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导中发挥着重要作用。该分泌蛋白具有潜在的临床应用价值。


图1是本发明实施例1的SignalP2.0(SignalP-NN)分析的信号肽结果；图2是本发明实施例1的SignalP2.0(SignalP-HMM)分析的信号肽结果；图3是本发明实施例1的hPAP21基因及蛋白基本结构；图4是本发明实施例1的hPAP21同源蛋白的氨基酸序列比较结果(黑色为保守区域，灰色为相似区域)；图5是本发明实施例1的hPAP21同源蛋白进化树分析结果图；图6是本发明实施例2的Q9BHPAP21基因的克隆琼脂糖凝胶电泳图；图7是本发明实施例2的Western blotting验证hPAP21基因的分泌特性及糖基化修饰结果图；图8是本发明实施例3的Western blotting验证N-糖基化对hPAP21蛋白分泌特性的影响结果图；图9是本发明实施例4搜索genecard网站得到的hPAP21芯片杂交的表达谱；图10是本发明实施例4搜索genecard网站得到的hPAP21电子Northern表达谱；图11是本发明实施例4的人类多组织RNA印迹膜对hPAP21基因的组织分布结果图；图12是本发明实施例5的免疫荧光显示hPAP21蛋白在细胞中的分布图像；图13是本发明实施例5的hPAP21蛋白的亚细胞定位图像；图14是本发明实施例6的菌落的PCR鉴定。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1人hPAP21蛋白生物信息学分析序列相似性比对及进化树分析，采用软件Alignment，6eneDoc，Treeview。信号肽、穿膜区域预测、亚细胞定位分析分别采用网上的共享web软件SignalP http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/，SOSUI http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html及PSORT http//psort.nibb.ac.jp/。
功能结构域和基元(motif)预测，采用了
PROSITE http//us.expasy.org/prosite/，InterPro Scan http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html，ProfileScan，http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN以及NCBI的CDART(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)，http//www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml。
修饰位点分析采用了http//au.expasy.org/tools/。
结果1.hPAP21蛋白由C2orf7基因(GenBank accession No.NM032319)编码，在基因组上定位于2p13.2上，成熟mRNA共1103碱基，翻译后蛋白由188个氨基酸组成。
核酸及氨基酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其中，氨基酸序列中，N端1-20个氨基酸为信号肽区域，65-156个氨基酸为PA结构域。
2.利用SignalP2.0软件分析该蛋白疏水性，根据结果(图1和图2)，该蛋白N端序列为信号肽的可能性为99.9％。信号肽剪切位点最可能是20位和21之间，即氨基酸CVA-AH间。软件计算结果如下SignalP-NN result＞Sequence length＝70# Measure Position Value Cutoff signal peptide？max. C 22 0.884 0.33 YESmax. Y 22 0.848 0.32 YESmax. S 11 0.986 0.82 YESmean S 1-210.891 0.47 YES# Most likely cleavage site between pos.21 and 22VAA-HGSignalP-HMM result＞SequencePredictionSignal peptideSignal peptide probability1.000Signal anchor probability0.000Max cleavage site probability0.447 between pos.20 and 21
3.从SOSUIsignal Result的结果来看，hPAP21的N端有一段长20个氨基酸的信号肽段，没有穿膜区域。用PSORT软件分析预测HPAP21的分布为66.7％位于细胞外(包括细胞壁)，22.2％位于液泡，11.1％位于线粒体中。
