培养组织的保存方法

专利名称：培养组织的保存方法
技术领域：
本发明涉及培养组织的保存方法，尤其涉及通过培养细胞而获得的培养组织的保存方法。
背景技术：
近年，可通过体外(生物体外)培养细胞而获得培养组织。这样的培养组织可用作填补患者受损部的移植用组织，也可用作研究药物、化妆品功效的试验用组织。
以前，这些培养组织作为移植用或作为试验用的使用是在预定的机构内制备的，但近年，通过外部委托等利用在机构外制备的培养组织的机会增加。在机构外制备的培养组织，必须解决在到达使用机构的距离和时间内是维持其品质的状态。因此研究了在输送时用于至少将培养组织维持在良好状态的手段。
例如，专利文献1公开了在添加了冷冻保护剂的保存液中浸渍培养组织的冷冻保存技术。专利文献2公开了将培养的上皮细胞片浸渍在DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)中在8-19℃低温保存的技术。另外，专利文献3描述了在由添加了抗菌性沸石的生理盐水构成的器官保存液中冷藏保存器官。
特表平09-505032号公报[专利文献2]特许2693640号公报[专利文献3]特开平02-129101号公报

发明内容
但是，含有二甲基亚砜(DMSO)等冷冻保护剂的保存液、含有抗菌性沸石等微粒状物的保存液、以及以含有酚红等pH判定试剂的DMEM等培养基为基础的保存液，由于是对人体的直接影响不明确的成分，从确保高安全性出发，使用时需要进行洗净操作。特别是将培养组织作为移植用组织使用时，为了确保更高的安全性，必须充分洗净。因此，上述这些保存液的组成，在使用时要进行繁琐的洗净步骤，成为手术者或操作者的负担。
另一方面，在器官移植等中，虽然已知输送器官时所使用的器官保存液，但由于从生物体取出或采得的“器官”与通过体外(in vitro)培养细胞获得的“培养组织”在细胞和细胞外基质(ECM)等的组成方面并不完全相同，其特性也必定不相同，因此将各种器官保存液直接用于保存培养组织不能说都可行。另外，由于器官保存液中也包含多种成分，在移植时要进行洗净。
鉴于上述现有技术，本发明的目的是提供培养组织的保存方法，该方法可在输送期间等规定期间保存培养组织，并且在使用培养组织时无须洗净操作。
本发明的培养组织的保存方法为对通过培养细胞而获得的培养组织的保存方法，其特征在于，将上述培养组织在培养后，于不含有非容许成分的等张盐类溶液(BSS平衡盐溶液)中且在规定温度保存。本发明的上述等张盐类溶液优选为缓冲液或输液剂。更优选上述缓冲液为磷酸缓冲液，上述输液剂为生理盐类溶液，进一步优选林格系保存液或生理盐水。
根据本发明的保存方法，经过输送期间后的培养组织可以良好状态保存，且使用前不用洗净操作即可使用。


该图显示在本发明实施例中使用PBS进行保存，经过规定保存期间后的活细胞密度相对于保存开始时的活细胞密度的比例。
该图(a)显示在本发明实施例中使用PBS、各种器官保存液及林格液进行保存，在2～8℃保存10天后活细胞密度的变化；图(b)显示在13℃保存10天后活细胞密度的变化。
该图(a)显示在本发明实施例中使用PBS、器官保存液及林格液进行保存，在4℃保存时活细胞密度的变化；图(b)显示同样在13℃保存时活细胞密度的变化。
该图显示在本发明实施例中使用PBS、生理盐水及林格液进行保存，经过保存期间时的活细胞密度变化。
该图显示在本发明实施例中使用林格液进行保存，在各保存期间活细胞密度随时间的变化。
该图显示在本发明实施例中使用多种保存液在6℃保存2天的活细胞率。
该图显示在本发明实施例中使用多种保存液在13℃、2天保存期间后的活细胞率。
