内含rna病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：：内含rna病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及病毒基因工程领域，具体是一种内含RNA病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法与应用。
背景技术：
：丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，SARS-CoV)等RNA病毒是一类可致人类严重疾病的病原体，目前，针对这些病原体的检测主要有两类方法(CollinsML，etal.，NucleicAcidsRes.1997，25(15)2979-84；MulderJ，etal.，JClinMicrobiol.1994，32(2)292-300)，一类是基于抗原抗体的免疫测定方法，主要是检测标本中的病毒抗原或机体产生的抗体。另一类是应用核酸检测病人标本中病毒的RNA。免疫学检测是诊断病毒的常规方法，但是，相对于核酸检测，免疫学检测存在着窗口期长，且不能反映病毒感染者体内病毒的复制情况等缺点。而核酸检测由于其敏感性和特异性高，检测窗口期短，又能够直接反映感染体内病毒载量(vanGemenB，etal.，JVirolMethods.1994(2)；49157-168)，因此，已经广泛应用于血液筛查，母婴垂直感染诊断，病人的预后及抗病毒治疗疗效评估等各个方面(ZhangM，VersalovicJ，AmJClinPathol.2002，118SupplS26-32)。多种测定病毒RNA的方法已经在临床中得到应用(JournotV，etal.，ControlClinTrials.2001，22(6)639-658)，如竞争性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、核酸序列依赖的扩增技术(nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)、支链DNA(bDNA)信号放大系统和Real-time荧光定量PCR等。这些定量检测方法的过程基本上为(1)样本采集，(2)核酸提取(3)逆转录(4)扩增(bDNA除外)(5)检测。在样本检测过程中，上述技术容易受到以下多种因素的影响(YamWC，etal.，JCloinMicrobiol.2003，41(10)4521-4524)(1)样本中的许多物质，如粪便标本中的胆盐和多糖，血液中的血红素及尿中的尿素，会对PCR反应产生抑制作用，机制可能是干扰Taq酶的聚合作用。(2)样本处理过程中的某些因素，如分离过程中残留的提取试剂如乙醇、酚、SDS等也能够抑制扩增反应。人为操作的失误会造成样本核酸的丢失，使目的核酸量减少而导致出现假阴性结果。(3)反应体系的影响因素逆转录过程中的酶的活性偏低，不合适的贮藏条件所造成检测的目的片段降解，引物设计不合理，热循环过程未达到理想状态等因素也会导致检测结果的不准确。因此，欧洲标准委员会(TheEuropeanStandardsCommittee)和国际标准化组织(InternationalStandardOrganization)建议，在做核酸扩增实验时，除了将每一步中的错误影响因素降到最低外，还需要有严格的质量控制措施，包括假阳性质控，假阴性质控和定量检测的质控(HoorfarJ，etal.，JClinMicrobiol.2003，41(12)5835)。此外，一个外标定量测定方法还需要一个标准系列，用来确定同时处理的临床标本病毒含量。目前，国内常使用的实时荧光定量PCR方法，基本上都为外标定量方法。由于病毒潜在的传染危险性及其RNA核酸的不稳定性，目前应用的质控物如灭活的病毒颗粒，cDNA，质粒DNA以及裸露的RNA，都难以达到此要求，所以研制无生物传染危险性及稳定的质控物和标准品，不但对病毒RNA的RT-PCR检测，而且对相应的RT-PCR试剂盒的评价都具有重要意义。有人应用牛腹泻病毒(BVDV)作为检测HCV的内部标准品(vanGemenB，etal.，JVirolMethods.1994，49(2)157-167)，或者用HCV病毒颗粒作为检测HCVRNA的标准品代替WHO提供的HCV标准品(PickettGG，PeabodyDS，NucleicAcidsRes.1993，21(19)4621-4626)，或者用HIV病毒颗粒作为通用的病毒RNA标准品，但是，这些技术无法克服病毒颗粒传染性、病毒颗粒制备运输困难等问题，也就是说病毒颗粒不是理想的标准品。已知某些RNA病毒如MS2噬菌体、烟草花叶病毒(TMV)的外壳可以使其RNA基因组耐受RNase。因此，如将作为标准品的RNA序列包裹到这些病毒外壳内，就可以使特定的RNA序列免受环境中RNase的降解，同时，在应用过程中还可以模拟病毒颗粒监测核酸提取过程中的病毒裂解效率。近年来，随着分子生物学技术的发展，制备内含RNA病毒样颗粒成为可能。MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3569nt，编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。噬菌体由180包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成。在较早期的MS2噬菌体包膜蛋白的研究中，发现包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内(Yen-LiebermanB，etal.，JClinMicrobiol.1996，34(11)2695-2701)。因此，如果将特定病毒RNA的cDNA克隆于MS2噬菌体包膜蛋白基因序列cDNA下游，然后将终止子插入外源cDNA下游，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的特定病毒RNA转录本，操纵子RNA序列就可以引发噬菌体包膜蛋白组装成外壳，并将携带有特定病毒RNA序列的部分噬菌体基因组包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。