4对hPAP21基因成熟mRNA(907bp)BLAST人基因组序列得到基因在基因组上的分布，如图3A所示基因有5个外显子，共跨越5,222bp。hPAP21蛋白结构简单(图3B)，N端1-20aa为信号肽区域，65-156aa为PA结构域。
5.以hPAP21的蛋白序列在NCBI的nr数据库中进行序列同源性搜索，发现在小鼠中有一同源性达到97％的同源蛋白(序列号XP_132652)但是该蛋白也是功能未知的。另外还有一些同源性较低的蛋白，分别有来自非洲爪蟾，果蝇，疟蚊和线虫等，见表1。
表1hPAP21的同源蛋白

这些同源蛋白的序列比对采软件Alignment，经GeneDoc软件处理后，结果如图4。
进化树分析显示人与小鼠、爪蟾的进化关系最近，其次是线虫，最后才是果蝇和疟蚊。虽然果蝇和疟蚊的序列同源性较线虫更高。结果见图5。
6.用PROSITE http//us.expasy.org/prosite/分析hPAP21，发现了2个N糖基化位点分别在121、171位；1个0糖基化位点在186位；9个磷酸化位点分别在36、42、47、60、125、132、133、150、155位；2个N-豆蔻酰化位点分别在54、160位。
实施例21hPAP21基因的克隆和hPAP21-pcDNA3.1A-真核载体的构建1.1设计引物hPAP21-pCDNA3.1A-FCCGGATCCATGGTCCCCGGCGC(SEQ ID NO.3)(含BamHI限制性内切酶切点)hPAP21-pCDA3.1A-RCCAAGCTTCCAGAAGGTCCAGGGC(SEQ ID NO.4)(含HindIII限制性内切酶切点)
1.2PCR反应

从国家人类基因组南方研究中心构建的Q9BHPAP21克隆载体中扩增Q9BHPAP21基因全长ORF片段，扩增出的片段大小为581bp。2％琼脂糖凝胶电泳图如图6所示。
PCR条件94℃5min；94℃45s，42℃45s，72℃1min，35cycle；72℃7min.
1.3BamHI&HindIII双酶切PCR产物、质粒

37℃酶切5hr，70℃热失活15min1.4连接

16℃连接16hr。
1.5电转化以参数电压1.5kv，电容25μF，电阻200Ω进行电转化，将1μl连接产物转化至感受态细胞中，37℃，250rpm于LB培养液中振荡培养1hr，涂平板。
菌落PCR鉴定在长有菌落的LB(Amp)平板上分别挑取多个菌落作PCR鉴定，PCR反应体系与上述PCR的体系相同。
质粒提取将经PCR鉴定阳性克隆质粒hPAP21-pcDNA3.1A，采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)试剂盒抽提。所得质粒经核酸测序验证插入片段正确(由申友公司完成)。
2Western blotting验证hPAP21基因的分泌特性及糖基化修饰2.1转染真核细胞1)铺细胞预热DMEM(无血清，无抗生素)培养基和胰酶(0.1％trypsin)，37℃；COS-7细胞接种密度是1-1.5×105/35mm培养皿；37℃，5％CO2培养5-24小时，使细胞贴壁；2)转染A质粒用量1~2ug，+100ul DMEM(无血清，无抗生素)，混匀；B脂质体Lipofectamine(GibcoBRL公司)3ul-5ul，+100ul DMEM(无血清，无抗生素)，混匀；A+B，混匀，室温静置15-45min，一般30min；培养细胞去上清，用DMEM(无血清，无抗生素)洗一次，加800ul DMEM(无血清，无抗生素)，滴入转染混合液，摇匀；如细胞贴壁性不好或不耐受无血清培养液，可用完全培养基；37℃，5％CO2培养5-24小时，换液为DMEM(10％FCS)，继续培养至总转染时间为48-72小时。
2.2Western Blotting1)样品处理上清处理收集细胞培养盘中的上清，13000rpm，8min。收集离心上清，取200ul纯化。
细胞处理用PBS(pH7.4)2ml洗盘中细胞两次，加200ul裂解缓冲液，冰上20分钟裂解。然后刮下细胞，将裂解液于4℃离心12000rpm，8min，回收上清，进行纯化。
TALON树脂预处理将1体积的TALON树脂贮存液于5000rpm离心5分钟，去上清，用1×E/W缓冲液洗两次，然后加等体积的1×E/W缓冲液得到50％的树脂混合液。
样品纯化在样品中加入适量的预处理过的50％Slurry，加入800ul1×E/W缓冲液，4℃结合2小时。8000rpm离心5分钟去上清，用1×E/W缓冲液洗3-4次，去除非特异结合的蛋白。
2)蛋白电泳及转膜常规蛋白电泳分离样品；15％分离胶，60V 30min，160V 1hr20min。PVDF膜用甲醇浸湿10min，去离子水冲洗，再转移到转移缓冲液中平衡20分钟；电泳胶置转移缓冲液中平衡20分钟；厚纸垫板也置于转移缓冲液中平衡。按下列顺序放置转膜仪负极—垫板—电泳胶—PVDF膜—垫板—正极。转膜半小时，电压15伏。
3)膜的封闭3％脱脂牛奶&2％BSA/PBST 50ml，水平摇床，室温封闭4小时；也可以先室温封闭若干时间，再放入4℃冰箱，过夜；4)一抗(鼠抗人C-Myc 9E10)用封闭液稀释一抗，鼠抗人C-myc 9E10(200ng/ul)稀释倍数1000倍；将膜完全没于一抗稀释液中。水平摇床，室温2小时，也可过夜。
