专利名称：莲藕查尔酮合酶的基因序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及莲藕幼叶cDNA中查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS)的基因序列，更具体涉及一种莲藕查尔酮合酶基因家族的7个成员外显子2的部分序列及其氨基酸序列，本发明还涉及一种用途。
背景技术：
莲藕是一种重要的水生经济作物，不仅可以食用，而且也是重要的观赏花卉和中草药，对它的研究已经引起人们的广泛重视。就莲藕遗传学研究来看，传统的研究主要是从形态方面进行的研究，近期的研究主要是运用分子生物学的方法对其进行分子方面的研究。
花色是决定花的观赏价值的一个重要因素，长期以来，人们一直通过人工育种的方法来获得各种花卉的花色突变品种。随着植物基因工程的蓬勃发展，花卉基因工程研究也随之异军突起。现在主要是用反义RNA技术、共抑制法(co-suppression)或直接导入一个(或几个)新的目的基因等几种方法，根据人类的需要特异改变花卉的色、香、形及其保鲜的基因工程研究。查尔酮合酶是植物体内花色素苷等类黄酮化合物生物合成途径中的一个关键酶，有关该酶特性及其基因表达调控在发育过程中已有一些研究，大多集中在矮牵牛、金鱼草等模式植物，对莲等具有较高观赏价值的花卉研究较少。莲用途广泛，形态美观，具有特有的清香，是重要的观赏植物，为中国十大名花之一，莲也是研究花发育、花色素苷合成及花色素苷基因表达调控的理想材料；此外，从莲叶中提取的花青素，对人体具有重要的医疗保健作用，采用基因工程的方法提高莲叶中花青素的含量，将对莲藕的综合利用乃至莲藕产业发展具有重要的意义。
在花色形成中起最主要作用的是花色素，它包括花青素、花葵素、翠雀素等，桔黄色、红色、紫色、蓝色等花色的形成都与花色素有关。花色素在花瓣中的增高或降低都会改变花的颜色。花色素是类黄酮生化合成的产物，所以花色的形成与植物中的类黄酮这一类重要的次级代谢产物有关。它的基本结构为一个三碳环连接两个芳香环。类黄酮可以在植物的不同部位合成，除了与花色形成有关外，还具有其它多种功能，如抗紫外辐射能力、抗植物病原体侵染能力以及参与豆科植物根瘤的形成等。
查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS)是类黄酮物质合成途径中的一个关键酶，它催化丙二酰辅酶A(malony CoA)的三个乙酸基与对羟基苯丙烯酰辅酶A(coumaryc CoA)的一个乙酸基的缩合，生成柚配基查尔酮(naringeninechalcone)。柚配基查尔酮经过异构后能导致黄酮、异黄酮和花色素苷的合成。这些化合物为自然界提供了色彩，并且参与了多种生理过程，包括防紫外辐射、抗病、生长素的运输、花粉的育性等。在大多数植物中，CHS只在花中特异性表达，并且受不同发育阶段的调控。在特殊情况下，如紫外线照射或植物病原体侵染时，它也能在叶、茎等组织中被诱导表达。
CHS基因是一个较大的多基因家族，其家族成员有查尔酮合酶基因，1，2-二苯乙烯合酶基因及参与雄蕊发育的基因。CHS基因的编码区比较保守，长约1.2kb，科间的氨基酸同源性一般在70％-90％。CHS的基因结构也非常保守，据报道，除金鱼草的一个CHS基因AM-CHS含有两个内含子外，其余的都只有1个内含子，而且内含子的位置固定，但长度不等。CHS基因的外显子1较短，只编码约60个氨基酸；外显子2编码约340个氨基酸，在长度和序列上比前者更保守，且易于排序，能提供较多的进化信息。王金玲等以19个科的83个CHS序列来研究CHS exon2的进化规律，并认为可只用CHS exon2进行科以下分类等级的研究。杨俊波等也以石笔木CHS exon2的部分序列代替该基因进行分子系统学研究。
在矮牵牛中，CHS组成了一个有8-10个成员的多基因家族，且位于2个不同的染色体上。在该植物正常发育过程中，只有CHS-A和CHS-J在花组织(花冠和花药)里特异表达，其中CHS-A的表达量最大，它转录的mRNA占总CHSmRNA的90％。在幼苗中，CHS-A，CHS-J，以及CHS-B，CHS-G都可以被紫外线诱导表达。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种莲藕查尔酮合酶的基因序列，该基因为解决植物花色基因工程育种和提高荷叶中黄酮类及花青素的含量提供了一条技术途径。通过基因工程改变花色的手段相对传统的育种方法不仅更方便快捷，而且适用范畴更广。转基因莲藕的培育成功将为进一步进行其它名贵花卉的改造提供了理论和实践的基础。同时，所得到的转基因莲藕也为研究花色的形成及花的发育提供了一个极好的模式系统。
本发明中所指的转化是指农杆菌导入法，土壤农杆菌是植物基因工程中对双子叶植物进行转化最常用的一种细菌，它可以侵染植物伤口并将自身基因组的一部分插入到植物染色体中。这种方法是本领域的技术人员公知的技术。土壤农杆菌可以从商业途径中得到。具体的是把克隆到的查尔酮合酶基因，正向插入到可以进行植物转化的中间载体中，如含有花椰菜叶病毒CAMV35S启动子的真核表达载体，且将这一中间载体转移给土壤农杆菌，用转化后的土壤农杆菌侵染带有伤口的莲藕叶片，通过这一过程，外源插入的查尔酮合酶基因就进入了莲藕染色体，通过选择性筛选出带有外源基因的细胞在无菌条件下培养长成愈伤组织，并进一步分化出芽和根，成为转基因植物。
本发明涉及一种莲藕的CHS的基因序列在花卉植物的花色基因工程育种中的应用。
本发明还涉及一种莲藕的CHS的基因序列在增加荷叶中黄酮类及花青素含量的基因工程育种中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
本发明提出的方法有如下步骤1.总RNA提取用一种新的CTAB-LiCl法(专利申请号200410060812.1)提取总RNA，于-65℃--70℃保存。
