专利名称：使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及在基因重组技术中使用的诱导基因表达的物理方法，更具体地说，涉及一种使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法。
背景技术：
大肠杆菌表达系统由表达载体和相应的宿主细胞两部分构成，是发展最早、应用最广、最容易操作的基因高效表达系统。在大肠杆菌表达系统中，表达载体通常运用可调控型质粒载体控制外源基因的表达，从而控制被表达的目标蛋白对细胞生长的抑制、减少细胞蛋白酶对目标蛋白的降解作用、提高目标蛋白的产量。在重组蛋白的生产和应用中表达载体的调控方式是影响基因表达水平、重组蛋白产品的质量，以及生产成本的主要因素之一。二十多年来国内外科学家构建了多种调控类型的表达载体，包括糖原调控型、色氨酸调控型、磷酸盐调控型、pH调控型、溶氧调控型、生物素调控型、热激调控型等等。其中研究最早和应用最广的是糖原调控型和热激调控型的表达载体，应用最为成功的已商品化的表达载体包括带有lac/tac启动子、PL/PR启动子、T7启动子的系列载体等等(Sambrook，J，and DW Russell.2001.Molecular Cloninga laboratory manual，3rded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
糖原调控型载体T7系列的表达载体在已经商品化的表达系统中是表达水平最高的，其启动子来源于大肠杆菌T7噬菌体，由T7 RNA聚合酶选择性识别和启动转录。这种表达载体是通过控制T7 RNA聚合酶的合成而进行调控的将编码T7 RNA聚合酶的基因插入λ噬菌体，使它处于lac启动子或PL启动子的控制下；用这些λ噬菌体的衍生株感染大肠杆菌获得溶源菌DE3或CE6；以这些溶源菌为宿主细胞就可以通过IPTG诱导或热激诱导T7RNA聚合酶的合成，从而启动T7启动子转录和表达。这类载体多数由lac启动子间接调控，属于糖原调控型。
lac/tac载体是通过大肠杆菌的lac操纵基因来实现表达调控的。无诱导剂存在时，lacI编码的阻遏蛋白与启动子下游的操纵基因紧密结合阻止转录的起始；诱导剂的加入使阻遏蛋白从操纵基因上解离出来，从而使基因得到转录或表达。因此，这是另一类应用最广的糖原调控型载体。
糖原调控型表达载体工业化应用中存在着诱导剂的问题，如对于lac启动子调控的载体异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是最有效、应用最广泛的诱导剂，但是由于IPTG具有一定的毒性，这类表达载体在药用蛋白生产中的应用受到限制；同时，由于其价格昂贵IPTG在工业酶的生产中也难以推广。也有用乳糖代替IPTG作诱导剂，但是因为乳糖是可代谢底物，必须在较高浓度下经过转运和转化才能产生诱导作用，而且其诱导效果受到多种因素的影响(龚毅.2002.大肠杆菌表达系统.见基因表达技术，1-19.科学出版社，北京)。
糖原调控型表达载体的另一个缺陷是具有较高的本底表达，这在使用高拷贝复制子构建表达载体时尤其明显。因此，当目标基因产物对宿主细胞有害时，细胞的生长和繁殖受到抑制，重组蛋白的表达必然量受到影响。
热激调控型载体克服糖原调控型表达载体的缺点的方法之一是筛选阻遏蛋白的温度敏感型突变体，温度敏感型突变体所产生的阻遏蛋白在较低温度时(如30℃)对启动子具有阻遏功能，在较高温度(如40℃)时失去活性并且解阻遏(Elvin CM，PR Thompson，ME Argall et al.1990.Modified bacteriophage lambda promoter Vectors foroverproduction of proteins in Escherichia coli.Gene，87123-126)。现在已经有多种不同的温度敏感型lacI基因突变体被鉴定并且被应用于lac/tac启动子的调控；PL/PR是λ噬菌体的早期转录启动子，受基因cI所产生的阻遏蛋白抑制，其温度敏感型突变体cI857ts在热激诱导型载体的发展中起了重要作用，常用的载体包括pJLA503(Schauder，B et al.1987.Inducible expression vectorsincorporating the Escherichia coli atpE translational initiationregion.Gene，52279-283)、pBV220(张智清等.1990.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报，6111-116)、pHsh(中国发明专利申请号200410041636.7)等等。
