专利名称：5＇－核苷酸酶活性测定方法及5＇－核苷酸酶诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定5′-核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及用于实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5′-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5′-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。
5′-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
提出一种可以克服以上现有技术缺点的5′-核苷酸酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行5′-核苷酸酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定5′-核苷酸酶活性的步骤如下1)、将样品与主要由肌苷单磷酸、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应肌苷单磷酸+水5核苷酸酶肌苷+磷酸根肌苷+磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸+过氧化氢尿酸+水+氧脲酶尿囊素+过氧化氢2过氧化氢+2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明以肌苷单磷酸为底物，应用5′-核苷酸酶偶联核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、脲酶、过氧化物酶等酶偶联反应以及还原型色原体(Chromogen)组合系统，将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。这个酶偶联反应系统的优点有(1)它利用将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原或者吲嗒胺色原染料来反映5′-核苷酸酶活性，有精确度好的优点。(2)这个酶偶联反应系统组成的反应成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试结果精确。
用以实现本发明方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液40--200mmol/l肌苷单磷酸1--50mmol/l单价磷酸盐0.2--10mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黄嘌呤氧化酶 500--50000U/l过氧化物酶500--50000U/l脲酶 500--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)还原型色原体组合 0.1--20mmol/l以上还原型色原体组合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone简称MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)与0.1--20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)
-m-anisidine简称ESPAS)N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid简称TBHB)3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid简称DHBS)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium简称TOOS)仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)双甲基苯胺(Dimethylaniline简称DMA)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine简称EHSPT)2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)简称ABTS4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)简称HMB)3-甲基-乙基-羟基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline简称MEHA)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源肌苷、次黄嘌呤、尿酸的污染试剂I缓冲液 40--200mmol/l单价磷酸盐 0.2--10mmol/l
核苷磷酸酶500--50000U/l黄嘌呤氧化酶 500--50000U/l过氧化物酶500--50000U/l脲酶 500--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)还原型色原体组合(一) 0.1--20mmol/l还原型色原体组合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
试剂II缓冲液40--200mmol/l肌苷单磷酸1--50mmol/l稳定剂10--50mmol/l还原型色原体组合(二) 0.1--20mmol/l还原型色原体组合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四种成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
双剂的配方不仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)及(二)可以互换位置。如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源肌苷、次黄嘌呤、尿酸的污染，还更有利于试剂的稳定试剂I
缓冲液 40--200mmol/l单价磷酸盐 0.2--10mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(一)0.1--20mmol/l还原型色原体组合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
试剂II缓冲液 40--200mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黄嘌呤氧化酶500--50000U/l过氧化物酶 500--50000U/l脲酶500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l肌苷单磷酸 1--50mmol/l稳定剂 10--50mmol/l还原型色原体组合(二)0.1--20mmol/l还原型色原体组合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四种成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
三剂的配方不仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)及(二)可以分开放在试剂I或III的任何位置。其中的试剂I的成分，单价磷酸盐可以放在试剂II中，试剂II的成分，核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、等也可以放在试剂I中，如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明5′-核苷酸酶诊断试剂盒较为理想缓冲液 80--120mmol/l肌苷单磷酸 1--5mmol/l单价磷酸盐 2--8mmol/l核苷磷酸酶 5000--12000U/l黄嘌呤氧化酶 5000--12000U/l过氧化物酶 5000--12000U/l脲酶 5000--12000U/l