2.cDNA第一链的合成取3μl RNA，用MMLV-RTase于42℃反应2小时后，于-15℃--20℃保存。
3.CHS基因的扩增以合成的cDNA第一链为模板，用一对简并引物进行PCR扩增。
4.PCR产物的回收和克隆目的条带回收并转化培养后，挑选白色菌落。
5.克隆的鉴定和测序提取质粒作模板进行PCR，鉴定阳性克隆，并送公司测序。
6.序列的分析利用在线软件及数据库资源，调整一定的参数，对序列进行分析。
CHS基因在植株中的应用1.土壤农杆菌转化2.植物转化3.转基因植物的检测NTP II检测，Northern检测，基因组Southern检测。
本发明所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7，而其相对应的氨基酸序列为SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ IDNO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14。测序结果表明，其核苷酸长度为844bp-936bp，编码278-284个氨基酸，而且7个核苷酸序列及其氨基酸序列都有明显的差异。利用BLASTN和BLASTX程序，在GenBank中进行同源搜索，结果表明SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7都与GenBank中其它物种的CHS有极高的同源性，其核苷酸序列的相似性为80％-86％，而其氨基酸序列的相似性更高达85％-95％。
CHS有较多的保守位点，如它的4个活性位点Cys164、Phe215、His303和Asn336，这4个氨基酸残基在至今发现的所有CHS和类CHS的酶中均相同；还有组成底物对羟基苯丙烯酰辅酶A的结合口袋的5个氨基酸残基Ser133、Glu192、Thr194、Thr197和Ser338；除此之外，组成环化反应的回袋的7个氨基酸残基Thr132、Met137、Phe215、Ile254、Gly256、Phe265和Pro375都是保守位点。本发明中，以SEQ ID NO1为例，其长度为859bp，编码278个氨基酸，第835-837位为终止密码子UGA。结果表明，SEQ ID NO8的4个活性位点、组成底物结合口袋的5个氨基酸残基、组成环化反应的7个氨基酸残基(但Pro375除外)都是保守而没有变异的，而且SEQID NO8的前8个氨基酸残基PSLDARQD是CHS exon2的5’端保守区域，这也正是设计简并引物的依据。
本发明中的“基因”是指将编码构成的蛋白质或多肽的氨基酸的核苷酸序列。这些序列可以是DNA形式或者RNA形式，DNA形式包括CDNA，基因组DNA，或人工化学合成的DNA。DNA可以是单链的或者是双链的。
本发明中的“载体”是指将前面指出的基因转移到宿主细胞中的DNA。多种表达载体可以从商业途径获得，常用的载体包括质粒，噬菌体，病毒等。
本发明中的“植物细胞”是指植物的各种半成熟胚，或愈伤组织，或悬浮细胞，或原生质体。这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。
本发明中的“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定或瞬时地表达所导入的基因并产生具有特定的生物学性状的植物。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果通过克隆该基因家族及制备该基因的蛋白，用于研究花发育、花色素苷合成及花色素苷基因的表达调控；根据CHS exon2的进化规律，可用CHS exon2的部分序列代替该基因，进行科以下分类等级的分子系统学研究；莲叶花青素，对人体具有重要的医疗保健作用，采用基因工程的方法提高莲叶中花青素的含量，将提高莲的综合利用，发展莲藕产业。
图1为用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测以cDNA的第一链为模板，简并性引物进行PCR扩增的产物，用AlphalmagerTM2200成像系统拍照所记录的实验结果。表明在该基因在中国莲幼叶中大量转录。
图2为用Clustal w程序对SEQ ID NO8与黑核桃木、山茶花、红杜鹃的CHS氨基酸序列进行配比。用星号标记相同的氨基酸，圆点标记氨基酸的保守替换，横线表示引进缺口(gaps)以优化配比。表明SEQ ID NO8与这几个物种的氨基酸序列有较高的同源性。
图3为以SEQ ID NO1为例，分析其核苷酸序列的特征。大方框表示5’端保守区，小方框表示活性位点，下划线表示环化反应回袋，圆形表示底物结合口袋，星号表示终止密码。表明SEQ ID NO1长度为859bp，编码278个氨基酸，第835-837位为终止密码子UGA。它的4个活性位点、组成底物结合口袋的5个氨基酸残基、组成环化反应的7个氨基酸残基(但Pro375除外)都是保守而没有变异的，而且前8个氨基酸残基PSLDARQD是CHS exon2的5’端保守区域，这也正是设计简并引物的依据。
具体实施例方式1.总RNA提取剪取莲藕尚未展开的幼嫩小叶，针对莲中的次生代谢产物如多糖、酚类化合物等较多的特点，采用一种新的CTAB-LiCl法(专利申请号200410060812.1)提取总RNA，-70℃保存。
2.cDNA第一链的合成反转录体系为25μl，先将3μl RNA与3μl Oligo(dT)引物(2.5mM)于70℃变性5min，迅速放入0℃5min，再加入5×RT缓冲液，1.25μl dNTP(10mM)，1μl MMLV-RTase(200uμl-1)，然后用RNase-Free H2O加至25μl。反应条件为42℃，2小时，于-20℃保存。
