专利名称：灭活sars病毒的灭菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种灭活SARS病毒的灭菌剂及其制备方法，对SARS病毒、乙肝病毒具有灭活作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黑色变种芽胞可彻底杀灭，可广泛应用于医疗、人体卫生护理、食品、农作物、动物、环境灭菌上，属于灭菌剂技术领域。
背景技术：
目前，国内外还没有经权威部门认定的灭活SARS病毒的灭菌剂，而现在国内外使用的化学灭菌药剂的灭菌机理主要是改变细菌胞膜的渗透性，对蛋白质、肽链和氨基酸的破坏与抑制，实现灭菌或抑菌。但这时，细菌的核酸未被破坏或仅被抑制，细菌将对其进行修复，而这种修复是以耐药质粒的形式出现。
发明内容
本发明的目的是提供一种以细菌核酸为靶点，破坏基因表达、能使细菌的DNA裂解而研制的破坏细菌基因表达的灭活SARS病毒的灭菌剂及其制备方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种灭活SARS病毒的灭菌剂，其特征在于，是一种以十二烷基硫酸钠、氯氨T、羧甲基纤维素钠为原料的三元复配，它由下述重量百分比的原料配制十二烷基硫酸钠 CH3(CH2)nOSO3Na 5-20％氯氨TC7H7SO2NClNa· 3H2O 5-20％羧甲基纤维素钠 [(C6H7O2(OH)x(OCH2COONa)y]n0.01-0.1％(X＝1.50～2.80Y＝0.20～1.50)蒸馏水 55-92％一种灭活SARS病毒的灭菌剂的制备方法，其特征在于，它包括下列步骤(1)按重量百分配比称取各原料备用；(2)将十二烷基硫酸钠放入反应釜中倒入蒸馏水在30-50℃下搅拌15-30分钟，使其溶解；
(3)将氯氨T放入另一个反应釜中倒入蒸馏水在30-50℃下搅拌15-30钟，使其溶解；(4)将上述两种溶解液倒在反应釜中混合，加入羧甲基纤维素钠，加温到60-80℃，搅拌20-40分钟；(5)过滤、灌装、成品质检、入库。
本发明运用分子生物学、分子药理学的基本原理和反义物研究原理，经三元优化复配的药物协同增效，作用于细菌的脂质后，立即引发其溶解，可使细菌胞膜酶蛋白--SH基变性为-S-S基，导致细胞膜结构疏松，提高了菌膜的渗透性，快速破坏胞膜和核膜，并导致蛋白质的构象发生变化，使蛋白质变性，使核蛋白中的DNA被分散、直至被打开结构，破坏成片断，让细胞的DNA失去了完整性和基因表达能力，实现在分子水平上的提高。
本发明优化复配的灭菌剂可使细菌染色体的质粒RNA丢失频率提高100倍以上，在没有基因表达的条件下，阻遏了质粒的拷贝修复，不会产生耐药性。
本发明的优点是以细菌核酸为靶点，能使细菌的DNA裂解，破坏细菌的基因表达，本发明的产品无毒、无异味、对皮肤及皮肤粘膜无刺激、对环境无污染。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明实施例1一种灭活SARS病毒的灭菌剂，其特征在于，是一种以十二烷基硫酸钠、氯氨T、羧甲基纤维素钠为原料的三元复配，制备方法包括下列步骤(1)按重量百分配比称取各原料备用；十二烷基硫酸钠 CH3(CH2)nOSO3Na 5-20％氯氨T C7H7SO2NClNa·3H2O 5-20％羧甲基纤维素钠 [(C6H7O2(OH)x(OCH2COONa)y]n0.01-0.1％(X＝1.50～2.80 Y＝0.20～1.50)蒸馏水 55-92％(2)将十二烷基硫酸钠放入反应釜中倒入蒸馏水在40℃下搅拌20分钟，使其溶解；
(3)将氯氨T放入另一个反应釜中倒入蒸馏水在40℃下搅拌20分钟，使其溶解；(6)将上述两种溶解液倒在反应釜中混合，加入羧甲基纤维素钠，加温到67℃，搅拌30分钟；(7)过滤、灌装、成品质检、入库。
本发明经国家新药筛选中心对SARS病毒灭活的检测当本发明在1∶200稀释浓度时(25MG/L)，可100％灭活SARS病毒，在1∶2000稀释浓度时，SARS病毒失去了感染细胞的能力，见附件1。
