专利名称：温敏型聚n－异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法
技术领域：
本发明涉及一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法。
背景技术：
基因工程产品产业化过程中往往面临这样一个难题表达出的产物通常是以没有生物活性的聚集体形式存在的。如何使蛋白质高效地重折叠成具有天然构象的活性蛋白质，是决定该基因工程蛋白质能否产业化和为人类所利用的关键。这就使得对于蛋白质体外复性技术的研究成为近年来的研究热点。但由于蛋白质的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人们不能对一种复性方法进行简单的移植，也很难找到具有普适性而又低成本的高效复性方法。因此实际操作过程中必须针对每种目标蛋白质的特点，对影响复性的各个因素逐一优化，才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法。
蛋白质复性方法中的许多问题依然困扰着我们，如蛋白质活性回收率低、复性起始和终了的蛋白质浓度偏低等。目前出现的一些能够对高浓度蛋白质进行高效复性的方法如色谱复性等，往往因为设备及材料投入成本高而在工业化生产中难以得到大规模应用。常规的能够协助蛋白质复性的添加剂如分子伴侣、小分子伴侣、聚乙二醇、L-精氨酸、去污剂和表面活性剂以及人工分子伴侣等，对设备要求不高，同时能够在一定程度上提高复性收率。但是一方面如分子伴侣、小分子伴侣等价格偏高，质粒表达后还需对发酵工艺进行优化，工作量较大，成本偏高；另一方面如聚乙二醇、L-精氨酸、去污剂和表面活性剂以及人工分子伴侣等，复性结束后存在难于与目标蛋白质分离的问题。在这种情况下，开发出一种新型、高效、易于分离回收而又低成本的蛋白质体外复性添加剂就显得尤为重要。近年来功能高聚物作为一种新型的协助蛋白质体外复性的添加剂越来越引起人们的重视，其主要优点在于影响复性的参数较少、操作方便、仪器设备要求较低且易于分离回收。
Shimizu等(参见Colloids and Surfaces BBiointerfaces，18，2002，p137-144)采用反相悬浮法合成了Poly(styrene-co-glycidyl metharrylate)(SG)微球，再通过化学反应在微球体表面分别连接上巯基或二硫键等功能基团，这样就可以使处于去折叠态且疏水基团大量外露的变性目标蛋白质方便地吸附到微球体表面，在抑制蛋白质相互聚集沉淀的同时，随着二硫键的正确配对而缓慢折叠。通过该方法可以使溶菌酶的复性收率在稀释复性的基础上提高40％。但是该法制备步骤较繁琐，且得到的微球仅限于协助含有较多巯基或二硫键的蛋白质的体外复性。Lin等(参见Biotechnology and Bioengineering，67(5)，2000，p505-511)尝试了用一种具有一定疏水作用的非离子型聚合物-未交联的的线性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺poly(N-isopropyl acrylamide)(PNIPA)，协助β-内酰胺酶的复性，PNIPA的加入使得复性后酶的活性提高了40％。但是采用该线性聚合物作为添加剂协助复性时，复性后需先通过加热的方式使液态PNIPA从水溶液中析出，再通过一步离心才能实现复性后目标蛋白质与PNIPA水溶性聚合物的分离，且容易造成聚合物与蛋白质水溶液界面附近蛋白质的损失，操作相对麻烦。考虑到经交联后合成的PNIPA水凝胶在水溶液中也会具有线性PNIPA聚合物所具有的疏水特性，从而也应该具有协助蛋白质体外复性的特性。复性结束后利用其温度响应特性，可通过在水中反复溶胀(低于其临界溶解温度LCST)和缩水(高于LCST)的方法使凝胶快速而便捷地再生，将会使复性操作变得更加简单。这样与其它可以协助复性的添加剂相比，采用PNIPA温敏性凝胶协助蛋白质体外复性，在简化复性操作的同时，复性后可方便地实现凝胶与目标蛋白质的分离。由于凝胶具有可迅速回收的特性，大大降低了复性成本。目前还未见粒状PNIPA凝胶协助蛋白质体外复性的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法。