具体实施例方式
本发明的培养组织的保存方法为对通过培养细胞而获得的培养组织在培养后，于不含有非容许成分的等张盐类溶液中且在规定温度保存的方法。这些溶液通常作为补充体液的输液剂，或者为分散细胞、洗净细胞、组织、脏器等分别选择使用的溶液，本发明人发现这些溶液在用于至今未被使用的所谓保存培养组织的用途中是有效的，从而完成了本发明。
本发明中所述“保存”不同于在与体内相近的环境下使细胞增殖的“培养”，所述“保存”是指维持活细胞以使经过了输送期间以及直至使用之前的一段期间的培养组织，在经过该输送和/或保存期间后维持可再进行“培养”或移植的状态，从而保存培养组织经过规定时间。另外，本发明中所述“保存”相对于可长期保存的冷冻保存而言，是指相当于较短期间的输送期间(例如，几小时至几天左右)等的保存，不包括需要冷冻保护剂的冷冻状态的输送或保存、或使用处理液反应和洗净那样的几分钟～几十分钟的极短时间的保存状态。
本发明的等张盐类溶液是指与体液大致等张的且主成分为无机盐类的溶液。所述“与体液大致等张的”是指相对于体液具有1.5～0.8的渗透压比。渗透压比优选为相对于体液为0.9～1.1，可根据作为保存对象的培养组织的种类进行适当选择。另外，体液分为细胞外液和细胞内液，这两种体液的组成特点在于，主要的阳离子成分不同，细胞外液为高钠(Na)低钾(K)，细胞内液为低钠(Na)高钾(K)。对此，本发明的等张盐类溶液优选其阳离子成分为钠离子较钾离子含量高的细胞外液(高Na、低K)组成。
另外，本发明的等张盐类溶液不含有非容许成分。所述非容许成分为动物来源的血清、蛋白质等非人源动物成分，或者即使为人来源成分但可诱导排斥反应的成分，特别是不能否定可引起过敏性休克的动物胶等成分，或者为植物、矿物来源的但当体内大量使用时可引起细胞或组织功能的大幅度降低的成分，以及其量大大超出人体应用限度的药物等，例如包含胎牛血清(FBS)、冷冻保护剂、矿物来源的微粒状物、pH判定试剂等。但是，由于作为医药品其被体内摄取的成分被确认具有安全性，因此也可含有。这些非容许成分，特别是FBS等，虽然有时作为培养组织的培养基使用，但与来自自身的成分不同，鉴于在体内长期或高浓度存在时有危险，通常为在应用于体内前进行洗净去除的成分。作为含有非容许成分的溶液，可列举例如，添加了血清成分的液体培养基、添加了血清成分的器官保存液、含有提取蛋白质(如白蛋白、球蛋白等)的培养基等，它们不相当于本发明的等张盐类溶液。但是，来源于移植对象自身的成分没有必要以安全性为理由进行排除，因此，可包含在本发明的等张盐类溶液中。
作为等张盐类溶液，可列举例如，缓冲液和输液剂等。
输液剂是指为了补充体液、补正电解质平衡、补充营养等而非经口施与的电解质输液和营养输液，一般使用电解质输液等来代替体液或补充体液。
另外，输液剂优选为以无机盐类为主体的生理盐类溶液，可添加葡萄糖等。作为本发明可使用的生理盐类溶液，可列举生理盐水、林格液、洛克液、199培养基(ア—ル液)、hank’s液、蒂罗德液，这些生理盐类溶液一直以来是可作为进行电解质输液的输液剂利用的。
另一方面，本发明可使用的缓冲液只要是在分散细胞、洗净细胞、组织、器官、调整培养基的渗透压和pH等中可利用的缓冲液即可，可列举磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等。另外，碳酸缓冲液包含仅由可化学定义的化合物构成的基础培养基。此类基础培养基一直以来由于其不能使细胞增殖，所以不用其单独进行培养和保存，虽然添加了本发明的非容许物质血清、蛋白质、生长因子等而作为增殖用培养基使用，但在本发明中以不含有这样的非容许物质的状态使用。