5)洗涤先用PBST短暂地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面积)的PBST，室温洗10分钟；3*10分钟，室温洗涤；6)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)用封闭液稀释二抗，10000倍稀释；水平摇床，室温2小时。
7)洗涤先用PBST短暂地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面积)的PBST，室温洗10分钟；3*10分钟，室温洗涤；8)检测将检测试剂(ECL plus)从4℃取出，在打开前平衡至室温；将检测试剂的A液与B液以40∶1的比例混合，检测试剂的用量为0.1ml/cm2；膜置于吸水纸上干燥，蛋白面朝上，检测试剂加在膜上，覆盖整个膜表面；室温2分钟；用镊子夹起PVDF膜，使膜的下边角搭在纸巾上，吸干多余的检测试剂；膜用保鲜膜封起，暗室曝光，时间10秒；先用10秒时间多压几张，再延长时间压一张或几张，延长时间压片的时候，洗最先压的片子。
2.3去糖基化分析2.3.1肽N-糖苷酶F(PNGase F)(New England Biolabs)酶切1)蛋白样品处理见Western Blot样品处理方法；2)在1×糖蛋白变性缓冲液中100℃煮沸10分钟，使糖蛋白变性；3)加1/10体积的10×G7缓冲液及10％NP-40；4)加入1ulPNGase F，37℃，过夜；5)电泳，Western Blot检测。
2.3.2糖苷内切酶H(Endo H)(New England Biolabs)酶切1)蛋白样品处理见Western Blot样品处理方法；2)在1×糖蛋白变性缓冲液中100℃煮沸10分钟，使糖蛋白变性；3)加入1/10体积的10×G5缓冲液；4)加入1ul Endo H，37℃，过夜；5)电泳，Western Blot检测。
以上实验结果见图7。
如图所示，CL表示为细胞裂解液；CM表示细胞培养上清。可以初步判断为分泌蛋白，但分子量较预测的大，可能是因为翻译后修饰，特别是N-糖基化。为证实这一猜测，选择C2orf7蛋白稳定表达的转染CHO细胞株A3进行分析。细胞分盘培养3天，长到80-90％满，收细胞与培养上清，蛋白纯化、电泳、去糖基化酶处理，western blot检测。结果显示蛋白的确被N-糖基化，而且糖基化程度在胞内与胞外的状态不同。胞内蛋白主要以高甘露糖链存在(c箭头所示)能被肽-N糖苷酶F与糖苷内切酶H完全切下，蛋白条带迁移变快，至d箭头位置；少量的以新合成的未被糖基化蛋白形式存在(d箭头所示)。胞外分泌型蛋白主要以复杂糖链存在(a，b箭头所示)只能被肽-N糖苷酶F切下；少量的以高甘露糖链存在(c箭头所示)，能被肽-N糖苷酶F与糖苷内切酶H完全切下。
实施例3N-糖基化对hPAP21蛋白分泌特性的影响3.1衣霉素(tunicamycin)(TM)处理1)二甲基亚砜(DMSO)溶解衣霉素成5mg/ml；2)稳定转染细胞株以5×105/35mm培养皿密度接种；2)培养24小时后，培养细胞去上清，PBS(pH7.4)洗一次，换液为加有2ug/ml的衣霉素的DMEM/10％FCS培养基；阴性对照，换液为加有相同体积的DMSO的DMEM/10％FCS培养基；3)培养24小时后，收蛋白，Western Blot检测。蛋白样品处理见Western Blot样品处理方法。
3.2突变体构建采用基于重叠PCR的定点突变方法。设计突变位点序列居中的正向与反向引物(mutant F-P，mutant R-P)，以野生型基因序列为模板，mutant F-P与野生型(wild type)R-P；wild type F-P与mutant R-P为引物，分别PCR。电泳，割胶纯化PCR产物，等量混合作为第二次PCR的模板，以wild type F-P与wild type R-P为引物，二次PCR，得到突变体PCR产物。构建到合适载体中。突变体蛋白结构示意图见图3B。
一般分泌蛋白的糖基化对蛋白的分泌很重要。这里为分析N-糖基化是否会影响蛋白分泌，首先在培养液中加入衣霉素(2μg/ml)继续培养24小时后，收蛋白，western blot检测(图8A)。衣霉素可抑制N-糖链形成，加入衣霉素，hPAP21蛋白的分泌被抑制，蛋白稳定表达降低。初步证明了N-糖基化对分泌及表达的重要性。