3.CHS基因的扩增以合成的cDNA第一链为模板，用一对简并引物进行PCR扩增，引物序列为P15’CCK TCH YTG GAY GCN MGR CAR GAC 3’P25’GG BCC RAA NCC RAA NAR MAC ACC 3’PCR反应体系为25μl，引物各25pmol，dNTP各2.5mmol，10×PCR反应缓冲液2.5μl，Taqase 0.2μl(5uμl-1)；反应条件为94℃预变性3min；接着94℃变性40秒，57℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。
4.PCR产物的回收和克隆用DNA回收试剂盒将目的条带回收、纯化后，克隆到pGEM-T载体上，转化Escherichia coli DH-5α的感受态细胞，在选择培养基(氨卡青霉素/X-Gal/IPTG)上培养后，挑选白色菌落。
5.克隆的鉴定和测序用碱裂解法提取质粒，以质粒作模板进行PCR，鉴定阳性克隆，并将菌液送到上海博亚生物技术公司用3370 DNA自动测序仪测序。
6.序列分析根据测序结果，其核苷酸长度为844bp-936bp，编码278-284个氨基酸，而且7个核苷酸序列及其氨基酸序列都有明显的差异。利用BLASTN和BLASTX程序，在GenBank中进行同源搜索，结果表明SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7都与GenBank中其它物种的CHS有极高的同源性，其核苷酸序列的相似性为80％-86％，而其对应的氨基酸序列SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14的相似性更高达85％-95％。
CHS基因在植株中的应用1.土壤农杆菌的转化CHS基因克隆到植物中间载体pE3的Ban HI和Xho I位点之间，将含有中间载体的DH-5α与带有pRK2013的大肠杆菌(可以从商业途径中获得)以及土壤农杆菌LBA4404共培养，筛选具有利福平抗性及壮观霉素抗性的农杆菌。
2.植物转化把莲藕无菌叶片切成lcm左右的叶盘，叶盘在农杆菌中浸泡5-10h，以保证农杆菌的感染。然后在加了滤纸的MS培养基上与土壤农杆菌共培养2d，然后转到含有生长素(BA 2mg/l，IAA 0.1mg/l)的培养基上，诱导愈伤组织，抗生素筛选(卡那霉素100mg/l，羧苄青霉素500mg/l)，两周继一代，待芽分化后，换成不加激素，但抗生素相同的MS培养基。
3.转基因植物的检测a.NPT II检测取50mg叶片加入50μl抽提缓冲液，研磨后离心，取上清液20μl，加入20μl反应缓冲液，5μl ATP溶液，30℃保温30min后点样于whatmanP81离子交换滤纸上，然后用蛋白 酶K溶液37℃洗4min，65℃洗45min，80℃洗4min，，最后室温下蒸馏水冲洗，待滤纸干后，压上X光片，放射自显影过夜。
b.基因组Southern检测植物基因组DNA采用CTAB法提取，10μg基因组DNA经EcoRI酶切完全后，进行Southern杂交，为避免植物中CHS基因的干扰，并能证明目的基因是否导入植物基因组内，探针采用α-32P-dATP随机标记的CaMV35S启动子DNA片段。
c.Northern检测选择处于相似发育阶段的花蕾(2-3cm)的花瓣，用新的CTAB-LiCl法提取总的RNA，取10μg RNA进行甲酰胺变性琼脂糖凝胶电泳，探针采用α-32P-dATP随机标记的CHS基因片段。
通过以上过程可以得到转基因植株，从而能改变莲藕的花色，并增加莲叶中的黄酮类及花青素含量。
SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7及相对应氨基酸的长度及其相似率(请见表1)，表明SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7长度为844bp-936bp，编码278-284个氨基酸。
表1基因名称核苷酸长度(bp) 氨基酸长度 核苷酸相似氨基酸相(aa) 率(％)似率(％)SEQ ID NO18592878397SEQ ID NO29363128290SEQ ID NO38592878291SEQ ID NO48592878389SEQ ID NO58592858391SEQ ID NO68582868386SEQ ID NO78442828391表2为利用BLASTN和BLASTX程序，搜索GenBank中Eukaryotic[ORGN]的[nr]数据库(其它参数都为默认值)。表明SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7都与GenBank中其它物种的CHS有极高的同源性，其核苷酸序列的相似性为
80％-86％，而其相对应氨基酸序列的相似性更高达85％-95％。