在本发明中，缓冲液优选磷酸缓冲液，输液剂优选生理盐类溶液，尤其优选林格系保存液或生理盐水。
本发明中林格系保存液优选以选自一般作为电解质输液而使用的林格液、乳酸林格液、醋酸林格液组成的组中的至少一种作为其基础的保存液。此处“作为基础”是指也可向这些林格液中添加各种添加成分，优选这些林格液等为80％或其以上，更优选为90％或其以上，进一步优选为95％或其以上，更优选为100％。因此，也可向这些林格系保存液中添加糖类、维生素或氨基酸。作为糖类，可列举葡萄糖、山梨糖醇、海藻糖、麦芽糖、果糖、木糖醇等。作为维生素，可列举抗坏血酸等。
这些林格系保存液可直接使用通常作为输液剂使用的液体。各种输液剂的组成为本领域技术人员公知。例如林格液由氯化钠、氯化钾、氯化钙组成，其中氯的含量为0.53-0.58w/v％，且氯化钙(CaCl2·2H2O)为0.030-0.036w/v％，pH5.0～7.5。另外，由于各种输液剂以アステマリン(注册商标ビ一ブラウン模範薬品社製)、KN補液(大塚製薬社製)、デノサリン(注册商标テルモ社製)、ソルデム(注册商标テルモ社製)、ソリタ(注册商标清水製薬社製)、アクチツト(注册商标日研化学社製)、リプラス(注册商标扶桑薬品工業社製)、キヨ—ラ—ト(注册商标杏林製薬社製)、フルクトラクト(注册商标大塚製薬社製)、ソルラクト(注册商标テルモ社製)、ニソリ(注册商标ビ一ブラウン模範薬品社製)、ラクテツク(注册商标大塚製薬社製)等商品名提供，优选根据其与目标培养组织的合适性进行选择。
作为本发明中使用的缓冲液，可直接使用各种已知的缓冲液，例如，磷酸缓冲液，可列举含有氯化钾、磷酸钾等，pH7.0～7.2的磷酸缓冲液，由sigma公司和life technology等多个公司市售。另外，生理盐水为本领域公知的液体，其氯化钠含量为0.85～0.9g/100ml水，pH为4.5～8.0，优选pH为6.0～8.0。
这些保存液中，根据需要可包含使用时不必洗净的其他成分。作为这些成分，可列举抗生素、糖类、维生素、氨基酸等。进一步地，可向这些保存液中添加细胞外基质(ECM)，特别优选添加构成培养组织的细胞产生的细胞外基质。作为这样的细胞外基质，可列举粘多糖(GAG)、胶原、透明质酸等。
各种成分的添加量可根据保存的培养组织的状态进行适当的选择。此处所述培养组织的状态可列举，细胞种类、细胞密度、细胞外基质的产生量等。至于氨基酸、维生素及糖类的添加量，重要的是控制保存液的渗透压为大致等张的。如果是本领域技术人员，则容易确定实际的添加量。
另外，选择这些保存液中的任一种时，应根据保存温度、培养组织的种类进行适当选择。例如，对培养的软骨组织更优选林格系保存液，对培养的表皮组织更优选添加了维生素和氨基酸的林格液。
另外，在本发明的保存期间中的温度，即规定温度，不是细胞增殖时的较高温，而且也不是细胞冷冻的温度。即为比培养温度低的温度，使细胞处于低活性状态。温度优选为高于等于2℃，更优选为高于等于4℃，最优选为高于等于8℃，且优选低于等于25℃，更优选低于等于18℃，最优选低于等于13℃。在此范围内，培养组织可较长时间、良好地保存。另外，可根据保存液、培养组织的种类改变适宜的保存温度。例如，在为培养软骨时，如果是磷酸缓冲保存液，温度可以为4℃～25℃，如果是林格系保存液，特别优选温度为2～18℃。
不管其是如何构成的，只要其为通过培养细胞而形成的培养组织，均为可适用于本发明的培养组织。可列举，表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、肝细胞、平滑肌细胞、神经细胞、胰腺β细胞、或者这些细胞的前身细胞、间质干细胞、胚系干细胞等。