热激调控型载体的不足之处在于进行大体积培养时难以实现快速升温(Glazer，AN，and H Nikaido.1995.Microbial Biotechnology.WH Freeman and Company，New York)，而升温缓慢又会影响表达水平；同时可能存在的另一个问题是在热激诱导过程中，大肠杆菌热休克系统被激活，从而合成蛋白酶对目标蛋白进行降解。对于小体积培养液可参照现有的方法进行升温，如热水浴法或换液法(Sambrook，J，and DWRussell，2001)。
最近，本研究组成功地构建了一种新型高效表达载体pHsh(中国发明专利申请号200410041636.7)，其特征在于具有由大肠杆菌σ因子σ32识别和调控的启动子，而不通过热敏感的抑制子进行调控。因此，这一种是诱导机制不同于其它热敏质粒的新型的用热激方法诱导目的基因的表达的质粒载体。与其它热激载体相比，这个新型载体主要优点是重组蛋白的产量高和大肠杆菌蛋白酶的活性低。因此，要将热激调控型载体大规模地应用于外源基因的表达，还需要解决的问题在于如何使大体积发酵液快速升温。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，在基因工程中通过发酵液的快速升温来诱导目的基因在大肠杆菌表达体系中进行大量表达，使热激诱导型的表达载体实现工业化应用。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现(1)预备A、B两台发酵罐，测试出B罐将水从起始温度加热到目标温度的加热速度；(2)在A、B罐中分别装入培养液，灭菌后将A罐的温度设置为起始温度，B罐的温度设置为目标温度；(3)向A罐接种热激调控型基因工程菌，进行通气搅拌发酵；(4)细胞处于对数生长期时，将A罐中的发酵液以步骤(1)中测出的加热速度注入已经预热至目标温度并且正在加热和通气搅拌的B罐中(5)A罐中的发酵液注入B罐后，将B罐的温度稳定在目标温度，让细胞继续生长，以获得目标蛋白的表达。
本发明中的起始温度是热激调控载体中阻遏蛋白对启动子具有阻遏功能的温度，如28-32℃，优选30℃；目标温度是使阻遏蛋白失去活性并且解阻遏的温度，如37-44℃，优选40-42℃；不同热激调控载体的起始温度和目标温度是本领域普通技术人员可通过查阅而得知的。
本发明方法向A、B罐中分别装入培养液，为了达到较理想的效果，推荐A罐与B罐的装液比为1∶(0.05-1.2)，优选1∶0.1。
本发明方法中的热激调控型基因工程菌是常规的以热激调控型载体作为表达载体的基因工程菌，其中热激调控型载体可以是pHsh、pJLA503或pBV220，对转入的外源基因没特别的限定。
本发明方法中将A罐中的发酵液注入B罐的时间选择在细胞对数生长期，优选对数生长期之早期；细胞的对数生长期可以以细胞密度为指标，但相对应的细胞密度因培养基的配方而异，本领域普通技术人员可通过实验绘制生长曲线而得知，如用Luria-Bertani培养基在30℃培养含有pHsh的大肠杆菌时，对数生长期的细胞密度OD600为0.4-2.0，对数生长期之早期的细胞密度为0.4-1.2，优选0.6-0.9。用Terrific培养基培养基培养时，对数生长期的细胞密度OD600为0.4-3，对数生长期之早期的细胞密度为0.4-1.2，优选0.7-1.2。
本发明方法中将A罐中的发酵液注入B罐后，让细胞继续生长，以获得目标蛋白的表达，继续培养的时间根据细胞生长情况而定，推荐2-12小时，优选6-9小时。
本发明方法中的基因工程菌可通过以下技术获得基因克隆选择Thermotoga maritima(ATCC4 3589)中的阿拉伯糖苷酶基因araB、葡萄糖醛酸酶基因aguA及其木聚糖酶基因xynB的突变体xynIII(本实验室诱变)等为待表达的基因，对pHsh、pJLA503、pBV220等热激调控型载体进行基因表达诱导试验。该试验中所用到的基因克隆的技术均参照冷泉港实验室出版的实验手册《分子克隆)》第三版(Sambrook，J，and DW Russell，2001)。