不过，如果仅仅将特定病毒RNA的cDNA序列克隆于操纵子序列cDNA下游，然后用双质粒表达系统表达噬菌体包膜蛋白后，所组装噬菌体样颗粒有缺陷，即缺乏成熟特性。这种有缺陷的噬菌体病毒样颗粒不能防止RNase对内包特定RNA的降解作用(DesireN，etal.，JClinMicrobiol.2001，39(4)1303-1310)，而且，组装所得噬菌体样颗粒内含有宿主即大肠杆菌的核糖体RNA(rRNA)。主要原因是宿主rRNA前体中含有与MS2操纵子同源的序列，其rrnE转录本、rrnH转录本和rrnB转录本内部16S与23SRNA序列之间的间隔序列等都有与MS2操纵子RNA同源的序列，这些同源序列可引发宿主rRNA的包装。在构建质粒表达载体时，需将噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表达于表达载体启动子下游，这样，经过诱导表达后，所表达的包膜蛋白不仅仅作为病毒样颗粒的结构成分，而且可作为基因表达调节因子和pac信号对表达过程进行调节(BagnarelliP，etal.，JMedVirol.1991，34(2)89-95)，使包膜蛋白的表达和RNA的转录协调一致，此时，组装所得噬菌体样颗粒具有成熟特性，从而具有RNase抗性。同时，转录表达协调进行特异性识别包装噬菌体基因组RNA，排除宿主rRNA的组装。因此，考虑在噬菌体组装的过程中，除了21聚RNA茎环特异性结合外，包膜蛋白内表面有精氨酸/赖氨酸富集区可以与RNA非特异性作用，促进包膜蛋白的组装。Pasloske等(JClinMicrobiol.1998，36(12)3590-3594)利用MS2噬菌体RNA在自然界中能够耐受RNase降解和在一般理化条件下保持稳定的特性，来研究制备稳定性好的RNA质控品或标准品。最初他们将目的片段(质控RNA)插入到MS2噬菌体基因组中，构建成含reRNA的，有活性的MS2噬菌体。但是，这类reRNA因在有活性的MS2噬菌体内，会因为MS2恢复野生型而丢失插入片段；重组的MS2还能够增殖，从而造成量的难以确定，MS2的增殖还容易造成实验室的污染。而且MS2的复制酶是一个保真性很差的聚合酶，很容易在RNA复制过程中掺入错误的碱基，从而造成质控序列的不稳定。所以，在后来的研究中，他们采用了质粒表达系统来表达HIV-1病毒样颗粒。该表达载体含有以下序列成熟酶编码序列，成熟酶核糖体结合位点，衣壳蛋白编码序列，包装位点，复制酶的部分起始位点，以及HIV-1质控用的目的序列(142bp)。但该表达载体所表达的病毒样颗粒中HIV-1质控用的目的序列太小，不适合多种方法或含有多种检测病毒RNA的RT-PCR试剂盒的应用；同时病毒样颗粒不是很稳定，且不能产生具有HIV-1部分抗原的病毒样颗粒，其应用面较小。综上所述，在RNA病毒的RT-PCR检测中，由于影响实验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率以及试剂的问题等，这些因素均有可能会影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此，PCR测定必须使用质控品进行严格的室内质量控制才能保证结果的可靠性。此外，为进行定量测定，还需要有定量的标准品或内标，内标还可以起到单管即时质控的作用。一个稳定可靠且无生物传染危险性的RNA质控品和标准品，对于RNA病毒的RT-PCR高质量的检测具有重要价值。在这一点上，裸露的RNA或病毒颗粒及病毒替代品均难以做为理想的质控品和标准品，而采用分子克隆和原核表达方法构建的内含特定病毒RNA片段的噬菌体病毒样颗粒则较好的解决了这些问题，其不但对于RNA病毒RT-PCR检测的标准化，而且对于特定的mRNA的检测等均有着潜在的应用价值。
发明内容本发明所要解决的技术问题就是提供一种能够稳定可靠且无生物传染危险性的RNA质控品和标准品的内含RNA病毒核酸的耐RNase病毒样颗粒。本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种适用于多种方法或含有多种检测病毒RNA的RT-PCR试剂盒所扩增片段的内含RNA病毒核酸的耐RNase病毒样颗粒。目前，研究表明(ElbeikT，etal.，ExpertRevMolDiagn，2002；2(3)275-285)根据单独表达的包膜蛋白组装过程中具有不成熟的特性，不能得到耐RNase的病毒包膜，所以将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5’非编码序列相应的cDNA序列都连接到表达载体如pET28bT7启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA片段的协同作用下，包膜蛋白可以组装为成熟的病毒样颗粒，并具备耐RNase作用的特性。据此，本发明成功构建了内含MS2噬菌体的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5’非编码序列的表达载体，并经原核表达后，得到的病毒样颗粒具有耐RNase的特性。然后将HCVRNA、HIVRNA和SARS-CoVRNA等的cDNA序列构建于该质粒载体中的MS2噬菌体1.7kb基因组下游，经转化细菌表达后，即可得到具有耐RNase的特性的内含特定RNA的病毒样颗粒，这种颗粒可作为特定RNA的RT-PCR测定的稳定的标准品和质控品，且无传染性。MS2噬菌体RNA基因组序列全长为3.6kb，除去包装的1.7kb的MS2序列，理论上还能包装1.9kb的片段。但目前研究发现，当包装核酸片段的长度超过500bp时，病毒样颗粒的包装效率会大大下降(CindyR，etal.，ClinChem1999，45(12)2079-2085)，这样现有的技术一般采用保守的做法，如Pasloske等只包装了HIV-1质控用的目的序列(142bp)，仅适用于Roche公司的检测试剂盒。本发明突破内含RNA病毒的核酸序列长度限制，提供含多种检测方法所需的引物互补序列，具有广泛的应用价值。本发明提供的RNA病毒的核酸序列长度为150～1000bp，当所包装的片段长度大约1000bp，发现获得的病毒样颗粒在稀释105倍后，经RT-PCR扩增后，仍能够检测到，其浓度在1010水平，已经满足实际应用了。