培养细胞在培养过程中产生了与细胞增殖和对移植环境适应性相关的细胞外基质(ECM)。所述细胞外基质对培养组织的特性接近于本来的组织状态是重要的。由于本发明的保存液对培养处理时所产生的细胞外基质处于将每一细胞呈包围状况的培养组织效果好，尤其是对培养细胞外基质产量高的细胞获得的培养组织效果好，因此本发明的保存液特别优选地用于保存以下细胞如软骨细胞、成骨细胞、纤维母细胞、角膜实质细胞、肝实质细胞等间质细胞形成的培养组织。
例如软骨细胞在体内或培养条件下产生硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素等粘多糖、蛋白聚糖、II型胶原等细胞外基质。细胞外基质的有无及其量的多少可使用常规方法如高效液相色谱(HPLC)、RT-PCR法等测定。
培养细胞使用的液体培养基及细胞接种密度可根据细胞种类直接使用常用的液体培养基及接种密度。例如当为软骨细胞时，使用添加了胎牛血清(FBS)、抗生素、生长因子等的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、ハムF-12(HAM F-12)等培养基。但是，在进行本发明的保存方法之前，优选用本发明的保存液等洗净，从培养组织洗掉包含在培养基中的非容许性成分。
培养组织的形态可仅由细胞构成，如球形物(凝集块)、细胞片等，也可为在多孔物质(海绵状)和凝胶状的支架结构(脚手架结构或载体)中保存细胞构成。对上述任一情况均优选含有在培养处理时产生的细胞外基质(ECM)。
特别是对软骨细胞这样的经过单层培养可去分化的细胞，优选将细胞包埋在凝胶状的支架结构中或接种在多孔(海绵状)的支架结构中进行三维培养，细胞不会去分化，并且可保持细胞形态。此类支架结构优选为胶原、透明质酸等细胞外基质、藻酸、聚乳酸、聚乙二醇乳酸、聚轮烷等生物适合的物质，特别优选胶原。
可使用任一种作为细胞增殖的支架结构对人体安全的胶原。例如，从牛等的皮肤获得的I型胶原、来自猪、鸡的胶原。进一步地，更优选使用去除了胶原末端的端肽而产生的无端胶原。这些胶原均可获得高纯度产品。
本发明中，制备培养组织时的细胞接种密度、培养温度、使用的培养容器等培养条件可使用对作为培养对象的细胞进行培养时通常采用的培养条件。
培养后的保存为在培养液几乎完全去除后，将培养组织置于装有本发明保存液的容器中，或者向放置有培养组织的容器中加入保存液而实施。这里，进行所述培养组织的保存时，培养组织可处于与容器贴附的状态，也可漂浮在保存液中。进行保存所使用的容器可使用任一对培养组织的保存合适的容器，通常可直接使用在培养制使用的培养容器。另外，优选保存液的填充量至少为浸渍培养组织的量，也可根据预定的保存期间和培养组织的大小进行适当的确定。
另外，所制备的培养组织的状态，可根据细胞种类、细胞状态(细胞密度和细胞外基质的产量等)、后述的保存温度、预定保存期间的长短以及使用用途等适当选择，，这对于本领域技术人员是易于确定的。
保存时的保存温度调整并维持在上述的规定温度。所述保存温度的调整可使用电的或化学的、用来维持温度的任一公知方法。例如，可设定并维持规定保存温度范围的恒温器和保温器等。在这样的恒温器(保温器)中将培养组织保存于充满保存液的容器中。此处所述恒温器(保温器)不仅指能维持一致的特定温度的恒温器(保温器)，也可以是只在输送期或保存期可将温度维持在规定范围的恒温器(保温器)。