稳定剂10--50％(总体积)10--50mmol/l还原型色原体组合 0.1--10mmol/l由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源肌苷、次黄嘌呤、尿酸的污染，消除内、外源肌苷、次黄嘌呤、尿酸的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源肌苷、次黄嘌呤、尿酸已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试5′-核苷酸酶活性所需要的肌苷、次黄嘌呤、尿酸都是产生于5′-核苷酸酶的活性。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l肌苷单磷酸 1mmol/l单价磷酸盐 2mmol/l核苷磷酸酶 5000U/l黄嘌呤氧化酶 5000U/l过氧化物酶 5000U/l脲酶 5000U/l稳定剂 50％(总体积)
4-氨基抗砒 2mmol/l石碳酸 10mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长495～505nm，测试副波长600nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应肌苷单磷酸+水5核苷酸酶肌苷+磷酸根肌苷+磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸+过氧化氢尿酸+水+氧脲酶尿囊素+过氧化氢2过氧化氢+2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长495～505nm吸光度上升的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本实施例以肌苷单磷酸为底物，应用5′-核苷酸酶偶联核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、脲酶、过氧化物酶等酶偶联反应以及还原型色原体组合系统，将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原或者吲嗒胺色原，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。
实施例二(双剂)本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有试剂I缓冲液 100mmol/l单价磷酸盐 5mmol/l
核苷磷酸酶8000U/l黄嘌呤氧化酶 8000U/l过氧化物酶8000U/l脲酶 8000U/l稳定剂50％(总体积)4-氨基抗砒1mmol/l试剂II缓冲液100mmol/l肌苷单磷酸3mmol/l稳定剂30mmol/l2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸1mmol/l测定5′-核苷酸酶活性时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟。
具体测定步骤为肌苷单磷酸+水5核苷酸酶肌苷+磷酸根肌苷+磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸+过氧化氢尿酸+水+氧脲酶尿囊素+过氧化氢2过氧化氢+2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液 120mmol/l单价磷酸盐 8mmol/l稳定剂 50mmol/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l试剂II缓冲液 120mmol/l核苷磷酸酶 12000U/l黄嘌呤氧化酶 12000U/l过氧化物酶 12000U/l脲酶 12000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 120mmol/l肌苷单磷酸 5mmol/l稳定剂 50mmol/l双甲基苯胺 2mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长578nm，测试副波长700nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟。
具体测定步骤为肌苷单磷酸+水5核苷酸酶肌苷+磷酸根肌苷+磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸+过氧化氢尿酸+水+氧脲酶尿囊素+过氧化氢2过氧化氢+2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
实施例四本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有试剂I缓冲液 120mmol/l单价磷酸盐 6mmol/l核苷磷酸酶 12000U/l黄嘌呤氧化酶12000U/l过氧化物酶 12000U/l脲酶12000U/l稳定剂 50％(总体积)4-氨基抗砒 1mmol/l试剂II缓冲液 120mmol/l肌苷单磷酸 2mmol/l稳定剂 20mmol/l双甲基苯胺 2mmol/l测定5′-核苷酸酶活性时，温度控制在30℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长700nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应肌苷单磷酸+水5核苷酸酶肌苷+磷酸根肌苷+磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸+过氧化氢尿酸+水+氧脲酶尿囊素+过氧化氢2过氧化氢+2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在5分钟。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种5′-核苷酸酶活性测定方法，步骤如下1)、将样品与主要由肌苷单磷酸、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶组成的试剂混合，使之发生如下反应肌苷单磷酸+水5核苷酸酶肌苷+磷酸根肌苷+磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸+过氧化氢尿酸+水+氧脲酶尿囊素+过氧化氢2过氧化氢+2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根据权利要求1所述5′-核苷酸酶活性测定方法，其特征在于所述步骤2)为，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根据权利要求1或2所述测定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述测定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于被测5′-核苷酸酶样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。
5.一种5′-核苷酸酶诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液 40--200mmol/l肌苷单磷酸 1--50mmol/l单价磷酸盐 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黄嘌呤氧化酶500--50000U/l过氧化物酶 500--50000U/l脲酶500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合0.1--20mmol/l
6.根据权利要求5所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述还原型色原体为0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
10.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合为由0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种测定5′－核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及5′－核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、肌苷单磷酸、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、稳定剂、还原型色原体组合，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/42GK1760375SQ200410064910
公开日2006年4月19日 申请日期2004年10月11日 优先权日2004年10月11日
发明者王尔中 申请人:王尔中