表2物种 基因名称(检索号) 得分 E值氨基酸比 一致率相似性 间隙GapsSpeciesGene name(accesion ScoreE value较Identity Positivesnumbers) Amino (％) (％)acid黑核桃 Juglans JSPCHS1 529 e-149 265/277 9597 0nigra×Juglans (CAA64452.1)regia JSPCHS2 529 e-149 265/277 9597 0(CAA64366.1)山茶花 Camellia(BAA05640.1) 528 e-149 264/278 9496 0sinensis(black tea)红杜鹃 (BAB88858.1) 527 e-149 262/278 9497 0Rhododendron simsii欧 洲 葡 萄 Vitis (BAB84111.1) 524 e-148 260/277 9397 0vinifera银 木 麻 黄 CASGL-CHS1 523 e-148 260/278 9396 0Casuarina glauca (CAA10641.1)金丝桃 Hypericum (AAG30295.1) 522 e-147 257/278 9297 0androsaemum矮牵牛 Petunia×SYPJCN 298 3e-98 152/203 7483 0hybrida(CAA27718.1)SYPJCA 298 3e-98 152/203 7483 0(CAA32731.1)啤酒花 Humulus (CAC19808.1) 300 e-131 147/178 8286 0lupulus(Europeanhop)蕃茄 Lycopersicon CHS2-LYCES 297 e-130 146/178 8287 0esculentum(tomato) (CAA38981.1)白芥 Sinapis alba CHS1-SINAL 294 e-130 145/179 8186 1/179(CAA34460.1)欧洲油菜 Brassia CHSA1293 e-129 145/179 8186 1/179napus(rape)(AAC31911.1)CHSB2292 e-129 144/179 8086 1/179(AAC31914.1)旱 菜 Rorippa (AAG43348.1) 292 e-129 146/179 8186 1/179amphibia
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>莲藕查尔酮合酶的基因序列及其用途<130>莲藕查尔酮合酶的基因序列及其用途<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>859<212>DNA<213>Nelumbo nucifera<400>1ccttctttgg atgccaggca ggacatggtg gtggttgagg tgccaaaact gggcaaggag 60gctgcgacga aggccattaa ggaatgggga cagcccaagt ccaagatcac ccaccttgtc120ttctgcacca ccagtggcgt cgacatgccc ggggctgact accagctcac caagctcctc180ggccttcgcc cctccgtcaa gagactcatg atgtaccaac aaggatgctt cgccggaggc240acggtccttc gcctggccaa ggaccttgca gagaacaaca gaggcgcccg tgtccttgtc300gtctgctcag agctcactgc tgttaccttc cgtggcccaa gtgacactca cctcgacagt360cttgtaggcc aggcactctt tggggatgga gcagccgcag ttattgtggg tgtagacccg420gtgcctggtg tagaaaagcc tttgtttgag ttggtgtcgg cagcccagac aattctccca480gacagccatg gcgccattga cgggcacctg agagaggttg gacttacctt ccacctgctc540aaggatgtgc ccgggctcat ctcaaagaac attgagaaga gcctggtgga ggcattccag600cctctgggca tctccgactg gaactcactt ttctggatcg ctcaccctgg tggtccagcc660atcctagacc aagtggaaga aaagctggcc cttaagcccg agaagctgcg cgccacacga720cacatcctga gtgagtatgg aaacatgtca agtgcttgtg ttctgttcat attggatgag780atgcggaaga agtcgattgt ggatggcctc aagaccactg gagaagggct cgagtgagtg840ttctcttcgg ctttgcacc 859<210>2<211>936<212>DNA<213>Nelumbo nucifera<400>2gggccaaatc caaataacac accccattcg agcccttctc cagtggtctt gaggccgtcc 60tcaatcgact tcttccgcat ctcatccaat atgaacagaa cacaagcact tgacatgttt120ccatactcgc tcaggatgtg tcgtgtggcg cttagcttct cgggcttaag ggccagcttt180tcttccactt ggtctaggat ggctggacca ccagggtggg cgatccagaa aattgagttc240cagtcggaga tgcccagagg ctggaatgcc tccaccaggc tcttctcgat gttctttgag300atgagcccgg gcacatcctt gagcaggtgg aaggtaagtc caacctctct caggtgcccg360tcaatggcgc catggctgtc tgggagaatt gtctgggctg ccgacaccaa ctcaaacaaa420ggcttttcta caccaggcac cgggtctgca cccacaataa ctgcggctgc tccatcccca480aagagtgcct ggcctacaag actgtcgagg tgagtgtcac ttgggccgcg gaaggtaaca540gcagtgagct ctgagcagac gacaaggaca cgggcgcctc tgttgttctc tgcaaggtcc600ttggccaggc gaaggactgt gcctccggcg aagcatcctt gttggtacat catgaatctc660