本发明中的保存优选使用兼有可输送培养组织的恒温器进行。本发明中合适的输送方案包括为使培养组织在输送后处于可进行培养或移植等的可使用状态进行输送的所有方案。特别地，优选的输送方案为使用在经过整个输送期间可稳定维持上述保存温度的恒温器。作为这样的恒温器，可列举例如，内部具有使用了恒温装置的温度调节机构的输送器。
另外，优选使用内部具有蓄温材料的隔热输送器。例如，当蓄温材料具有的内容物熔点为t℃时，如果外部气温为t℃或其以上时，为了用蓄温材料将包围的内部温度维持在t℃，可使用其内容物为固化的蓄温材料。这样一来，在直至内容物全部液化的期间中，将内部温度维持在t℃。另一方面，如果外部气温为t℃或其以下时，为了用蓄温材料将包围的内部温度维持在t℃，可使用其内容物为液化的蓄温材料。这样一来，在直至内容物全部固化的期间中，可将内部温度维持在t℃。进一步地，如果并用具有不同熔点的数种蓄温材料，可根据其分别的熔点调节温度。
根据本发明，对培养组织可保存最少2天或其以上，优选为4天，更优选为7天或其以上。因此，即使是将培养组织输送到远的地方，也可提供从出发至到达这一输送期间均处于良好状态的被保存的培养组织。而且，由于是以不含非容许性成分的等张盐类溶液作为保存液，因此不用设置洗净步骤，可显著缩短使用时洗净工序所需时间，并迅速提供目的使用。
作为更具体的本发明方案，优选将在胶原凝胶中包埋的软骨细胞进行培养，得到培养软骨后，将所述培养软骨浸渍在林格系保存液中并在温度维持在2～18℃的范围保存。将这样制备的胶原包埋型培养软骨浸渍保存在林格系保存液，特别是林格液中时，可非常高水平地维持活细胞并可获得稳定的保存效果。
实施例培养软骨的制备从日本白色家兔的膝、股、肩关节获取关节软骨，用胰蛋白酶EDTA溶液和胶原酶溶液进行酶处理，分离并回收软骨细胞。洗净获得的软骨细胞后，加入含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM，制备细胞悬液使细胞密度达到1×107个/ml。将细胞悬液与3％无端胶原植入物(高研社製)以1∶4的比例混合(包埋)，将100μl的该混合液在培养容器中设置使其成为近圆顶状。通过该步骤细胞密度得以稀释。即，当细胞悬液的浓度调制为1×107个/ml时，胶原中包埋的细胞浓度成为2×106个/cm3(2×105个/100μl支架结构)。
设置的混合液于5％CO2、37℃的条件下静置0.5至1小时使凝胶化，加入培养基开始培养。培养液使用含有10％FBS的DMEM，其被调整为含有50μg/ml抗坏血酸(L-抗坏血酸磷酸酯镁盐的n水合物C6H6O9P·3/2Mg·nH2O；日光ケミカルズ株式会社製)，在37℃、5％CO2的条件下培养三周或四周。培养后获得直径约10mm厚约2mm的培养软骨。
实施例1将通过上述步骤制备的培养软骨以磷酸缓冲液(PBS)为保存液，在不同的温度即4℃、8℃、13℃、18℃、25℃、37℃进行保存实验。PBS保存液使用ギブコ社制的产品。保存实验为，从培养容器除去培养基后，用PBS洗净培养软骨，向培养容器中注入5ml PBS使培养软骨浸渍。将此培养容器静置于恒温器内，在不同的实验温度下保存。保存开始时的活细胞密度为约1.0～2.0×107个/cm3。培养组织的实验样本对每一温度制备三份，每个保存期间对每一份观察并计数活细胞数。
图1显示的是使用PBS保存时，在各温度条件下活细胞密度随时间的变化。图1显示的是相对于保存开始时的活细胞密度经过规定保存期间后的活细胞密度的比例。在通常的培养温度37℃下，观察到第三天时活细胞密度急剧减少。相反，在4℃～25℃，即使过了第三天也显示出可将活细胞密度维持在一定程度。