国家新药筛选中心National Center for Drug ScreeningShanghai，China“诗凯兰”灭菌消毒剂对SARS病毒灭活效价的检测报告测试项目“诗凯兰”灭菌消毒剂对SARS病毒灭活效价的检测测试原理不同稀释浓度的消毒剂与100倍TCID50的SARS病毒溶液相互作用后，加入SARS病毒易感细胞(Vero-E6细胞)培养体系中，测试经消毒剂处理后SARS病毒感染细胞的能力，检测指标是否有SARS病毒感染引起的易感细胞发生CPE(Cytopathic effect，细胞病变效应)，包括细胞变形，脱落和死亡。
测试材料和方法1.病毒株BJ-01(来源于北京军事科学院微生物流行病研究所)2.实验场所上海疾病预防和控制中心P3实验室3.测试样品提供单位上海中科药业有限公司4.样品处理消毒剂配成适宜的初始浓度，10倍稀释，6稀释度，不同稀释浓度的消毒剂与100倍TCID50的SARS病毒溶液相互作用5分钟后，加入SARS病毒易感细胞(Vero-E6细胞)培养体系。
5.测试方法把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％CO2培养，加入不同稀释浓度的消毒剂与100倍TCID50的SARS病毒溶液相互作用5分钟后的样品，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录CPE，并用中性红染色测定OD值，参照对照组进行样品组中的SARS病毒活性作用的计算和评价。
国家新药筛选中心National Center for Drug ScreeningShanghai，China测试结果
细胞病变法(CPE)以“-”表示细胞附着形态完整，未见明显的脱离，但不比较细胞数量的多少以“+”表示细胞病变程度，＜25％+，25％～50％++，50％～75％+++，＞75％++++。
感染细胞保护率通过比较病毒对照、细胞对照和样品对照的OD值，计算样品对病毒感染细胞的保护活性，保护率＞1.5倍率，初步被认为样品对病毒感染细胞具有一定的保护活性。
*样品细胞毒性如果样品的细胞毒性与细胞对照比＞50％时，不做CPE评价和保护率计算。
结论“诗凯兰”灭菌消毒剂在1∶2000稀释浓度时与100倍TCID50的SARS病毒溶液相互作用5分钟后，样品中的SARS病毒明显地失去了感染细胞的能力。
研究单位中国科学院上海药物研究所国家新药筛选中心实验负责人左建平实验人员杨以阜、何佩岚、周宇、唐炜、任永欣实验起止日期2003.05.
原始资料保存处 中国科学院上海药物研究所免疫药理研究室联系人 南发俊、唐炜任永欣电话(021)50806600 2501(021)50801313 231 216
本发明经中科院上海药物研究所检测，在1∶20的稀释浓度下作用5分钟、10分钟、15分钟，能够有效裂解大肠杆菌的基因组DNA，时间延时效果更好，见附件2。
1.DL2000MARKER2.不加消毒液空白对照3.消毒液1∶10稀释作用5分钟4.消毒液1∶10稀释作用10分钟5.消毒液1∶10稀释作用15分钟6.不加消毒液空白对照7.消毒液1∶20稀释作用5分钟8.消毒液1∶20稀释作用10分钟9.消毒液1∶20稀释作用15分钟10.不加消毒液空白对照11.消毒液1∶50稀释作用5分钟12.消毒液1∶50稀释作用10分钟13.消毒液1∶50稀释作用15分钟操作方法取大肠杆茵JM109培养过夜，分装12管，每管200微升，离心，加入不同稀释倍数的消毒液，作用5分钟，10分钟，15分钟后进行电泳，琼脂糖凝胶浓度1％。空白对照组为不加消毒液的MILLIQ水。
分析空白对照组2.6.10.的电泳孔内含有大肠杆菌的基因组DNA，估计是机械外力如离心或电泳电压造成大肠杆菌胞膜破坏，基因组DNA游离出来，但由于分子量较大，仍在电泳孔内。消毒液1∶10稀释作用5分钟，10分钟，15分钟，和消毒液1∶20稀释作用5分钟，10分钟，15分钟。大肠杆菌的基因组DNA完全发生降解，电泳孔内没有基因组DNA，(电泳道内有2条条带)。消毒液1∶50稀释作用5分钟，10分钟，15分钟，大肠杆菌的基因组DNA只是很少的发生了降解(电泳道内有模糊的1条条带)，大部分基因组DNA仍在电泳孔内。