方法的步骤如下1)配制聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶反应物的水溶液将单体N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺以及氧化剂过硫酸铵，其中单体与交联剂浓度为5-15％(w/w)、交联度为1-10％(w/w)、过硫酸铵浓度为0.1-0.7％(w/v)，溶于25mL去离子水中，用微滤膜过滤溶液以除去未溶解的杂质；2)反相悬浮法制备温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶先向反应容器中加入75mL液体石蜡作为分散相，37.5-150mg Tween80作为表面活性剂，充分分散后加入步骤1)反应物的水溶液，搅拌后加入1μL N，N，N’，N’-四甲基乙二胺作为加速剂引发聚合，聚合温度20-25℃，机械搅拌速度为350-450rpm，聚合3-4h，整个过程均需向反应容器中通入N2，得到粒状聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶，用1-5体积比率的无水乙醇/水溶液洗涤该凝胶，将凝胶于真空干燥箱中50-70℃烘干24-36h；3)温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性称取5-20mg/mL溶菌酶试剂溶于变性缓冲液中，置于摇床中反应，即可获得无活性的伸展态的溶菌酶溶液，取0.05-0.25mL该溶液，缓慢加入复性缓冲液，稀释到终体积均为5mL，再向溶液中加入20-120mg/mL的粒状PNIPA凝胶，充分震荡使其分散均匀后，于4-36℃、0-180rpm摇床中复性2-5小时。
本发明在制备工艺上采取“反相悬浮法”，制备得到的PNIPA凝胶平均粒径为0.3mm，分布于0.2-0.5mm的较窄区域，且基本呈正态分布。该凝胶具有合适的低临界溶解温度(LCST，33℃)，同时其表面直径为1-2μm的多孔孔洞间相通，从而具有快速的温度响应特性，达到溶胀及缩水平衡仅需3分钟。在协助溶菌酶复性时，伸展态溶菌酶可以自由而快速地与凝胶侧链上的疏水基团异丙基发生疏水相互作用，从而抑制蛋白质间的相互聚集，可使溶菌酶的活力回收率比稀释复性提高68％以上，凝胶重复利用8次后溶菌酶的活力回收率仍比稀释复性提高22％以上。因此，所开发的PNIPA粒状凝胶可以作为蛋白质体外复性的添加剂。本发明的优点在于1)制备工艺简单，易于控制和放大；2)制备的PNIPA粒状凝胶在水中能够充分溶胀的同时，还具有一定的疏水性能，从而可以抑制蛋白质复性过程中的聚集趋势。PNIPA粒状凝胶协助溶菌酶复性时，可使溶菌酶的比活及活力回收率均得到较大的提高；3)该法复性操作简单，对仪器及设备的要求低；4)影响复性的参数少，易于操作；5)与常规凝胶相比，利用其温敏特性，该凝胶易于回收利用，从而可以降低生产成本。
图1是本发明不同组成温敏型PNIPA凝胶协助溶菌酶复性效果图，图中溶菌酶浓度10mg/mL，PNIPA凝胶加入量80mg/mL；图2是本发明温敏型PNIPA凝胶于不同稀释倍数下协助溶菌酶复性效果图，图中溶菌酶浓度10mg/mL，PNIPA凝胶加入量80mg/mL。
具体实施例方式
本发明采用温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPA)凝胶协助溶菌酶体外复性。步骤包括温敏型PNIPA凝胶的制备和PNIPA凝胶协助溶菌酶复性过程。为实现该过程，首先配制反应物水溶液，将单体N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺以及氧化剂过硫酸铵溶于去离子水中，用微滤膜过滤溶液以除去未溶解的杂质；然后采用反相悬浮法制备温敏型PNIPA凝胶，向容器中加入液体石蜡和Tween80，充分分散后加入反应物的水溶液，形成均一、稳定的油包水反相悬浮分散体系，缓慢加入加速剂TEMED引发聚合，将得到的粒状凝胶经反复洗涤后，于真空干燥箱中烘干，得到颗粒大小均一、分散性能良好的PNIPA凝胶；其次温敏型PNIPA凝胶协助溶菌酶复性，将溶菌酶试剂溶于变性缓冲液中，获得无活性的伸展态的溶菌酶溶液。再按照不同的稀释倍数缓慢加入不同体积的复性缓冲液，向溶液中加入粒状PNIPA凝胶。充分震荡使其分散均匀后，进行复性实验；最后，温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶的回收。复性结束后需将PNIPA凝胶充分缩水，实现凝胶与复性后目标蛋白质的分离，将凝胶回收，以便重复利用。本发明所采用的复性方法中氧化剂过硫酸铵的浓度为0.5％(w/v)，表面活性剂Tween80的添加量为75mg，机械搅拌速度为420rpm，总单体(包括单体与交联剂)浓度为5-15％(w/w)，交联度(交联剂的质量与总单体质量之比)为1-10％(w/w)，复性液中PNIPA凝胶的加入量为80-100mg/mL，稀释倍数为20-100倍，复性温度为30℃，速度为120rpm。