特别是在8℃、13℃、18℃下，第三天后的活细胞密度也比较稳定，这表明使用PBS可进行较长时间的保存。另外，在4℃时虽然有较少的活细胞密度，但观察到可稳定保存至第10天。
实施例2接下来，将现有的器官保存液、无血清培养基、林格系保存液与PBS进行了比较。
实验中作为现有的器官保存液，使用了Via Span(NPBI InternationalBV，Netherl andNPBI国际社製，オランダ)、Celsior(Sangstat MedicalCorporation)两种。另外，作为无血清培养基，使用了Ex Cell 325(JRH社製)、Ex Cell 505(JRH社製)、PFHM II(ギブコ社製)三种。所使用的林格系保存液为林格液(大塚製薬工埸社製)。使用的PBS与实施例1相同。
比较了保存温度为2℃～8℃(温度范围)或13℃时，经过10天的保存期间后的情况(见图2)。对于培养组织的实验样本，每一批制备45个样本，每一保存液及保存温度下各提供6个样本进行实验。每一保存期间对每三个培养软骨进行观察和活细胞计数。另外，图中的白圈表示培养刚结束(保存开始时)的活细胞密度，是对实验样本中不用作保存实验的3个样本进行的计数(2℃～8℃与13℃的数据相同)。
如图2(a)和(b)所示，经过10天的保存期间后的活细胞密度为使用PBS的保存(白菱形)在2℃～8℃时维持与其它2种器官保存液同等的活细胞密度，使用林格液的保存(十字)在2℃～8℃和13℃的任一情况下均显示为较器官保存液能更好地维持活细胞。另外，使用林格液的保存可在2℃～8℃下20天的保存期间与器官保存液同等程度地维持活细胞(数据未显示)。另外，用器官保存液保存的培养软骨有软化倾向，可观察到不具有培养刚结束时的硬度以及机械特性的变化。
由以上结果可见，可有效利用PBS及林格液作为培养软骨的保存液，特别是林格液，可以说对培养软骨具有高水平的保存效果。
实施例3接下来，将PBS及林格系保存液在保存期间活细胞密度的变化与器官保存液进行了比较。
实验中使用了PBS、作为林格系保存液的林格液、作为器官保存液的在实施例2中的活细胞密度良好的Via Span。使用的这些保存液全部与实施例2相同。保存温度为4℃、13℃，保存时间为2、4、7、10天(见图3)。对于培养组织的实验样本，每一批制备75个样本，每一保存液及保存温度下各提供12个样本进行实验。每一保存期间对每三个培养软骨进行观察和活细胞计数。对实验样本中3个不用作保存液实验的样本作为培养刚结束后(保存实验前)的活细胞密度数据使用。另外，图中的曲线为，对每一保存液将计数的3个活细胞密度数据的平均值(包括培养结束时的活细胞密度的平均值)用直线连接的结果。
如图3所示，4℃(a)和13℃(b)时的任一情况下维持活细胞密度的顺序依次为林格液(白圈、虚线)、其次是PBS(白菱形、点虚线)、器官保存液(白三角、实线)。由以上结果可见，利用林格液及PBS作为培养软骨的保存液是非常有效的。
实施例4研究了与对培养软骨的保存非常有效的林格液一样可作为输液剂使用的生理盐水(0.9％NaCl溶液)作为保存液的效果。
保存温度为4℃，保存时间为4天、10天，观察了培养软骨的活细胞密度的变化(见图4)。对于培养组织的实验样本，每一批制备21个样本，对每一保存液各提供6个样本进行实验。在保存的第4天和第10天对每一保存液的三个培养软骨进行观察和活细胞计数。对3个不进行保存液实验的样本作为培养刚结束后(保存实验前)的活细胞密度数据使用。另外，图中的曲线为，对每一保存液将计数的3个活细胞密度数据的平均值(包括培养刚结束时的活细胞密度的平均值)用直线连接的结果。