结论消毒液1∶10或1∶20稀释作用5分钟，10分钟，15分钟，能够有效降解大肠杆菌的基因组DNA，消毒液1∶5O稀释作用5分钟，10分钟，15分钟，能够部分降解大肠杆菌的基因组DNA，说明仍然有效，时间延长，效果可能更好。
检测单位中国科学院上海药物研究所分子药理学试验室本发明对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黑色变种芽胞的杀灭，对乙肝病毒灭活的检测报告见附件3辽宁省疾病预防控制中心检测报告样品编号辽消申(2002)第0003号样品名称诗凯兰消毒剂受检单位开原市诗凯兰科技开发研制中心二○○二年五月二十七日
辽宁省技术监督局批准辽技监认字Q0186辽宁省疾病预防控制中心检测报告样品受理编号辽消申(2002)第0003号 第1页/共25页样品名称诗凯兰消毒剂样品数量5瓶送检单位省卫生监督所样品性状无色液体、塑料瓶生产单位开原市诗凯兰科技开发研制中心接样日期2002年03月11日生产日期或批号20010812检验完成日期2002年05月27日检测依据中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》(第三版)第一分册《实验技术规范》1999.11中华人民共和国国家标准《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》GB 15981-1995检测结论1.消毒剂有效成份含量测定(化学法)诗凯兰消毒剂有效成份(有效氯)含量的平均值为0.5085％。
2.药物稳定性测定(化学测定法)诗凯兰消毒剂经54℃温箱(相对温度＞75％)、放置时间2周，诗凯兰消毒剂有效成份(有效氯)含量的平均值为0.50％，有效成份下降948％。
3.消毒剂pH值测定诗凯兰消毒剂pH平均值为9.67。
4.金属腐蚀性试验试验重复3次，试验结果表明诗凯兰消毒剂(有效成份为氯)有效氯含量3000mg/l对碳钢片为中度腐蚀、铝片为轻度腐蚀、铜片为轻度腐蚀、不锈钢片为中度腐蚀。
5.大肠杆菌中和剂鉴定试验(载体定量法)消毒剂浓度为150mg/L时，含1.0g/L硫代硫酸钠、体积分数1.0％吐温80、1.0g/L卵磷脂的0.03mol/LPBS的中和剂，可有效中和溶液中和菌体表面残留消毒剂对试验菌的作用，且中和剂及其中和产物对试验菌及培养基无不良影响。
6.大肠杆菌定量杀灭试验(载体定量法)消毒剂浓度为50mg/L，作用时间为10min，对大肠杆菌的平均杀灭率为99.90％。
7.金黄色葡萄球菌定量杀灭试验(载体定量法)消毒剂浓度为100mg/L，作用时间为10min，对金黄色葡萄球菌的平均杀灭率为99.91％。
8.白色念珠菌中和剂鉴定试验(载体定量法)消毒剂浓度为450mg/L时，含1.0g/L硫代硫酸钠、体积分数1.0％吐温80、1.0g/L卵磷脂的0.03mol/L PBS的中和剂，可有效中和溶液中和菌体表面残留消毒剂对试验菌的作用，且中和剂及其中和产物对试验菌及培养基无不良影响。
9.白色念珠菌定量杀灭试验(载体定量法)消毒剂有效成份浓度为200mg/L，作用时间为15min，对白色念珠菌的平均杀灭率为99.97％。
10.枯草杆菌黑色变种芽胞中和剂鉴定试验(载体定量法)消毒剂有效成份浓度为4000mg/L时，含3.0g/L硫代硫酸钠、体积分数0.5％吐温80的0.03mol/L PBS溶液的中和剂，可有效中和溶液中和菌体表面残留消毒剂对试验菌的作用，且中和剂及其中和产物对试验菌及培养基无不良影响。
(以下空白)签发人 最终审核日期2002年5月28日
辽宁省技术监督局批准辽技监认字Q0186辽宁省疾病预防控制中心检测报告样品受理编号 辽消申(2002)第0003号第2页/共25页(接上页)11.枯草杆菌黑色变种芽胞定量杀灭试验(载体定量法)消毒剂有效成份浓度为3000mg/L，作用时间为40min，对枯草杆菌黑色变种芽胞的平均杀灭率为99.91％。