为更进一步分析N-糖基化对分泌的影响，把糖基化位点Asn-Xaa-Ser/Thr中的Asn突变为Gln，构建了突变体。野生型与突变体分别瞬转CHO细胞，western blot检测(图8B)。突变体-1(Asn121Gln)的蛋白条带与野生型的迁移一致，说明121位在野生型中没有被糖基化。突变体-2(Asn171Gln)与突变体-3(Asn121Gln & Asn171Gln)的蛋白条带迁移一致，而且较野生型迁移快，迁移位置与野生型蛋白被肽-N糖苷酶F处理后的一致，说明171位被糖基化，又一次证明了121位没有被糖基化。突变体都能分泌，但分泌效率有差异，灰度扫描后量化野生型及各突变体的分泌效率(图8B)，与野生型相比，突变体-2(Asn171Gln)与突变体-3(Asn121Gln & Asn171Gln)降低了约40％，说明N-糖基化对hPAP21蛋白的分泌的确很重要，至少是对蛋白的高效分泌是必要的。另一方面，突变体-2(Asn171Gln)与突变体-3(Asn121Gln & Asn171Gln)的蛋白稳定表达量也有显著的降低。
实施例4人hPAP21基因的组织表达谱4.1电子Northern表达谱4.1.1搜索genecard网站http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/，分别得到hPAP21芯片杂交的表达谱(图9)与电子Northern表达谱(图10)。
4.1.2搜索SOURCEhttp//genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch，可得到unigene的表达信息。
4.2Northern印迹4.2.1材料和试剂随机引物标记试剂盒(random primer DNA labeling kit)购自宝生物工程(大连)有限公司)；人类多组织RNA印迹膜和快速杂交液(ExpressHyb hybridization solution)均购自Clontech公司；20×SSC(PH＝7.0)NaCl 175.32g柠檬酸钠88.23g，同位素P32购自PE公司。
洗膜溶液wash solution I2×SSC；0.05％SDS；加水到1000ml20×SSC--------100ml20％SDS--------2.5ml加水到1000mlwash solution II0.1×SSC；0.1％SDS；加水到1000ml20×SSC--------5ml20％SDS--------5ml加水到1000ml采用Clontech公司的人类多组织RNA印迹膜对该基因的组织分布进行研究。该印迹膜含12种组织，脑、心、骨骼肌、结肠、胸腺、脾、肾、肝、小肠、胎盘、肺、外周血白细胞。
由Northern印迹结果(图11)，可以看出该基因转录水平的表达较为广泛，各个组织中均有一定表达，在骨骼肌、心脏和肝脏中表达最高。
实施例51hPAP21蛋白的亚细胞定位将带有外源基因的质粒转染单层培养贴壁细胞，外源基因以融合或非融合的形式在细胞中表达，用针对融合或非融合蛋白的抗体处理细胞，再用FITC标记的二抗处理，随后在荧光显微镜下观察，细胞内结合有荧光二抗的部分会在单色光的激发下，发出荧光，从而可以判断表达的蛋白在细胞中的分布。
材料选取COS-7细胞或Hela细胞，100×PLA(多聚赖氨酸)一抗Tag抗体(mouse-anti-human c-myc 9E10)或特异抗体，1∶50-1∶200稀释(PBS/5％BSA)，二抗驴抗兔CyTM2IgG，1∶50稀释(PBS/5％BSA)结果见图12，免疫荧光显示hPAP21蛋白分布在除细胞核以外的细胞质中。
2hPAP21蛋白的分泌途径分泌蛋白的一般分泌途径有两种经过内质网、高尔基细胞器然后分泌；不经过内质网、高尔基细胞器，直接分泌。为分析hPAP21蛋白的分泌途径，将pcDNA3.1-hPAP21-Myc和pEYFP-Golgi(Clontech)质粒共转到CHO细胞中，进行荧光共定位分析(图13)(方法同上，二抗使用驴抗兔CyTM5 IgG)。pEYFP-Golgi质粒有高尔基细胞器膜定位信号，使表达的融合蛋白定位在高尔基体上，通过共聚焦荧光显微镜分析判断hPAP21蛋白是否定位在高尔基体内。图A表示pEYFP-Golgi的YFP融合蛋白的细胞定位情况(绿色)，B图表示标有Cy5的二抗对目的基因的亚细胞定位的检测(红色)，C图表示A与B图的重叠。在C图中黄色表示A、B图中的蛋白共定位。如图所示hGH，P28分别做为阳性和阴性对照。P28蛋白已知定位于细胞核内，没有黄色显现，人生长激素(hGH)是通过高尔基细胞器分泌的分泌蛋白。所以hPAP21蛋白的确部分定位在高尔基体内，说明hPAP21蛋白的分泌途径是典型的或是依赖内质网、高尔基细胞器的分泌。
实施例6人hPAP21基因原核细胞表达、纯化及抗体制备与纯化在该实施例中，将全长的人hPAP21编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
1基因片段的克隆1.1材料表达载体pGEX-5x-1Pharmacia公司产品，全长4969bp，为含谷胱甘肽转硫酶(glutathione S-transferase，GST)的融合表达载体。含Ptac启动子，氨苄青霉素抗性，GST后接多克隆位点，含三个读框的终止码，GST与目的基因之间有Factor Xa识别位点。
合成引物正向引物CCGAATTCGCCCACGGCTTCCGTAT(SEQ ID NO.5)，含酶切位点EcoRI；反向引物CGGCTCGAGCTACCAGAAGGTCCAGGGC(SEQ ID NO.6)，酶切位点XhoI。以上引物均由上海申友公司合成。