如图4(a)和(b)所示，表明生理盐水(白四方形、点虚线)与林格液(白三角、虚线)及PBS(黑圈、实线)一样适用作培养软骨的保存液。另外，用林格液保存时，显示了与保存开始时即培养刚结束时(白圈)进行比较存在足够的活细胞密度。
因此显示了至今为止作为输液或洗净等而使用的林格液、生理盐水、PBS还可适用于与现有应用不同的经过预定期间保存培养软骨。由于这些保存液即使直接注入体内也无害，使用时不必进行洗净步骤，因此即使没有专门的技术，也可不费工夫地容易地使用。
实施例5上述实施例1至4例举的是来自兔的软骨细胞制备的培养软骨，下述的实施例5用来自人的软骨细胞制备的培养软骨进行说明。
用胰蛋白酶EDTA溶液和胶原酶溶液对来自人的关节软骨进行酶处理，分离并回收软骨细胞。洗净获得的软骨细胞后，加入含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM，调制细胞悬液使细胞密度达到7.19×106个/ml。将细胞悬液与3％无端胶原植入物(高研社製)以1∶4的比例混合(包埋)，将100μl的此混合液置于培养容器中。通过此步骤细胞密度得以稀释。即，当细胞悬液的浓度为7.19×106个/ml时，在胶原中包埋时的细胞浓度成为1.44×106个/cm3(1.44×105个/100μl支架结构)。
放置的混合液于5％CO2、37℃的条件下静置1小时使其凝胶化，加入培养基开始培养。培养基使用含有10％FBS的DMEM，其调制为含有50μg/ml抗坏血酸(L-抗坏血酸磷酸酯镁盐的n水合物C6H6O9P·3/2Mg·nH2O；日光ケミカルズ株式会社製)，在37℃、5％CO2的条件下培养三周或四周。培养后获得直径约8mm厚约2mm的培养软骨。
将通过上述步骤制备的由人软骨细胞获得的培养软骨以林格液(大塚製薬社製)为保存液，在不同的温度即8℃、13℃、18℃进行保存实验。保存期间在保存的第2天、第3天、第4天进行观察。保存实验为首先从培养容器除去培养基后，用林格液洗净培养软骨。接下来，从培养面剥离培养软骨，移至其它的容器后，向容器中注入90ml林格液，浸渍培养软骨。将此容器静置于恒温器内，在不同的实验温度保存。保存开始时的活细胞密度为约3.19×106个/cm3。对于培养组织的实验样本，每一批培养软骨制备10个样本。对每一温度各提供3个样本进行实验，剩下的1个作为保存实验前(保存的第0天)的活细胞密度数据使用。在各温度下每一保存期间各观察1个样本，计数活细胞数。
图5显示了其结果。观察截止至保存的第4天，没有观察到活细胞密度的显著减少，可以稳定地保存。由此可见，本发明不仅对兔培养软骨，对人培养软骨也是有效的。
实施例6接下来研究了向林格液中添加氨基酸和维生素时的保存能力。另外，由于已显示林格液单独即可对实施例1至5中所示的培养软骨有足够的保存能力，所以考虑到在添加了氨基酸和维生素时可能不能充分评估保存能力的差异。因此，以与培养软骨的细胞种类和形态均不同的培养表皮为例进行了实施例6和实施例7的研究。
采取来自供体的皮肤组织后，通过胰蛋白酶等酶处理分离表皮细胞(角质形成细胞)，制备细胞悬液。向预先铺制了非活化小鼠纤维母细胞的培养容器(底面积为25cm2)中将表皮细胞悬液以7.5×103个细胞/cm2的密度进行了接种。
表皮细胞接种后，加入含有10％FBS的DMEM作为培养基，在37℃、10％CO2的条件下培养。