同时，在本发明在大量实验中发现总结了另一个所要解决的技术问题，就是提供一种具有内含RNA病毒的部分抗原之内含RNA病毒核酸的病毒样颗粒。该病毒样颗粒中内含的RNA病毒核酸为保守编码序列，序列长度在500～1000bp；本发明中优选的序列为含有HIV-1病毒gag区序列。上述病毒样颗粒的制备方法，该方法包含以下步骤构建质粒；设计RNA病毒引物序列；PCR扩增，酶切得到目的片段；与质粒连接，转化；病毒样颗粒的诱导与表达。pNCCL1构建方法及序列参见李金明等(中华检验医学杂志，2003，26(2)86-88)耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达一文；根据所构建载体的需要，在引物的上游引入限制性内切酶HindIII酶切位点(下划线部分)和保护性碱基，然后在Primer5.0软件上运行以匹配各引物的Tm值以及其它扩增参数，设计合成引物；接着进行目的片段的扩增纯化；酶切得到目的片段与质粒连接，转化；病毒样颗粒的诱导与表达。本发明得到的内含RNA病毒核酸的病毒样颗粒，可以作为构建和制备耐RNase的RNA病毒核酸标准品和质控品的平台。如可以直接作为RNA病毒核酸测定中的阳性质控物和外标定量测定的外标定量标准；可以为RNA病毒核酸RT-PCR检测试剂盒和实验室室间质量评价提供无生物传染危险性的样本。如果对内含RNA病毒核酸的病毒样颗粒中的RNA病毒核酸检测的目的片段进行缺失、插入和突变等修饰，所获得的病毒样颗粒可以作为RNA病毒核酸定量测定中的内标标准和RNA病毒核酸RT-PCR测定的内标质控物。在本发明中，RNA病毒核酸保守编码区的蛋白也被证实表达于病毒样颗粒上。表达有相应抗原的病毒样颗粒可以用作研究病毒与宿主细胞相互作用的模型，可以用来作为定向运输小分子药物、反义RNA的工具。此外，在病毒样颗粒表面表达有相应的抗原表位可以用来研究疫苗。使用内含特定RNA的病毒样颗粒做为RNA病毒检测的质控品和标准品，具有下述几个方面的优点(1)无生物传染危险性。(2)作为RNART-PCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性。由于这种病毒样颗粒具有耐RNase的特点，因此可以避免被无所不在的RNase所降解，而这种降解对于RNA病毒的RT-PCR检测来说是一个需要关注的问题。(3)对病原体内RNA有很好的模拟作用。由于表达产物为噬菌体样颗粒，具有很好的病毒颗粒模拟功能，因此，在核酸提取过程中，与标本中真正病毒核酸的提取过程有很好的相似性。图1、载体pNCCL1克隆/表达位点；图2、HIVTA克隆经HindIII酶切图谱；图3、pNCCL1-HIV经NcoI和HindIII酶切后的图谱图4、表达产物经RNA提取后分别进行逆转录和未经逆转录后进行PCR反应的电泳图谱；1，2，3，4，5，6分别为1∶10至1∶106稀释的表达产物经逆转录后PCR的电泳图谱，1-5号管都能扩增得到1000bp的条带。7，8，9，9，10，11为1-5号样本未经逆转录直接进行PCR反应后的电泳；图5、表达产物经DNaseI和RNaseA单酶或双酶消化后的电泳图谱1，2为表达产物4℃保存16h；337℃未加酶消化；4RNaseA消化；5DNaseI消化；6DNaseI和RNaseA双酶消化；图6、病毒样颗粒置于45℃，3d后的电泳图谱；图7、pNCCL1-HIV载体的克隆/表达位点；图8、P24抗原确认实验1，2，3，4为表达产物经western-blot后的条带，比对蛋白分子量标准，位于97KD分子量附近；图9、完整病毒样颗粒的验证；1，2，3，4，5，6带纹分别为表达产物原倍到1∶105的稀释系列，RNA提取后经逆转录进行PCR后的电泳图谱；7，8分别为P24抗原试剂盒所带的阴性血清，阳性质控血清。9-16条带分别为1-8号样本，RNA提取后未经逆转录就进行PCR的电泳图谱；图10、SARS-CovTA克隆载体经HindIII酶切电泳图谱；图11、表达载体PNCCL1-SARS-Cov经HindIII，NcoI酶切后的电泳图谱；图12、PNCCL1-SARS经NcoI，HindIII，XhoI酶切后的图谱；图13、表达产物经DnaseI和RNaseA单酶或双酶消化16h后的电泳图谱；图14、表达产物耐性实验的电泳图谱；图15、病毒样颗粒的电镜照片，显示结果正常。具体实施方式1、本发明实施例中选用的主要仪器如下PE2400PE5700ABI公司美国Line-Gene荧光定量PCR检测系统杭州大和热磁电子有限公司中国紫外投射分析仪北京仪城科技公司中国细胞破碎仪BransonsonicpowerCo.美国台式高速离心机OserodeHeraeusInsrument德国台式高速低温离心机BeckmanIInstruments美国D-型超纯水机USFELGARESERVOIR75L美国紫外分光光度计1601日本岛津公司日本酶标仪BIO-RAD公司美国DEM-III型自动酶标洗扳机北京拓普分析仪器公司中国HW-8B型微量恒温器上海浦江分析仪器厂中国SartoriusBP310S电子天平美国2、本发明实施例中选用的主要材料如下2.1生物材料菌株DH5αE.Coli.BL21-DE3E.Coli.(InvitrogenCorp.，U.S.A)质粒pNCCL1构建方法及序列参见李金明等(中华检验医学杂志，2003，26(2)86-88)耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达一文；HIVgag质粒，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心惠赠，该质粒上的gag基因由未经培养的HIV-1阳性外周血中直接扩增所得，该株为中国艾滋病毒E，B亚型代表株；P24单克隆抗体(华美公司购买)。SARS-CoVRNA，由中山达安公司惠赠。来源于SARS爆发期间病人样本。SARS相关的新型冠状病毒核酸扩增荧光检测试剂盒中山大学达安基因诊断中心提供2.2工具酶TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、RQ1脱氧核糖核酸酶1、核糖核酸酶(RNaseA)、限制性内切酶XhoI、HindIII，购自Promega公司(美国)；NcoI购自NewEngland公司(美国)；2.3细菌培养与菌种保存2.3.1细菌培养(1)固体培养基培养用取菌环取菌种，在固体培养基上进行划线接种，二氧化碳培养箱内37℃倒置培养过夜。