菌株E.coli DH5α1.2方法直接以先前构建的pcDNA3.1A-hPAP21质粒为模板，设计合适引物扩增基因片段，设计引物时使扩增出的片段去掉编码信号肽的一段。这样通过原核细胞表达出的蛋白才与真核细胞中分泌到胞外的蛋白相同。终止密码子采用基因本身的终止密码子。
(1)PCR反应
采用相应引物根据下列组分进行PCR反应成分 体积

94℃3min；94℃变性30s，54℃退火40sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃总延伸7min。
(2)胶回收采用QIAGEN公司的Gel Extraction Kit参照操作手册割胶回收。
(3)酶切载体片段和扩增片段根据下列组分进行酶切反应成分体积

37℃酶切12hr，70℃热失活15min(4)连接酶切好的载体和扩增片段根据下列组分进行连接反应成分 体积

16℃连接12hr。
(5)转化参见分子克隆实验指南(6)菌落的PCR鉴定在长有菌落的LB(Amp)平板上分别挑取多个菌落作PCR鉴定，PCR反应体系与上述PCR的体系相同。电泳图像见图14。
(7)质粒小抽采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)参照产品操作手册抽提质粒，质粒测序，插入片段正确。
2hPAP21蛋白的原核表达和纯化2.1材料Glutathione Sepharose 4B购买自Pharmacia公司；Factor Xa购买自Pharmacia公司；E.coli BL21；上述构建好的pGEX5x-hPAP21质粒。
2.2方法(1)小量表达构建的表达菌种接种于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm过夜培养。过夜培养的饱和菌1∶50接种于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培养至OD600＝0.6。不同浓度的IPTG诱导，继续培养3-5hr。8000rpm离心10min，去上清，加500ml1×PBS，重悬菌体。取出20ul走SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)大量表达及样品处理根据小量表达的条件放大，菌体重悬。加入1M DTT至最终浓度为5mM，PMSF至最终浓度为100ug/ml。冰浴超声裂解细胞成匀浆。加20％Triton X-100至终浓度1％，冰浴30min。12000rpm离心10min，分装上清，-20℃储存。
(3)纯化将冻存细胞上清13000rpm，4℃，离心10分钟，取上清。加入适量50％GlutathioneSepharose 4B Slurry，4℃摇动混匀2hr。Glutathione Sepharose 4B的预处理方法见该试剂盒的操作手册。3000rpm离心5分钟，去上清，重悬于PBS中，重复洗涤四次，上柱。用PBS洗涤至所测OD值接近空白对照PBS。换用GST Elution buffer洗脱，测每一收集管的OD值。收集洗脱后的蛋白，装入透析带透析，期间适当换透析液1×PBS。透析后收集袋内液体，测蛋白浓度，并用蛋白电泳检测。
3hPAP21蛋白的抗体制备和纯化3.1材料Protein A Sepharose CL-4B购自Pharmacia公司3.2方法(1)所得蛋白免疫兔子，制多克隆抗体。此部分工作由上海生物工程中心动物房完成(2)收集的免疫后兔子血离心收集上清，得到抗血清，Western检测所得抗体的效果和特异性。
(3)用Protein A Sepharose CL-4B纯化所得抗血清，并用结合有GST蛋白的Glutathione Sepharose 4B出去其中的抗GST抗体。
预处理Protein A Sepharose CL-4B，见产品说明。用Wash/binding buffer(20mM磷酸钠溶液，150mM NaCl，pH＝7.4)配制50％的Slurry。样品准备，血清样品用Wash/binding buffer 1∶1稀释。将平衡好的50％Slurry倒入柱子填充，使树脂在重力作用下自然沉降。用10倍柱体积的Wash/binding buffer平衡柱子。上样，样品加至树脂顶部。流出液重复上柱三遍。用10倍柱体积的Wash/binding buffer洗，直到280nm的光吸收接近空白。用4倍柱体积的Elution Buffer(100mM Glycine-HCl，pH＝3.0)洗脱，收集流出液，每管200ul，测定280OD值。直至无蛋白洗出。再生柱子，4倍Elution Buffer继续洗脱后用Wash/binding buffer大量洗。