达到汇片的表皮片用酶处理，以片状从培养容器剥离后，悬浮该无菌细胞片，在每一保存液中于6℃保存2天。使用的保存液为含有调整pH用的HEPES的DMEM(下文中称为DMEM[ィンビトロジエン社製])、林格液、添加了总氨基酸制剂的林格液、添加了总维生素制剂的林格液、添加了总氨基酸制剂及总维生素制剂的林格液(下文中称为试验保存液A)。保存后剥离片的活细胞率与保存前剥离片的活细胞率比较结果如图6(a)和(b)所示。另外，保存液的组成见表1。
表1

*1大塚製薬社製*2ブラスアミノ(商品名)、大塚製薬社製*3经中心静脉营养输液用的总维生素剂「オ一ツカMV注(商品名)」、大塚製薬社製如图所示，林格液+氨基酸+维生素组成的试验保存液A显示与DMEM相同程度的活细胞率。与此相对，林格液、林格液+氨基酸以及林格液+维生素这些保存液较DMEM低20～30％。
实施例7接下来制备了维生素浓度及氨基酸浓度不同的试验保存液B和C(见表2)，研究了它们与试验保存液A、其它保存液(DMEM及林格液)一起在13℃保存2天时的保存能力。结果如图7所示。
表2

*1大塚製薬社製*2ブラスアミノ(商品名)、大塚製薬社製*3经中心静脉营养输液用的总维生素剂「オ一ツカMV注(商品名)」、大塚製薬社製如图7所示，各种试验培养液A～C中的任意一种均具有与市售的培养基DMEM大体同等的细胞保存能力。
因此，使用本实施例的试验保存液A～C可使培养组织经过预定期间后仍能良好保存，而且当培养组织用于移植等用途时可不用洗净步骤而立即使用。
权利要求
1.培养组织的保存方法，是通过培养细胞而获得的培养组织的保存方法，其特征在于，将所述培养组织在培养后置于不含非容许成分的等张盐类溶液中并且在规定温度下保存。
2.权利要求1所述的培养组织的保存方法，其中所述等张盐类溶液为缓冲液或输液剂。
3.权利要求2所述的培养组织的保存方法，其中所述缓冲液为磷酸缓冲液(PBS)。
4.权利要求2所述的培养组织的保存方法，其中所述输液剂为生理盐类溶液。
5.权利要求4所述的培养组织的保存方法，其中所述生理盐类溶液为林格系保存液或生理盐水。
6.权利要求5所述的培养组织的保存方法，其特征在于，所述林格系保存液以选自林格液、乳酸林格液、醋酸林格液组成的组中的至少一种为基础。
7.权利要求5或6所述的培养组织的保存方法，其特征在于，所述林格系保存液或生理盐水中添加有糖类、维生素或氨基酸中的至少一种。
8.权利要求1至7中任意一项所述的培养组织的保存方法，其特征在于，所述细胞为软骨细胞或表皮细胞。
9.权利要求1至8中任意一项所述的培养组织的保存方法，其特征在于，所述培养组织由胶状体或多孔体的支架结构和培养细胞组成。
10.权利要求9所述的培养组织的保存方法，其特征在于，所述支架结构为胶原。
11.权利要求1至10中任意一项所述的培养组织的保存方法，其特征在于，所述规定温度为2～25℃。
12.培养组织的保存方法，是通过培养细胞而获得的培养组织的保存方法，其特征在于，将在胶原凝胶中包埋的软骨细胞经培养得到培养软骨后，在将所述培养软骨浸渍在林格系保存液中的状态，且在2～18℃的范围进行保存。
全文摘要
本发明提供培养组织的保存方法，该方法可长时间保存培养组织，并且在使用培养组织时可不用进行洗净操作。解决方法为将培养软骨细胞得到的培养软骨组织用不含冷冻保护剂、来自矿物的微粒状物以及pH判定试剂等非容许成分的等张盐类溶液如磷酸缓冲液、林格系保存液或生理盐水在2～25℃经过10天的输送期间进行保存。
文档编号C12N5/02GK1590536SQ20041005738
公开日2005年3月9日 申请日期2004年8月26日 优先权日2003年8月29日
发明者山本刚之, 菅原桂, 加藤雅一, 福岛里佳, 井家益和, 蜷川欣秀 申请人:株式会社日本组织工程