单体NIPA为N-异丙基丙烯酰胺(99％，聚合级，ACROS公司)，交联剂BIS为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(化学纯，中国医药上海试剂公司)，引发剂又称加速剂为N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)购自上海生工生物工程公司；溶菌酶购自上海生工生物工程公司，二硫苏糖醇(DTT)，乙二胺四乙酸钠(EDTA)购自上海生工生物工程公司，还原及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)购自上海生工生物工程公司，考马斯亮蓝G-250购自上海化学试剂公司，底物微球菌Micrococcus lysodeikticus ATCC4698购自Sigma公司，其它试剂均为市售分析纯。变性缓冲液为8mol/L尿素、30mmol/L二硫苏糖醇、0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH8.5；复性缓冲液为1mmol/L乙二胺四乙酸钠、0.15mol/L氯化钠、3mol/L尿素、3mmol/L还原型谷胱甘肽和0.375mmol/L、氧化型谷胱甘肽、0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH8.5。溶菌酶比活测定采用标准的F.I.P.法，溶菌酶的浓度采用考马斯亮兰法测定，溶菌酶的活力回收率为复性后溶液中溶菌酶的总活力与变性前溶菌酶总活力之比。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述1、反相悬浮法制备温敏型PNIPA凝胶实施例1温敏型PNIPA凝胶的制备(总单体浓度10％，交联度5％)反应在250mL的三颈瓶中进行，电子恒速搅拌器调节搅拌速度为420rpm。整个反应器浸没在超级恒温槽内，聚合温度25℃。将75mg表面活性剂Tween80溶于连续相75mL液体石蜡中，加入反应器，通入适量流速的N2，搅拌约20分钟使溶液混合均匀，然后将总单体浓度为10％，交联度为5％的反应物的水溶液用移液枪缓慢滴加入反应器中，继续搅拌30分钟后，缓慢加入1μL引发剂TEMED 20μL，聚合3小时出料。最后产物用不同体积比例的无水乙醇/水溶液反复浸泡，于真空干燥箱中烘干待用。得到的PNIPA粒状凝胶最大溶胀倍率为17。采用XS-200型普通光学显微镜(江南光学仪器厂)观察粒状凝胶在溶胀前后的外观形状、相互间的粘连特性及大小，计算凝胶粒子在溶胀前后的平均粒径变化。得到的PNIPA凝胶的平均粒径为0.3mm，分布于0.2-0.4mm的较窄区域，分散性能良好且基本呈正态分布。采用JSM55 10LV型扫描电镜(JEOL，Japan)观察粒子表面孔洞分布情况，凝胶粒子表面分布的孔洞直径为1-2μm。
温度低于32℃时，凝胶溶胀倍率随温度升高略呈下降趋势；当温度升高到32℃以上时，凝胶的溶胀倍率急剧下降；当温度高于36℃时，溶胀倍率几乎不再变化，而在33℃时，凝胶的溶胀倍率约为最大溶胀倍率的一半，即PNIPA凝胶的低临界温度(LCST)在33℃左右。
通过记录粒状凝胶于不同时间的溶胀倍率，可得到该粒状PNIPA凝胶具有快速的温度响应特性，在水溶液中达到溶胀及缩水平衡所需的时间仅为3分钟。
实施例2粒状PNIPA凝胶的制备(总单体浓度14％，交联度10％)反应在250mL的三颈瓶中进行，电子恒速搅拌器调节搅拌速度为420rpm。整个反应器浸没在超级恒温槽内，聚合温度25℃。将75mg表面活性剂Tween80溶于连续相中，加入反应器，通入适量流速的N2，搅拌约20分钟使溶液混合均匀，然后将总单体浓度为14％，交联度为10％的反应物的水溶液用移液枪缓慢滴加入反应器中，继续搅拌30分钟后，缓慢加入1μL引发剂TEMED，25℃聚合3小时出料。最后产物用不同体积比例的无水乙醇/水溶液反复浸泡，于真空干燥箱中烘干待用。得到的PNIPA粒状凝胶最大溶胀倍率为9，其低临界温度(LCST)在33℃左右。平均粒径为0.3mm且粒径分布于0.3-0.5mm的较窄区域，分散性能良好且基本呈正态分布。凝胶粒子表面分布的孔洞直径为1-2μm。该粒状PNIPA凝胶具有快速的温度响应特性，在水溶液中达到溶胀及缩水平衡所需的时间少于3分钟。