实施例7CHO hPAP21蛋白稳定表达细胞株构建2μg真核表达质粒用脂质体转染到CHO细胞(35mm培养皿)，培养48小时；消化至100mm培养皿，加G418至终浓度1000μg/ml(CHO)培养2-3星期直至有克隆形成；去培养皿内的培液，PBS洗两次，胰酶浸泡过的无菌滤纸片覆盖于克隆上，消化数分钟后转移至24孔培养皿，继续培养；Western blot鉴定表达目的蛋白的克隆。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>一种新的人分泌蛋白hPAP21<130>NP-1348<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1103<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(69)..(635)<220>
<221>sig_peptide<222>(69)..(128)<220>
<221>polyA_signal<222>(1033)..(1038)<220>
<221>polyA_signal<222>(1058)..(1063)<400>1gtcctgcgag cgacgcgcgg cggggcggcg agaggaaacg cggcgccggg ccgggcccgg 60ccctggag atg gtc ccc ggc gcc gcg ggc tgg tgt tgt ctc gtg ctc tgg 110Met Val Pro Gly Ala Ala Gly Trp Cys Cys Leu Val Leu Trp1 5 10ctc ccc gcg tgc gtc gcg gcc cac ggc ttc cgt atc cat gat tat ttg158Leu Pro Ala Cys Val Ala Ala His Gly Phe Arg Ile His Asp Tyr Leu15 20 25 30tac ttt caa gtg ctg agt cct ggg gac att cga tac atc ttc aca gcc206
Tyr Phe Gln Val Leu Ser Pro Gly Asp Ile Arg Tyr Ile Phe Thr Ala35 40 45aca cct gcc aag gac ttt ggt ggt atc ttt cac aca agg tat gag cag 254Thr Pro Ala Lys Asp Phe Gly Gly Ile Phe His Thr Arg Tyr Glu Gln50 55 60att cac ctt gtc ccc gct gaa cct cca gag gcc tgc ggg gaa ctc agc 302Ile His Leu Val Pro Ala Glu Pro Pro Glu Ala Cys Gly Glu Leu Ser65 70 75aac ggt ttc ttc atc cag gac cag att gct ctg gtg gag agg ggg ggc 350Asn Gly Phe Phe Ile Gln Asp Gln Ile Ala Leu Val Glu Arg Gly Gly80 85 90tgc tcc ttc ctc tcc aag act cgg gtg gtc cag gag cac ggc ggg cgg 398Cys Ser Phe Leu Ser Lys Thr Arg Val Val Gln Glu His Gly Gly Arg95 100 105 110gcg gtg atc atc tct gac aac gca gtt gac aat gac agc ttc tac gtg 446Ala Val Ile Ile Ser Asp Asn Ala Val Asp Asn Asp Ser Phe Tyr Val115 120 125gag atg atc cag gac agt acc cag cgc aca gct gac atc ccc gcc ctc 494Glu Met Ile Gln Asp Ser Thr Gln Arg Thr Ala Asp Ile Pro Ala Leu130 135 140ttc ctg ctc ggc cga gac ggc tac atg atc cgc cgc tct ctg gaa cag 542Phe Leu Leu Gly Arg Asp Gly Tyr Met Ile Arg Arg Ser Leu Glu Gln145 150 155cat ggg ctg cca tgg gcc atc att tcc atc cca gtc aat gtc acc agc 590His Gly Leu Pro Trp Ala Ile Ile Ser Ile Pro Val Asn Val Thr Ser160 165 170atc ccc acc ttt gag ctg ctg caa ccg ccc tgg acc ttc tgg tag 635Ile Pro Thr Phe Glu Leu Leu Gln Pro Pro Trp Thr Phe Trp175 180 185aagagtttgt cccacattcc agccataagt gactctgagc tgggaagggg aaacccagga 695attttgctac ttggaatttg gagatagcat ctggggacaa gtggagccag gtagaggaaa 755agggtttggg cgttgctagg ctgaaaggga agccacacca ctggccttcc cttccccagg 815gcccccaagg gtgtctcatg ctacaagaag aggcaagaga caggccccag ggcttctggc 875