(2)液体培养基培养用取菌环挑取单个菌落接种于5ml液体培养基内，置摇床37℃，140-180rpm摇菌过夜。2.3.2菌种保存(1)固体培养基菌种保存单个菌落在固体培养基上可以保存数月。(2)液体培养基菌种保存将新鲜菌液加入15％甘油，置于-70℃冰箱或液氮罐中长期保存。2.3.3质粒提取小量碱裂解法提取质粒(一般用于酶切验证)将单个菌落接种于5ml含有适当抗生素的LB培养基内(氨苄青霉素浓度为50μg/ml，卡那霉素浓度为30μg/ml)，37℃摇菌过夜。取1.5ml培养物转入微量离心管内，12,000g离心30s，沉淀细菌，尽量弃去上清，加入STE混匀，洗涤细菌，以去除细菌代谢产物，4℃，12,000g离心30s。具体方法参见《分子克隆》，最后产物加入TE缓冲液溶解质粒DNA，可以长期储存于-20℃。2.3.4质粒DNA中RNA的消化RNA初步消化在质粒提取过程中，将质粒DNA进行沉淀之前，加入10-20μg/mlRNaseA37℃温浴15-20分钟，可以将质粒DNA中的大部分RNA消化这种粗消化的质粒DNA有多种用途，比如限制性内切酶的初步消化，鉴定，目的片段的扩增等等。RNA消化向DNA溶液中加入20μg/mlRNaseA在37℃温浴15-30分钟。也可以在TE缓冲液中加入一定浓度的RNaseA，本研究中采用的浓度为10-20μg/ml。2.3.5质粒浓度的确定利用紫外分光光度计比色对纯化后的质粒DNA定量，测定260nm，280nm时的吸光度并计算两者的比值。根据OD260/OD280的比值可以推算所得到的DNA样本中DNA的纯度，纯度的比值应该大于或者等于1.8。根据260nm吸光度(比色杯的厚度为1.0cm)推算出质粒DNA浓度，所用的公式为A×50＝DNA的浓度值(μg/ml)。实施例1内含HIV-1病毒核酸956bp的病毒样颗粒的制备本发明所制备的病毒样颗粒所含的HIV核酸片段，含有10种检测HIVRT-PCR试剂盒所扩增的片段，为针对HIV的定量PCR所扩增的区域，本发明发现片段集中在HIV基因组gag区1-956nt。如引物15’-GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC3’-AGCCGAGCAAGCTTCACAGGAGGTAAAA所扩增的长度为525bp本发明所用的HIVgag质粒，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心惠赠，该质粒上的gag基因由未经培养的HIV-1阳性外周血中直接扩增所得，该株为中国艾滋病毒E，B亚型代表株CN54株；在MEDLINE网上搜索该株序列，利用引物设计软件Primer5.0，设计扩增HIV基因组gag区1-956nt，包括所需要的目的片段，同时还含有HIVgag区编码蛋白的起始密码子Met。引物分别为正义引物5’-AGAAGCTTATGGGTGCGAGAGCGT-3’；反义引物5’-ATAAGCCTTGGACCAACAAGGTGTCTGTC-3’。并根据所构建载体的需要，在引物的上游引入限制性内切酶HindIII酶切位点(下划线部分)和保护性碱基，然后在Primer5.0软件上运行以匹配各引物的Tm值以及其它扩增参数，并由北京赛百胜公司合成，合成引物为冻干DNA，用无菌去离子水(ddH2O)溶解至使用浓度10umol/l，-20℃保存。1.1目的片段的扩增反应体系如下gag质粒1.0μldNTP混和物1.0μl10×扩增缓冲液5.0μl10umol/l上游引物1.0μl10umol/l下游引物1.0μlTaq聚合酶0.4μl25mmol/lMg2+3.0μl加ddH2O补足至50μl反应条件94℃，3min预变性；94℃45s；56℃45s；72℃2.0min；30个循环后72℃延伸5min。取5μlPCR产物进行1.4％琼脂糖凝胶电泳观察。1.2PCR产物的纯化(1)将PCR产物进行电泳，用干净的刀片切取含目的条带的胶块，胶块要尽量小并尽量多含目的片段，放入1.5ml离心管中。称量该胶的重量，尽量不超过150mg。不足100mg的加入ddH2O补至100mg。(2)按1mg相当于1μl换算，以溶胶液∶胶重量比为3∶1的比例加入溶胶液。置50℃水浴10min，每2min振摇一次，使胶完全熔化。将混合液转移至套在干净接液管上的离心柱内，12,000g，离心1min。(3)弃去接液管中的液体，重新插入离心柱。在离心柱上加洗柱液750μl，12,000g，离心30s。(4)加洗柱液250μl，重复步骤3。(5)将离心柱转移到干净的接液管上，空柱离心12,000g，2min。(6)重复步骤5。(7)将离心柱转移到干净的接液管上，加入60℃-70℃预热的ddH2O30μl室温放置1min，离心1min。所得溶液为回收的DNA溶液。1.3限制性内切酶对质粒DNA的消化本发明需要对TA克隆载体pBS-T，表达载体pNCCL1进行酶切，其中表达载体pNCCL1的克隆/表达位点如图1所示。本发明所用的限制性内切酶为HindIII，XhoI和NcoI三种酶，各酶切条件如表1，2所示表1、Promega公司HindIII和XhoI酶切在不同缓冲液中的活性ABCDEMULTI-CORETMHindIII25-50％100％75-100％10-25％100％50-75％XhoI25-50％75-100％75-100％100％10-25％表2、NEB公司的NcoI在不同缓冲液中的活性NEBbuffer1234％Activity100％100％100％100％根据上述酶切缓冲液的条件，经验证，当采用单酶切时，各酶选用的缓冲液分别为HindIII为BufferE，XhoI为BufferD；当HindIII，Nco1双酶切或HindIII，XhoI，Nco1三酶切时，采用的为BufferB(单独购自华美公司分装的BufferB)；上述酶切体系为40μl，如下所示HindIIIBufferE4.0μl，HindIII4.0μl，BSA0.4μl，底物DNA31.6μl；XhoIBufferD4.0μl，XhoI4.0μl，BSA0.4μl，底物DNA31.6μl；HindIII，NcoI双酶切BufferB4.0μl，HindIII2.0μl，XhoI2.0μl，BSA0.4μl，底物DNA31.6μl；HindIII，XhoI，NcoI三酶切BufferB4.0μl，HindIII2.0μl，XhoI2.0μl，NcoIBSA0.4μl，底物DNA29.6μl；酶切时间根据目的不同，实际操作中也有所不同若从TA克隆载体上获得酶切目的片段，需要酶切过夜；若仅对克隆后的载体进行酶切鉴定，酶切2-4小时即可；连接用表达载体pNCCL1需要酶切过夜。