2、粒状PNIPA凝胶协助溶菌酶复性实施例3粒状PNIPA凝胶协助溶菌酶复性(制备凝胶的总单体浓度10％，交联度5％)10mg/mL无活性的伸展态的溶菌酶溶液加入到复性缓冲液后(稀释倍数为40)，向其中加入100mg/mL的粒状PNIPA凝胶，充分震荡分散均匀后，于30℃、120rpm摇床中复性3小时，结果如图1所示。复性后溶菌酶活力回收率达50.34％，而相同条件下稀释复性仅能得到44.9％的活力回收率。
实施例4粒状PNIPA凝胶协助溶菌酶复性(制备凝胶的总单体浓度10％，交联度10％)10mg/mL无活性的伸展态的溶菌酶溶液加入到复性缓冲液后(稀释倍数为40)，向其中加入100mg/mL的粒状PNIPA凝胶，充分震荡分散均匀后，于30℃、120rpm摇床中复性3小时，结果如图1所示。复性后溶菌酶活力回收率达52.10％，而相同条件下稀释复性仅能得到44.9％的活力回收率。
实施例5粒状PNIPA凝胶协助溶菌酶复性(制备凝胶的总单体浓度14％，交联度5％)10mg/mL无活性的伸展态的溶菌酶溶液加入到复性缓冲液中(稀释倍数为40)，向其中加入100mg/mL的粒状PNIPA凝胶，充分震荡分散均匀后，于30℃、120rpm摇床中复性3小时，结果如图1所示。复性后溶菌酶活力回收率达63.50％，而相同条件下稀释复性仅能得到44.9％的活力回收率。
实施例6粒状PNIPA凝胶协助溶菌酶复性(制备凝胶的总单体浓度14％，交联度10％)10mg/mL无活性的伸展态的溶菌酶溶液加入到复性缓冲液中(稀释倍数为40)，向其中加入100mg/mL的粒状PNIPA凝胶，充分震荡分散均匀后，于30℃、120rpm摇床中复性3小时，结果如图1和图2所示。复性后溶菌酶活力回收率达74％，而相同条件下稀释复性仅能得到44.9％的活力回收率。
实施例7粒状PNIPA凝胶协助溶菌酶复性(稀释倍数20)无活性的伸展态的溶菌酶溶液(10mg/mL)稀释20倍到复性缓冲液中，向其中加入100mg/mL的粒状PNIPA凝胶(制备凝胶的总单体浓度14％，交联度10％)，充分震荡分散均匀后，于一定温度的摇床中复性3小时。温度为30℃，摇床转速为120rpm，结果如图2所示。稀释复性时溶菌酶复性收率为30.11％，而加入凝胶协助复性时，可使其复性收率提高到49.96％。在提高复性收率的同时，该过程对于设备及仪器要求较低且操作简单。
实施例8粒状PNIPA凝胶协助溶菌酶复性(稀释倍数100)无活性的伸展态的溶菌酶溶液(10mg/mL)稀释100倍到复性缓冲液中，向其中加入80mg/mL的粒状PNIPA凝胶(制备凝胶的总单体浓度14％，交联度10％)，充分震荡分散均匀后，于一定温度的摇床中复性3小时。温度为30℃，摇床转速为120rpm，结果如图2所示。稀释复性时溶菌酶复性收率为86.60％，而加入凝胶协助复性时，可使其复性收率提高到87.23％。即当溶菌酶浓度较高时，加入PNIPA粒状凝胶协助复性的效果较好。且复性结束后只需将其放于36℃的恒温槽中10分钟，即可使凝胶充分缩水，实现凝胶与复性后目标蛋白质的分离。
实施例9粒状PNIPA凝胶的重复利用复性后的PNIPA粒状凝胶置于4℃、36℃的水浴中使其反复溶胀、缩水，这样重复10次后，即可方便、快速地实现凝胶的回收。最后清洗干净的PNIPA凝胶用无水乙醇置换出其中的水后，放于烘箱中烘干，再次用于蛋白质的复性实验中。通过该方法回收的凝胶可反复用于溶菌酶复性实验，凝胶重复利用8次后，仍能得到54.98％的溶菌酶活力回收率，比稀释复性提高20％。从而说明PNIPA凝胶在协助蛋白质复性领域具有较好的应用前景。
权利要求