12.HbsAg中和剂鉴定试验(载体定量法)消毒剂有效成份浓度为500mg/L时，含3.0g/L硫代硫酸钠、体积分数0.5％吐温80、10％小牛血清的0.03mol/L PBS溶液的中和剂，可有效中和残留消毒剂对HBsAg抗原性的破坏作用，且中和剂及其中和产物对HBsAg抗原性及检测体系无不良影响。
13.乙型肝炎表面抗原破坏试验消毒剂有效成份浓度为500mg/L，作用时间5min对HBsAg抗原性的消除S/N值为2.04(1.88～2.06)。
14.有机物对消毒剂杀菌效果的影响试验消毒剂有效成份浓度为100mg/L，含50％小牛血清组第2～4个作用时间的试验，对所试微生物(大肠杆菌)杀灭效果合格，为试验组所试因素轻度影响。
消毒剂有效成份浓度为100mg/L，含25％小牛血清组第1～4个作用时间的试验，对所试微生物(大肠杆菌)杀灭效果合格，为试验组所试因素无度影响。
15.模拟现场试验消毒剂(有效成份)浓度为4000mg/L，作用时间为30min，对载体(医疗器械)上枯草杆菌黑色变种芽胞平均杀灭率为99.93％。
16.消毒剂对物体表面消毒现场试验试验观测30次，试验温度为20～22℃。消毒剂(有效成份)浓度为500mg/L，作用时间为5min，对物体表面自然菌的消除率为95.10％(90.13～97.66％)，物体表面上残留菌数达国家卫生标准的件数为30(占100％)，物体表面上残留菌数平均值为8.1cfu/cm2(0.4～14.8cfu/cm2)。
17.能量试验诗凯兰消毒剂(有效成份为氯)的最低合格浓度为225mg/L。
18.急性经口毒性试验受试物对小鼠雌性急性经口半数致死量LD50＞5000mg/kg。
受试物对小鼠雄性急性经口半数致死量LD50＞5000mg/kg。
受试物属实际无毒。
19.皮肤刺激试验受试物对实验动物皮肤刺激强度为无刺激性。
20.蓄积毒性试验-剂量递增蓄积系数法受试物对小鼠蓄积系数(K值)为＞5，为弱蓄积毒性。
21.小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验受试物对小鼠骨髓红细胞无致微核作用(P值为＞0.05)。
(以下空白)
权利要求
1.一种灭活SARS病毒的灭菌剂，其特征在于，是一种以十二烷基硫酸钠、氯氨T、羧甲基纤维素钠为原料的三元复配，它由下述重量百分比的原料配制十二烷基硫酸钠CH3(CH2)nOSO3Na 5-20％氯氨T C7H7SO2NClNa·3 H2O 5-20％羧甲基纤维素钠[(C6H7O2(OH)x(OCH2COONa)y]n0.01-0.1％(X＝1.50～2.80 Y＝0.20～1.50)蒸馏水 55-92％
2.一种灭活SARS病毒的灭菌剂的制备方法，其特征在于，它包括下列步骤(1)按重量百分配比称取各原料备用；(2)将十二烷基硫酸钠放入反应釜中倒入蒸馏水在30-50℃下搅拌15-30分钟，使其溶解；(3)将氯氨T放入另一个反应釜中倒入蒸馏水在30-50℃下搅拌15-30分钟，使其溶解；(4)将上述两种溶解液倒在反应釜中混合，加入羧甲基纤维素钠，加温到60-80℃，搅拌20-40分钟；(5)过滤、灌装、成品质检、入库。
全文摘要
本发明涉及一种灭活SARS病毒的灭菌剂，其特征在于，它由下述重量百分比的原料配制十二烷基硫酸钠5－20％、氯氨T 5－20％、羧甲基纤维素钠0.01－0.1％、蒸馏55－92％，其制备方法包括下列步骤按重量百分配比称取各原料备用；将十二烷基硫酸钠放入反应釜中倒入蒸馏水搅拌，使其溶解；将氯氨T放入另一个反应釜中倒入蒸馏水搅拌，使其溶解；将上述两种溶解液倒在反应釜中混合，加入羧甲基纤维素钠，加温，搅拌；过滤、灌装、成品质检、入库。本发明的优点是以细菌核酸为靶点，能使细菌的DNA裂解，破坏细菌的基因表达，本发明的产品无毒、无异味、对皮肤及皮肤粘膜无刺激、对环境无污染。
文档编号C12N7/06GK1752209SQ20041006650
公开日2006年3月29日 申请日期2004年9月20日 优先权日2004年9月20日
发明者陈英霞 申请人:陈英霞