XynIII可通过xynII在表达载体pHsh中的原位定点诱变获得原位定点诱变为了降低大肠杆菌稀有密码子和非优势密码子在基因xynII中的出现频率，选择xynII基因序列中段稀有密码子和非优势密码子较密集区域进行定点诱变设计一对5’端邻接，3’端方向相反的引物，将变异序列平均分配在这对引物的5’端；以pHsh-xynII为模板，用Pyrobest DNA聚合酶进行PCR扩增；用T4 DNA激酶对PCR产物进行磷酸化，再用T4 DNA连接酶使之自身环化连接。突变体经转化、筛选、测序确认后定名为pHsh-xynIII。
araB、aguA和xynIII的PCR扩增片段被分别克隆到pHsh，插入位点为NcoI和XhoI；同时，xynIII的PCR扩增片段被克隆到载体pJLA503、pBV220中，插入位点为pJLA503的NdeI和SalI，以及pBV220的EcoRI和SalI。重组质粒被转化到大肠杆菌宿主细胞产生基因工程菌株pHsh-araB、pHsh-aguA、pHsh-xynIII、pJLA503-xynIII和pBV220-xynIII。
大体积发酵液热激诱导为了使获得快速升温以达到热激(heatshock)效果，本发明公开了预热-注入法。其操作过程如下(1)预备A、B两台发酵罐，A罐预设温度为a，B罐预设温度为b，测试B罐将水从a加热至b所需要的时间，换算出加热速度xml/min，即每分钟(min)能使多少(x)毫升(ml)水从a升温至b；(2)在A罐中装培养液n立升，B罐装n×0.1至n×1立升(A罐与B罐装液体积之和不得超出B罐的最大容量)，灭菌后将A罐的温度设置为a，B罐的温度设置为b；(3)向A罐接种以热激诱导型质粒为表达载体的大肠杆菌基因工程菌菌种，进行通气搅拌发酵；(4)细胞生长处于对数期时，将A罐中的发酵液以xml/min速度注入已经预热至b并且正在加热和通气搅拌的B罐中，可以通过调节发酵液的注入速度将B罐的温度控制在b；(5)A罐中的发酵液注入B罐后，将B罐的温度稳定在37-44℃，让细胞继续生长2至12个小时。每隔1小时取样一次，分析细胞密度和重组酶的活性，发现酶活性不再增长时立即停止培养并以大容量离心机或连续流式离心机离心收集细胞。
基因表达水平的评估以重组酶的活性估算基因表达水平(见图1至图5)。其中阿拉伯糖苷酶的活性定义为以1mM对硝基苯酚α-阿拉伯糖苷(pNPA，Sigma)为底物，在80℃，pH 5.8的条件下，每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量；葡萄糖醛酸酶的活性定义为以4-O-甲基葡萄糖醛酸寡木糖为底物，在80℃，pH 5.8的条件下，每分钟产生1μmolα-葡萄糖醛酸所需要的酶量；木聚糖酶活性定义为以0.5％Oatxylan(Sigma)为底物，在90℃，pH 5.8的条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量。
本发明的有益效果是使大体积发酵液中的细胞在瞬间获得升温获得热激效应，首次使低成本、无毒性的物理诱导方法实现工业化应用。
图1是以pHsh为表达载体的基因工程菌pHsh-xynIII分别在摇瓶中热激诱导和通过本发明方法热激诱导的基因表达水平曲线图；图2是以pHsh为表达载体的基因工程菌pHsh-araB分别在摇瓶中热激诱导和通过本发明方法热激诱导的基因表达水平曲线图；图3是以pHsh为表达载体的基因工程菌pHsh-aguA分别在摇瓶中热激诱导和通过本发明方法热激诱导的基因表达水平曲线图；图4是以pJLA503为载体的基因工程菌pJLA503-xynIII分别在三角瓶中热激诱导和通过本发明方法热激诱导的基因表达水平曲线图；图5是以pBV220为载体的基因工程菌pBV220-xynIII分别在三角瓶中热激诱导和通过本发明方法热激诱导的基因表达水平曲线图。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1木聚糖酶的制备(1)基因克隆将Thermotoga maritimas基因xynB的突变体xynIII通过NcoI和XhoI双位点克隆到表达载体pHsh中构建成重组质粒pHsh-xynIII；用电穿孔法(electroporation)将这个质粒转入大肠杆菌菌株JM109。
(2)菌种制备挑选出的转化子接入250ml含有100μg/ml氨苄青霉素的Terrific培养基，在30℃摇床中进行振荡培养至OD600约为2.0。
(3)细胞培养A罐装10升Terrific培养基，灭菌后降温至30℃，接入菌种250ml并加入0.8克氨苄青霉素；于30℃通气搅拌培养至OD600约为1.2，溶氧量为80％以上，搅拌速度为250rpm。