上述各体系的酶切温度均为37℃。1.4目的片段DNA和TA克隆载体pBS-T或表达载体pNCCL1的连接，转化及鉴定。1.4.1目的片段DNA和TA克隆载体pBS-T的连接，转化及鉴定连接本发明采用天为时代的TA克隆试剂盒，连接体系如下pBS-T载体1.0μl，目的片段7.0μl，T4连接酶1.0μl，T4连接酶缓冲液1.0μl。连接1h。转化从-70℃冰箱中取出克隆宿主感受态菌DH5a后，用手握化后置于冰浴10min。(1)将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需25ngDNA)，体积不应超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min。(2)将管放入预加温至42℃水浴放置90秒，不要摇动离心管。(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。(4)每管加400μlSOC培养基，放置水浴箱使培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。(5)将适当体积的已转化的感受态细胞转移到已经含Amp抗生素的平板上。平板在涂布菌液之前，需要加入100μlX-gal，20μlIPTG，完全混匀后涂于平板上。(6)将平板置于室温直至液体完全被吸收。(7)倒置平皿，于37℃培养12-16小时。转化后的平板，蓝白斑比例一般需要在1∶5到2∶1之间。鉴定挑取白斑接种于5mlAmp+LB培养基的50ml的培养管中，37℃，250rpm/min，培养6-8h后，提取质粒。用HindIII进行酶切，根据酶切后电泳图谱进行鉴定，电泳后可见1000bp的目的片段带。酶切电泳图谱如图2所示。1.4.2目的片段DNA和表达载体pNCCL1的连接，转化及鉴定目的片段来自于1.2，将TA克隆成功后的阳性菌落增菌后提取质粒，用HindIII进行酶切，琼脂糖电泳后切胶回收目的片段，所得DNA片段即为HindIII完全酶切的目的片段。表达载体pNCCL1的酶切根据步骤1.4所示进行纯化。在连接前，对酶切后的目的片段DNA和酶切后的表达载体pNCCL1电泳进行粗略定量，在两条带亮度相当时，按以下体系进行连接目的片段7.0μl，质粒PNCCL11.0μl，T4DNA连接酶1.0μl，T4连接酶缓冲液1.0μl。4℃连接过夜。按步骤2.6.1操作转化表达宿主菌BL21-DE3。不采用蓝白斑筛选，而是应用与扩增目的片段一样的反应条件挑菌进行PCR初筛，并设阳性菌对照。出现与目的片段大小一致，且目的带非常亮的定为初筛阳性，取质粒并用限制性内切酶HindIII，NcoI对质粒进行酶切，得到1000bp，1700bp，及5200bp的带，如图3所示。阳性重组子测序结果经PubMed网上，Blast后发现，重组质粒中的插入片段与MS2和HIV的基因序列相一致(一致率100％)，未出现MS2读码框架的移码现象，从而确定最终的阳性菌。1.5病毒样颗粒的诱导与表达将1.4中所得的阳性菌接种于2ml含Kana+抗性的LB液体培养基中，37℃，130-180rpm/min摇菌过夜培养。然后取100μl过夜培养的菌液(处于对数生长期)接种于10ml含Kana+抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm/min摇菌1.5h，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，使IPTG的终浓度为1mM/ml。诱导表达16小时，进行超声碎菌处理用1.5ml离心管取1.5ml菌液于4℃14,000r/min离心2min收集细菌，PBS洗涤三次后，加入0.25ml超声处理缓冲液重悬细菌沉淀。用超声细胞破碎仪小型超声处理探针破碎细菌，然后将细菌破碎物置冰浴1min。重复上述破碎过程5-6次。将细菌破碎物4℃，14,000r/min离心2min，取上清转移到另一干净离心管中，得到本发明的含有HIV-1病毒核酸的病毒样颗粒。实施例2、内含HIV-1病毒核酸500bp的病毒样颗粒制备本发明所制备的病毒样颗粒所含的HIV核酸片段，含有5种检测HIVRT-PCR试剂盒所扩增的片段，为针对HIV的定量PCR所扩增的区域为HIV基因组gag区1-500nt。其他步骤同实施例1。实施例3、病毒样颗粒内含病毒RNA的鉴定实施例所得产物经逆转录和未做逆转录后进行PCR反应电泳结果如图4所示；实验结果显示，经逆转录过程的稀释系列，能够扩增出目的片段；而未经逆转录直接进行PCR扩增的稀释系列，未能扩增出目的片段，证明VLPs内包装的核酸为RNA而非DNA。实施例4、HIV-1病毒核酸的病毒样颗粒耐RNase的鉴定将实施例1中的PNCCL1-HIV经转化宿主菌表达并超声处理所获得的噬菌体样颗粒，分别进行RNaseA(100U)消化、DNaseI(20U)消化、RNaseA(100U)和DNaseI(20U)双酶联合消化，未加DNaseI和RNaseA37℃消化以及4℃保存的未经两种酶消化，然后将三种酶消化产物和未进行酶消化的表达产物一同电泳，电泳结果(图5)显示三种酶消化产物电泳图谱各不相同，双酶消化后产物电泳只有一条1000bp左右的带纹。实施例5、HIV-1病毒核酸的病毒样颗粒稳定性的鉴定取步骤实施例1中得到的表达产物400μl，加入PEG600/NaCl100μl(v/v20％)，4℃，15000rpm/min离心1h，加入正常人阴性血清500μl。各取50μl分别置于四个Eppendorf管中，45℃，3d。电泳观察表达产物中病毒样颗粒的稳定性。