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SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>莲藕查尔酮合酶的基因序列及其用途<130>莲藕查尔酮合酶的基因序列及其用途<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>8<211>278<212>PRT<213>Nelumbo nucifera<400>8Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln Asp Met Val Val Val Glu Val Pro Lys1 5 10 15Leu Gly Lys Glu Ala Ala Thr Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro20 25 30Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Val Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp35 40 45Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro50 55 60Ser Val Lys Arg Leu Met Met Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly65 70 7580Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Arg Gly Ala85 90 95Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu Leu Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly100 105 110Pro Ser Asp Thr His Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly115120 125Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val Gly Val Asp Pro Val Pro Gly Val130 135 140Glu Lys Pro Leu Phe Glu Leu Val Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro145150 155 160Asp Ser His Gly Ala Ile Asp Gly His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr165170 175Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu180 185 190Lys Ser Leu Val Glu Ala Phe Gln Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn195 200 205Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln210 215 220Val Glu Glu Lys Leu Ala Leu Lys Pro Glu Lys Leu Arg Ala Thr Arg225 230235 240His Ile Leu Ser Glu Tyr Gly Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe245 250 255
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Ile Leu Ser Glu Tyr Gly Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile245 250 255Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys Ser Ile Glu Asp Gly Leu Lys Thr Thr260 265270Gly Arg Arg Leu Glu Val Cys Ser Ser Asp Ser Ala275 280<210>11<211>286<212>PRT<213>Nelumbo nucifera<400>11Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln Asp Met Val Val Val Glu Val Pro Lys1 5 10 15Leu Gly Lys Glu Ala Ala Ser Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro20 25 30Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Val Phe Cys Thr Ile Ser Gly Val