(4)表达诱导测试出B罐每分钟可将1升水从30℃加热到42℃。B罐装10升Terrific培养基，灭菌后降温至42℃，加入氨苄青霉素0.8克；将A罐中的发酵液以约每分钟1升的速度注入B罐，边注入边加热搅拌使温度维持在39-42℃之间；全部注入B罐后于42℃继续通气搅拌培养，6小时后停止培养，并以连续流式离心机离心收集细胞。
(5)将细胞悬浮于磷酸缓冲液，通过高压细胞破碎仪使细胞裂解；将细胞裂解液置于70度下水浴30min，离心除去沉淀，获得接近电泳纯的木聚糖酶。
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于，外源基因为T.ethanolicus中的阿拉伯糖苷酶基因araB，将它克隆到表达载体pHsh中得到重组质粒，并转化大肠杆菌JM109得到相应得重组菌株pHsh-araB。
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于，外源基因为T.ethanolicus中的葡萄糖醛酸酶基因aguA，将它克隆到表达载体pHsh中得到重组质粒，并转化大肠杆菌JM109得到相应得重组菌株pHsh-aguA。
实施例4与实施例1基本相同，不同之处在于，宿主菌是大肠杆菌JM109(DEC)。
实施例5与实施例1基本相同，不同之处在于，宿主菌是大肠杆菌DH5α。
实施例6与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐灭菌后降温至28℃，菌种培养至OD600约为0.4，B罐装1升Terrific培养基，灭菌后降温至37℃，将A罐中的发酵液以约每分钟1升的速度注入B罐，全部注入B罐后于37℃继续通气搅拌培养2小时。
实施例7与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐灭菌后降温至32℃，菌种培养至OD600约为0.5，B罐装5升Terrific培养基，灭菌后降温至44℃，将A罐中的发酵液以约每分钟1升的速度注入B罐，全部注入B罐后于44℃继续通气搅拌培养10小时。
实施例8与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐灭菌后降温至29℃，菌种培养至OD600约为0.9，B罐装8升Terrific培养基，灭菌后降温至41℃，将A罐中的发酵液以约每分钟1升的速度注入B罐，全部注入B罐后于37℃继续通气搅拌培养9小时。
实施例9与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐灭菌后降温至31℃，菌种培养至OD600约为0.7，B罐装2升Terrific培养基，灭菌后降温至40℃，将A罐中的发酵液以约每分钟1升的速度注入B罐，注入B罐后于40℃继续通气搅拌培养12小时。
实施例10与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐装培养基15升，B罐装培养基18升。
实施例11与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐装培养基20升，B罐装培养基1升。
实施例12与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐装培养基15升，B罐装培养基20升。
实施例13与实施例1基本相同，不同之处在于，表达诱导步骤中A罐装培养基20升，B罐装培养基0.8升。
实施例15与实施例1基本相同，不同之处在于，B罐的加热速度为每分钟1.2升。
实施例16与实施例1基本相同，不同之处在于，A罐细胞密度达到3.0时，转罐热激诱导。
实施例17与实施例1基本相同，不同之处在于，A罐细胞密度达到0.7时，转罐热激诱导。
实施例18与实施例1基本相同，不同之处在于，A罐细胞密度达到2.0时，转罐热激诱导。
实施例19与实施例1基本相同，不同之处在于，使用Luria-Bertani培养基培养。
实施例20与实施例19基本相同，不同之处在于，A罐细胞密度达到1.0时，转罐热激诱导。
实施例21与实施例19基本相同，不同之处在于，A罐细胞密度达到0.6时，转罐热激诱导。
实施例22与实施例19基本相同，不同之处在于，A罐细胞密度达到0.9时，转罐热激诱导。
实施例23与实施例19基本相同，不同之处在于，以pJLA503为表达载体构建成重组质粒pJLA503-xynIII。
实施例24与实施例19基本相同，不同之处在于，以pBV220为表达载体构建成重组质粒pBV220-xynIII。