对超声碎菌所得到的表达产物，按1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000，1∶1000000比例进行稀释后，各管分别加RNaseA和DNaseI双酶联合消化24h后，加入4M异硫氰酸胍盐，1％的肌醇溶液终止酶切反应。依照异硫氰酸胍盐提取RNA的方法进行样本RNA提取，方法如下(1)加入150μl裂解液(4mol/LGuSCN，25mmol/l柠檬酸钠pH7.0，0.5％肌醇，100mmol/Lβ-巯基乙醇)，加入50μl样本，混匀后加入50μl氯仿。(2)4℃，13000rpm离心15min。(3)取与步骤(1)中相同数量的0.5ml灭菌离心管，加入100μl异丙醇，作好标记。吸取步骤(2)中的上层液相转移至相应的管中(不要碰到中间层，该层富含DNA和蛋白质)，颠倒混匀。(4)4℃，13000rpm离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入300μl75％乙醇，颠倒洗涤。(5)4℃，13000rpm离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；(6)离心5sec，将管底部少量液体用微量加样器吸干。65℃烘箱烘干，但尽量避免过于干燥。(7)加入25μlddH2O溶解RNA，-20℃保存。然后进行RT-PCR以引物5’-ATAAGCTTGGACCAACAAGGTGTCTGTC-3’为逆转录引物，按以下体系进行逆转录取上述步骤(7)中的RNA溶液15.0μl；AMVbuffer，4.0μl；10mmol/l四种dNTP混合溶液，2.5μl；10umol/l引物，0.01μl；9U/μl逆转录酶(AMV)，2.0μl；25mmol/lMg2+，1.0μl。42℃温育1h后，93℃3min灭活逆转录酶。再按步骤3中的扩增条件进行扩增。为验证扩增反应确为RNA所致，以不进行逆转录而直接进行PCR扩增的反应管作为对照。1.4％琼脂糖水平电泳验证扩增产物。电泳图谱如图6所示，仍然发现1000bp的亮带。证明病毒样颗粒稳定性良好。实施例6、病毒样颗粒表面所含蛋白的鉴定新构建成功的表达载体pNCCL1-HIV的克隆位点如图7所示如上图所示内切酶Nco1中出现起始密码子ATG，恰好为MS2蛋白的起始密码子。插入的MS2序列加上前后的HindIII位点，共1690nt。在HindIII位点前的第3个氨基酸编码子，刚好为MS2噬菌体复制酶的起始密码子ATG，距离插入的gag区的起始密码子ATG刚好15个碱基，故没有移码突变。所以使得gag蛋白得到表达。在HIV-1病毒中，gag蛋白是P7，P17，P24的前体蛋白。因此只要验证gag蛋白中的任何一种蛋白存在，即可证明gag蛋白没有移码突变并得到完整表达。6.1P24蛋白的初步鉴定应用MurexHIVAntigenMabVK868E77-01(P24抗原检测试剂盒)来进行初步鉴定。将步骤2.8所得到的病毒样颗粒分别按1∶10，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800；1∶1600系列进行稀释，然后将稀释系列样本按试剂盒说明书进行鉴定6.1.2P24蛋白的初步鉴定步骤(1)每孔加入100μl工作液1，再分别加入100μl样本或阴阳性质控。(2)避光，37℃孵育60min；洗板5次。(3)加入连接200μl工作液2。(4)避光，37℃孵育30min；洗板5次。(5)每孔加入200μl底物溶液。(6)室温(15℃-30℃)孵育30min。(7)每孔加入50μl1-2mol/l的硫酸溶液以终止反应，并轻轻摇匀。(8)5-15min内，在450nm波长下读取吸光度。6.1.3病毒样颗粒的电镜照片(图15)显示结构正常。6.1.4P24蛋白的初步鉴定结果结果如表3、4表3、表达产物倍比稀释后做P24初步鉴定样本阳性阴性阴性空菌对照空菌对照1∶501∶10原倍OD值0.9890.0250.0060.5890.600OverOverOver表4、表达产物倍比稀释后做P24初步鉴定样本阳性阴性空菌对照1∶16001∶8001∶4001∶2001∶100OD值0.5070.0050.0050.2930.5580.9851.1621.816由上述表格可以看出，当表达产物做1∶800稀释后，仍呈阳性反应，HIV-1P24抗原初步鉴定结果为阳性，且表达量在μg/ml水平以上。6.2通过Western-blot做P24抗原的确认实验鉴定(1)依步骤3.1超声碎菌得到表达产物。(2)蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳安装玻璃板，配制12％分离胶，小心注入玻璃板间隙内，上覆水层，隔离空气，室温聚合1-2h。倾去覆盖物，吸水纸吸干残留液体，配制5％浓缩胶，注入分离胶上端，小心插入梳子，避免气泡产生，室温聚合30min。将上步提取的样品与上样缓冲液混合，100℃加热3min，上样，100V恒压电泳至溴酚兰抵达分离胶底部。(3)转膜蒸馏水清洗石墨板，擦干后，戴手套，剪6张3M滤纸和1张硝酸纤维素膜。滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或小于凝胶。把硝酸纤维素膜漂浮于一盘去离子水的水面上，借毛细作用使膜从下往上润湿后将膜完全浸没于水中。浸泡5min以除去滤膜上残留的气泡并水化。在一平皿中加入少量的转移缓冲液，把6张滤纸浸泡于其中。平放石墨电极的底座(+)，在石墨上放置3张经转移缓冲液浸泡过的滤纸，对齐后用一玻璃棒在滤纸面上滚动，以排除气泡。然后把硝酸纤维素膜放在滤纸上，要保证精确对齐避免在滤纸与硝酸纤维素膜之间留有气泡。把凝胶移至去离子水中，略微漂洗一下，然后准确平放于硝酸纤维素膜上，并排除气泡。把另一组的3张滤纸放在凝胶上方，同样确保各层精确对齐并避免气泡。将转移电泳槽上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上。连接电源，0.6-1.0mA/cm2，接通电流，恒流电转2h。(4)抗原抗体反应a.将做好标记的转印后的硝酸纤维素膜经PBST漂洗后，加入适当的封闭液中，4℃过夜。b.将硝酸纤维素膜转移到用封闭液稀释至适当浓度的多抗血清或单抗腹水的稀释液中，室温振荡1h。