Asp35 40 45Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro50 55 60Ser Val Lys Arg Leu Met Met Tyr Gln Gln Gly Cys Leu Ala Gly Gly65 70 75 80Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Arg Gly Ala85 90 95Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu Leu Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly100 105 110Pro Ser Asp Thr His Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly115120 125Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val Gly Ala Asp Pro Val Pro Gly Val130135 140Glu Lys Pro Leu Phe Glu Leu Val Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro145 150 155 160Asp Ser His Gly Ala Ile Asp Gly His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr165 170 175Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu180 185 190Lys Ser Leu Val Glu Ala Phe Gln Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn195 200 205Ser Ile Phe Trp Ile Ala His Pro Gly Gly Pro Ala Phe Leu Asp Gln210 215 220Val Glu Glu Lys Leu Ala Leu Lys Pro Glu Lys Leu Arg Ala Thr Arg225 230 235 240His Ile Leu Ser Glu Tyr Gly Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe245 250 255
Ile Leu Asp Glu Met Arg Thr Thr Ser Ile Glu Asp Gly Leu Arg Pro260 265270Leu Glu Lys Gly Ser Asn Gly Val Phe Tyr Ser Asp Ser Asp275 280 285<210>12<211>286<212>PRT<213>Nelumbo nucifera<400>12Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln Ala Met Val Val Val Glu Val Pro Lys1 5 10 15Leu Gly Lys Glu Ala Ala Thr Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro20 25 30Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Val Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp35 40 45Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro50 55 60Ser Val Lys Arg Leu Met Met Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly65 70 75 80Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Arg Gly Ala85 90 95Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu Leu Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly100 105110Pro Ser Asp Thr His Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly115 120125Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val Gly Ala Asp Pro Val Pro Gly Val130 135 140Glu Lys Pro Leu Phe Glu Leu Val Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro145 150 155 160Asp Ser His Gly Ala Ile Asp Gly His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr165 170 175Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu180 185 190Lys Ser Leu Val Glu Ala Phe