实施例25与实施例19基本相同，不同之处在于，将带有重组质粒pHsh-xynIII的基因工程菌用本发明方法诱导，A罐与B罐的装液比为1∶0.25，转罐培养测定酶活性，见图1；在容量为100ml的三角瓶中装入25ml培养基，灭菌、冷却后加入氨苄青霉素至0.1mg/ml，并以1-5％接种量接入带有重组质粒pHsh-xynIII的基因工程菌；将三角瓶置于30℃摇床振荡培养，细胞密度(OD600)达到1.0左右时将它从30℃摇床移入42℃水浴摇床继续振荡培养；从表达诱导时开始每隔2小时取样一次，测定酶活性的增加，见图1。
实施例26与实施例25基本相同，不同之处在于，基因工程菌是带有重组质粒pHsh-araB的基因工程菌，测定酶活性，见图2。
实施例27与实施例25基本相同，不同之处在于，基因工程菌是带有重组质粒pHsh-aguA的基因工程菌，测定酶活性，见图3。
实施例28与实施例25基本相同，不同之处在于，基因工程菌是带有重组质粒pJLA503-xynIII的基因工程菌，测定酶活性，见图4。
实施例29与实施例25基本相同，不同之处在于，基因工程菌是带有重组质粒pBV220-xynIII的基因工程菌，测定酶活性，见图5。
权利要求
1.一种使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其步骤如下(1)预备A、B两台发酵罐，测试出B罐将水从起始温度加热到目标温度的加热速度；(2)在A、B罐中分别装入培养液，灭菌后将A罐的温度设置为起始温度，B罐的温度设置为目标温度；(3)向A罐接种热激调控型基因工程菌，进行通气搅拌发酵；(4)细胞处于对数生长期时，将A罐中的发酵液以步骤(1)中测出的加热速度注入已经预热至目标温度并且正在加热和通气搅拌的B罐中(5)A罐中的发酵液注入B罐后，将B罐的温度稳定在目标温度，让细胞继续生长，以获得目标蛋白的表达。
2.根据权利要求1的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，其中的起始温度是28-32℃，目标温度是37-44℃。
3.根据权利要求2的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，其中的起始温度是30℃，目标温度是40-42℃。
4.根据权利要求1的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，其中步骤(2)中A罐与B罐的装液比为1∶0.05-1.2。
5.根据权利要求4的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，所述的A罐与B罐的装液比为1∶0.1。
6.根据权利要求1的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，其中的热激调控型基因工程菌是以pHsh、pJLA503或pBV220为载体的基因工程菌。
7.根据权利要求1的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，其中步骤(4)中的转罐是在细胞处于对数生长期之早期时。
8.根据权利要求1的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，其中步骤(5)中让细胞继续生长2至12个小时。
9.根据权利要求8的使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法，其特征在于，其中步骤(5)中让细胞继续生长6至9个小时。
全文摘要
本发明公开了一种使大体积发酵液快速升温的热激诱导方法。其特征是预备A、B两台发酵罐，测试出B罐将水从起始温度加热到目标温度的加热速度；在A、B罐中分别装入培养液，灭菌后将A罐的温度设置为起始温度，B罐的温度设置为目标温度；向A罐接种热激调控型基因工程菌，进行通气搅拌发酵；细胞处于对数生长期时，将A罐中的发酵液以测出的加热速度注入已经预热至目标温度并且正在加热和通气搅拌的B罐中；A罐中的发酵液注入B罐后，将B罐的温度稳定在目标温度，让细胞继续生长，以获得目标蛋白的表达。本发明的有益效果是使大体积发酵液中的细胞在瞬间获得升温获得热激效应，使低成本、无毒性的物理诱导方法实现工业化应用。
文档编号C12M3/00GK1609212SQ20041006577
公开日2005年4月27日 申请日期2004年11月18日 优先权日2004年11月18日
发明者邵蔚蓝, 裴建军 申请人:南京师范大学