c.用PBST洗膜5次，加入以PBST缓冲液1∶30000稀释的HRP-羊抗鼠或抗兔IgG，室温振荡1h。PBST洗膜5次，每次15min，然后再洗膜4次，每5min，充分洗膜将降低背景。d.将膜上多余的液体控干，放在一块保鲜膜上，将等体积的luminal/enhancersolution和stableperoxidesolution混合，倒在膜的蛋白面上，室温孵育5min。e.控干膜上多余的检测试剂，用保鲜膜包好，将膜蛋白面向上放在片盒中，压片，曝光1min，洗片，在此基础上决定下一张片子的压片时间。(5)结果应用P24单克隆抗体作一抗，酶标羊抗人IgG为二抗。结果如图8与蛋白分子量Marker比对后发现，该带位于97KD蛋白分子量标记物附近。由于我们插入的片段核酸数为MS2(1690)插入片段与HIV(956)插入片段之和，根据公式估计表达蛋白的分子量110×(1690+956)/3＝97,020道尔顿。实验结果证明病毒样颗粒表面的MS2噬菌体衣壳蛋白，成熟酶蛋白，HIV-1的gag蛋白是融合在一起的。6.3衣壳蛋白，gag蛋白与核酸RNA形成完整病毒样颗粒的鉴定原理MurexHIVAntigenMabVK868E77-01(P24抗原检测试剂盒)中的酶标板经HIV-1P24抗原多克隆抗体包被，将表达产物与多克隆抗体共温浴1h，使P24多克隆抗体与病毒样颗粒表面的P24抗原相结合。洗板10次去除其他物质，加入100mmol/l的甘氨酸(pH3.0)洗脱抗原抗体的结合。然后采用“异硫氰酸胍结合酚-氯仿法”提取RNA的方法提取病毒样颗粒的核酸RNA。经RT-PCR反应，检测核酸中是否有HIV-1gag区的RNA，以未逆转录管做对照。6.3.1具体步骤(1)将表达产物按1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000，进行稀释后，分别标记为2-6管，原倍表达产物标记为1号管MurexHIVAntigenMabVK868E77-01试剂盒中的阴性对照，阳性对照分别标记为7号，8号。(2)在每孔中加入100μl工作液1，再分别加入100μl样本或阴阳性质控。(3)避光，37℃孵育60min；洗板10次。(4)加入100mmol/l的甘氨酸(pH3.0)洗脱1min。(5)加入PEG6000，4℃沉淀3h，4℃，12,000rpm离心15min弃上清。(6)加入50μlTE(pH8.0)，将沉淀溶解。(7)参照步骤2.9.1中异硫氰酸胍结合酚-氯仿法”提取RNA的方法提取病毒样颗粒的核酸RNA。(8)逆转录体系和条件参照步骤实施例3。(9)PCR扩增，条件和体系参照实施例1，每份样本设未逆转录管做对照。(10)将扩增产物进行1.4％琼脂糖凝胶电泳。6.3.2结果结果如图9，由于在免疫吸附后经过十次洗板，如果P24不是融合在病毒样颗粒上而是游离，则不会将病毒样颗粒吸附在96孔板上。因此，证明病毒样颗粒中含有P24抗原。实施例7、内含SARS冠状病毒核酸的病毒样颗粒的构建与表达1.引物设计扩增SARS-CoVRNA基因组部分序列(CHUK10，18026-18327)的引物对，该对引物扩增区域为WHO公布的七对引物(PCRprimersforSARSdevelopedbyWHOnetworklaboratories.GenevaWorldHealth.Organization，2003.AccessedApril17athttp//www.who.int/csr/sars/primers/en/)所在两大主要区域之一，目前国内外试剂盒扩增检测的片段多在此区域内(吴新伟，程钢，狄飚等，中华检验医学杂志，2003，26(5)300-302)。在上、下游引物5’端分别引入HindIII酶切位点(下划线部分)，合成带酶切位点的引物上游引物，5’-AGAAGCTTACCTACACACCTCAGCGTTG-3’；下游引物，5’-ATAAGCTTTAACCAGTCGGTACAGCTAC-3’；然后，在Primer5.0软件上运行以匹配各引物的Tm值以及其它扩增参数，并由北京赛百胜公司合成。2.SARS基因组目的片段的PCR扩增，TA克隆及酶切产物纯化同实施例1利用下游引物逆转录SARS-CovRNA，热启动法进行PCR扩增，94℃45s；53℃45s；72℃1.0min；30个循环后延伸5min。2.0％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。切取目的条带，胶回收后进行TA克隆，蓝白斑筛选后提取质粒并用限制性内切酶HindIII酶切，1.6％琼脂糖凝胶电泳后再切胶回收得到目的片段。挑选白斑接种培养Amp+的LB培养基，提取质粒进行HindIII酶切，电泳后可见300bp的目的片段带，如图10。3.表达载体PNCCL1-SARS-CoV质粒的构建用HindIII对PNCCL1质粒进行酶切，所得到的酶切产物直接用DNA纯化试剂盒进行纯化。琼脂糖凝胶电泳做粗略定量。按以下连接体系进行连接目的片段7μl，质粒1μl，T4DNA连接酶1μl，T4连接酶缓冲液1μl。4℃连接过夜。转化细菌BL21-DE3E.Coli，挑菌培养，提取质粒，用XhoI酶切，切下1000bp片段的定为阳性克隆。将阳性重组子送上海生工公司进行测序，并确定插入片段的顺反方向。表达载体PNCCL1的克隆/表达位点如图1所示。用构建的表达载体PNCCL1-SARS-CoV转化细菌培养过夜，提取质粒并用限制性内切酶HindIII，Nco1酶切，电泳图谱如图11所示。用限制性内切酶Xho1，HindIII，Nco1对质粒进行酶切，得到300bp，721bp，970bp及5200bp的电泳条带，如图12所示。阳性重组子测序结果经PubmedBlast后表明，重组质粒中的插入片段与MS2和SARS-CoV的基因序列相一致(一致率100％)。4.内含SARS-CoV部分RNA序列的耐RNase的病毒样颗粒的原核表达及获得接种1ml含卡那霉素的LB液体培养基，200rm/min振荡培养过夜，取培养液50μl接种5ml卡那霉素抗性培养基，200rm/min振荡培养1.5小时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，使IPTG的终浓度达到1mM/ml，诱导表达16小时，进行超声碎菌。