Gln Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn195 200205Ser Ile Phe Trp Ile Ala His Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln210 215 220Val Glu Glu Lys Leu Ala Leu Lys Pro Glu Lys Leu Ser Ala Thr Arg225 230235240His Ile Leu Ser Glu Tyr Gly Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe245250255Ile Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys Ser Ile Glu Asp Gly Leu Lys Thr260265 270
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<210>14<211>275<212>PRT<213>Nelumbo nucifera<400>14Gly Arg Thr Trp Trp Trp Leu Arg Cys Gln Asn Trp Ala Arg Arg Leu1 5 10 15Arg Arg Arg Pro Leu Arg Asn Gly Asp Ser Pro Ser Pro Arg Ser Pro20 25 30Thr Leu Ser Ser Ala Pro Pro Val Ala Ser Thr Cys Pro Gly Leu Thr35 40 45Thr Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ala Phe Ala Pro Pro Ser Arg Asp Ser50 55 60Trp Cys Thr Asn Lys Asp Ala Ser Pro Glu Ala Gln Ser Phe Ala Trp65 70 75 80Pro Arg Thr Leu Gln Arg Thr Thr Glu Ala Pro Val Ser Leu Ser Ser85 90 95Ala Gln Ser Ser Leu Leu Leu Pro Ser Val Val Gln Val Ile Pro Thr100 105 110Ser Thr Val Ala Arg His Ser Ser Gly Met Glu Gln Pro Gln Leu Leu115120 125Trp Val Gln Thr Arg Cys Pro Val Lys Ser Leu Cys Leu Ser Trp Cys130 135 140Arg Gln Pro Arg Gln Leu Ser Gln Thr Ala Met Ala Pro Leu Thr Gly145150 155 160Thr Glu Arg Leu Asp Leu Pro Ser Thr Cys Ser Arg Met Cys Pro Gly165 170 175Ser Ser Gln Arg Thr Leu Arg Arg Ala Trp Trp Arg His Ser Ser Leu180 185190Trp Ala Ser Pro Thr Gly Thr Gln Phe Ser Gly Ser Pro Thr Leu Val195 200 205Val Gln Pro Ser Thr Lys Trp Lys Lys Ser Trp Pro Leu Ser Pro Arg210 215 220Ser Cys Ala Pro His Asp Thr Ser Val Ser Met Glu Ile Cys Gln Val225 230 235 240Leu Val Cys Cys Ser Tyr Trp Met Arg Cys Gly Arg Ser Arg Leu Arg245 250 255Met Ala Ser Arg Pro Leu Glu Lys Gly Ser Ser Gly Val Cys Tyr Leu260 265 270Asp Leu Asp27权利要求
1.一种分离的莲藕查尔酮合酶基因序列，其具有与SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7所示核苷酸序列至少80％同源性的序列。
2.根据权利要求1所述的一种分离的莲藕查尔酮合酶氨基酸序列，其具有与SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14所示氨基酸序列至少85％同源性的序列。
3.一种分离的莲藕查尔酮合酶基因序列在花卉植物的花色基因工程育种中的应用。
4.一种分离的莲藕查尔酮合酶基因序列在增加莲中黄酮类及花青素含量的基因工程育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种莲藕查尔酮合酶的基因序列及用途，莲藕幼叶cDNA中CHS基因家族的7个成员外显子2的部分序列，长度在844bp－936bp，编码278－284个氨基酸，而且7个核苷酸序列及其氨基酸序列都有明显的差异。与GenBank中其它物种的CHS进行比较，其核苷酸序列相似性至少80％，氨基酸序列相似至少85％。该基因家族的七个成员在花发育、花色素苷合成及花色素苷基因的表达调控，分子系统学研究，以及提高莲叶中对人体具有重要的医疗保健作用的花青素含量的中的应用。
文档编号C12N9/00GK1603412SQ20041006100
公开日2005年4月6日 申请日期2004年10月27日 优先权日2004年10月27日
发明者王曼玲, 朱虹玲, 陈朝明, 胡中立, 周明全, 宋运淳 申请人:武汉大学