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115 120 125Ile Gln Asp Ser Thr Gln Arg Thr Ala Asp Ile Pro Ala Leu Phe Leu130 135 140Leu Gly Arg Asp Gly Tyr Met Ile Arg Arg Ser Leu Glu Gln His Gly145 150 155 160Leu Pro Trp Ala Ile Ile Ser Ile Pro Val Asn Val Thr Ser Ile Pro165 170 175Thr Phe Glu Leu Leu Gln Pro Pro Trp Thr Phe Trp180 185<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ccggatccat ggtccccggc gc 22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ccaagcttcc agaaggtcca gggc24
<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5ccgaattcgc ccacggcttc cgtat25<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cggctcgagc taccagaagg tccagggc 28
权利要求
1.一种分离的人分泌蛋白hPAP21，其特征在于，所述分泌蛋白包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。
2.如权利要求1所述的一种分离的人分泌蛋白hPAP21，其特征在于，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
3.一种制备权利要求1的分离的人分泌蛋白hPAP21的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤(a)将编码具有人分泌蛋白hPAP21活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hPAP21蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸69-635位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hPAP21蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hPAP21蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hPAP21蛋白活性的多肽。
4.如权利要求3所述的一种制备人分泌蛋白hPAP21的方法，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸69-635位的核苷酸。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求1所述的人分泌蛋白hPAP21多肽特异性结合的抗体。
6.一种含有权利要求1的人分泌蛋白hPAP21的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了一种人类新的分泌蛋白hPAP21。本发明的hPAP21可能是一个新的胞外蛋白酶。通过去糖基化酶、糖链抑制剂处理，及定点突变分析进一步确定hPAP21是糖蛋白，而且糖链对蛋白的分泌很重要。分泌蛋白是一种功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞分化增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导中发挥着重要作用。该分泌蛋白具有潜在的临床应用价值。
文档编号C12N15/11GK1721534SQ20041005284
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者周宇波, 朱智东, 朱弘, 黄健, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心