即用1.5ml离心管取1.5ml菌液，4℃，14,000r/min离心2min收集细菌，用0.25ml超声处理缓冲液重悬细菌沉淀。用超声细胞破碎仪小型超声处理探针破碎细菌，然后将细菌破碎物置冰浴1min。重复上述破碎过程5-6次。将细菌破碎物4℃，14,000r/min离心2min，取上清转移到另一干净离心管中。PNCCL1-SARS-Cov经转化宿主菌表达并超声处理所获得的噬菌体样颗粒，分别经RNaseA消化、DNaseI消化、RNaseA和DNaseI双酶联合消化，未加DNaseI和RNaseA37℃孵育以及不加两种酶4℃保存的噬菌体样颗粒，然后将三种酶的消化产物和未经酶消化的表达产物一同电泳，电泳结果显示三种酶消化产物电泳图谱各不相同，双酶消化样本只有一条1000bp左右的带纹，如图13所示。5.表达产物的鉴定取3份20μl表达产物分别进行100URNaseA和2UDNaseI单酶及双酶37℃消化40min，将消化的表达产物以及未消化的表达产物分别电泳，观察比较未消化、各单酶消化以及双酶消化后的电泳图谱。同时对表达产物进行耐性实验取四管表达产物各20μl，加入100-200U的DNaseI，100URNaseA，37℃温育4d；4℃保存，4d的表达产物两管；室温放置4d的一管；以及三管经过如下处理的样本表达产物各20μl，加入DNaseI100-200U，RNaseA100U，37℃温育24h，经95℃，5min热裂解将包膜破坏释放出RNA。在热裂解后立即与上述几种标本同时进行电泳.表达产物用RNaseA消化、DNaseI消化、RNaseA和DNaseI双酶联合消化24h后，加入4M异硫氰酸胍盐，1％的肌醇溶液终止酶切反应，用达安公司开发的SARS-CovRNA荧光RT-PCR试剂盒检测，操作按试剂盒说明书进行。该试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒，引物为PF，5’-CGGCAAAATGAAAGAGCTCA-3’；PR，5’-CGCCGTAGGGAAGTGAAGCT-3’；探针序列为5’-CCCAGATGGTACTTCTATTACCTA-3’，反应条件为93℃2min预变性，然后93℃15s，55℃15s，72℃20s，10个循环；然后93℃15s，58℃30s，30个循环。扩增序列84bp(18164-18247，CHUK-10)。为验证扩增反应确为RNA所致，以不进行逆转录而直接进行PCR扩增的反应管作为对照。表达产物耐性实验取四管表达产物各20μl，加入100-200U的DNaseI，100URNaseA，37℃温育4d。表达产物耐性实验的电泳图谱如图14所示用达安试剂盒进行验证，结果均呈阳性，病毒样颗粒的浓度大于1010拷贝/ml。一管耐RNase表达产物经过DNaseI和RNaseA酶切之后，分成两份，分别进行RNA提取，一份经过逆转录反应后进行PCR扩增，另一份则不经逆转录反应而直接进行PCR扩增，结果显示不进行逆转录反应管，扩增结果呈阴性；而进行逆转录反应管，扩增结果呈强阳性。说明表达产物确含SARS-CoVRNA。权利要求1.内含RNA病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于该病毒样颗粒耐RNase，含有外壳蛋白以及包含在内的重组基因序列MS2噬菌体的成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因序列、包装位点基因序列、裂解蛋白和复制酶的起始位点基因序列、RNA病毒核酸序列。2.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有的重组基因序列中的RNA病毒核酸序列长度为150～1000bp。3.如权利要求1或2所述的病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有的重组基因序列中的RNA病毒核酸序列为丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒或严重急性呼吸综合征冠状病毒的核酸序列。4.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于该病毒样颗粒含有外壳蛋白、内含RNA病毒的部分抗原以及包含在内的重组基因序列MS2噬菌体的成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因序列、包装位点基因序列、裂解蛋白和复制酶的起始位点基因序列、RNA病毒核酸保守编码序列。5.如权利要求4所述的病毒样颗粒，其特征在于该病毒样颗粒含有HIV-1病毒的部分抗原，包含在内的重组基因序列中的RNA病毒核酸保守编码序列为500～1000bp，且含有gag区序列。6.如权利要求1～5之任一所述的病毒样颗粒的应用是作为RNA病毒核酸测定中的阳性质控物和RNA病毒外标定量测定的外标定量标准系列的应用。7.如权利要求1～5之任一所述的病毒样颗粒的应用是作为RNA病毒RT-PCR检测试剂盒和实验室室间质量评价提供无生物传染危险性的样本的应用。8.如权利要求1～5之任一所述的病毒样颗粒的应用是作为RNA病毒定量测定中的内标标准和RNA病毒RT-PCR测定的内标质控物的应用。9.如权利要求5所述的病毒样颗粒的应用是作为用作研究病毒与宿主细胞相互作用的模型，用来作为定向运输小分子药物、反义RNA的工具，在病毒样颗粒表面表达有相应的抗原表位用来研究疫苗的应用。10.如权利要求1～5之任一所述的病毒样颗粒的制备方法，该方法包含以下步骤构建质粒；设计RNA病毒引物序列；PCR扩增，酶切得到目的片段；与质粒连接，转化；病毒样颗粒的诱导与表达。全文摘要本发明属于病毒基因工程领域，具体是一种内含RNA病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法与应用。该病毒样颗粒耐RNase，含有外壳蛋白以及包含在内的重组基因序列MS文档编号C12Q1/68GK1587420SQ20041006936公开日2005年3月2日申请日期2004年7月20日优先权日2004年7月20日发明者李金明,王忠芳,王露楠,彭建明,邓巍申请人:卫生部北京医院