1.一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法。其特征在于方法的步骤如下1)配制聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶反应物的水溶液将单体N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺以及氧化剂过硫酸铵，其中单体与交联剂浓度为5-15％(w/w)、交联度为1-10％(w/w)、过硫酸铵浓度为0.1-0.7％(w/v)，溶于25mL去离子水中，用微滤膜过滤溶液以除去未溶解的杂质；2)反相悬浮法制备温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶先向反应容器中加入75mL液体石蜡作为分散相，37.5-150 mg Tween80作为表面活性剂，充分分散后加入步骤1)反应物的水溶液，搅拌后加入1μL N，N，N’，N’-四甲基乙二胺作为加速剂引发聚合，聚合温度20-25℃，机械搅拌速度为350-450rpm，聚合3-4h，整个过程均需向反应容器中通入N2，得到粒状聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶，用1-5体积比率的无水乙醇/水溶液洗涤该凝胶，将凝胶于真空干燥箱中50-70℃烘干24-36h；3)温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性称取5-20mg/mL溶菌酶试剂溶于变性缓冲液中，置于摇床中反应，即可获得无活性的伸展态的溶菌酶溶液，取0.05-0.25mL该溶液，缓慢加入复性缓冲液，稀释到终体积均为5mL，再向溶液中加入20-120mg/mL的粒状PNIPA凝胶，充分震荡使其分散均匀后，于4-36℃、0-180rpm摇床中复性2-5小时。
2.按照权利要求1所述的一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，其特征在于所述的氧化剂过硫酸铵的浓度为0.5％(w/v)，表面活性剂Tween80的添加量为75mg，机械搅拌速度为420rpm。
3.按照权利要求1所述的一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，其特征在于所述的变性缓冲液为8mol/L尿素、30mmol/L二硫苏糖醇、0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH 8.5。
4.按照权利要求1所述的一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，其特征在于所述的复性缓冲液为1mmol/L乙二胺四乙酸钠、0.15mol/L氯化钠、3mol/L尿素、3mmol/L还原型谷胱甘肽和0.375mmol/L、氧化型谷胱甘肽、0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH8.5。
5.按照权利要求1所述的一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，其特征在于所述的无活性的伸展态的溶菌酶溶液的稀释倍数为20-100倍。
6.按照权利要求1所述的一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，其特征在于所述的复性温度为30℃、摇床转速为120rpm，聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶添加量为80-100mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法。步骤如下1)配制聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶反应物的水溶液；2)反相悬浮法制备温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶；3)温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性。本发明所开发的温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶，作为一种新型的蛋白质体外复性的添加剂，可使溶菌酶的活力回收率比稀释复性提高68％以上，凝胶重复利用8次后溶菌酶的活力回收率仍比稀释复性提高22％以上。该凝胶具有高效、影响复性的参数较少、操作方便、仪器设备要求较低且易于分离回收等优点，可降低生产成本，因而在蛋白质体外复性领域具有较好的应用前景。
文档编号C12N11/00GK1648243SQ20041007340
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月8日 优先权日2004年12月8日
发明者关怡新, 姚善泾, 崔志芳 申请人:浙江大学