来自产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶编码基因的制作方法

专利名称：来自产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶编码基因的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及来自产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶编码基因和借助于该基因而使胞内谷胱甘肽含量升高或降低的产朊假丝酵母，以及利用这样的产朊假丝酵母所得到的食品。由此产生的γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸，或者谷胱甘肽和半胱氨酰甘氨酸可应用于食品生产。
相关领域说明半胱氨酸用在增强食品的香味和口感等用途上。蛋白水解法、半合成法等等均是已知的生产半胱氨酸的方法，而目前大多应用蛋白水解法和半合成法。为了用半胱氨酸提高食品的香味和口感，需要富含半胱氨酸的天然食物原料。然而迄今为止，已知的这类天然食物原料很少。同时，有报道说，有一种富含半胱氨酸的食物原料是通过加热或酶处理含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物(酵母浸膏)后获得的(WO00/30474)。
半胱氨酰甘氨酸是半胱氨酸和甘氨酸通过肽键键合的二肽。有报道称，把半胱氨酰甘氨酸和糖一起加热可得到能增加肉香的物质。虽然已经知道用肽合成法生产半胱氨酰甘氨酸，但几乎没人知道它是由天然原料生产出来的。另一方面，有报道说通过热处理或酶处理含有谷胱甘肽的酵母提取物可得到富含半胱基氨基酸的食物原料(JP2001-321117A)。
在酿酒酵母中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以半胱氨酸和谷氨酸为底物合成γ-谷氨酰半胱氨酸。进而，谷胱甘肽合成酶以γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸为底物合成出谷胱甘肽。富含γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母在WO00/30474；Otake等人的Agri.Biol.Chem.，54(12)3145-3150(1999)；Chris等人的Molecular Biology of the Cell.，8，1699-1707(1997)；Inoue等人的Biochimica et Biophysica Acta，1395，315-320(1998)等中均有报道。然而所有这些相关研究的文献都用的是酿酒酵母，并无应用产朊假丝酵母的文献报道。
产朊假丝酵母是工业生产中重要的微生物，用来生产包括谷胱甘肽、几种氨基酸和酶(Journal of Bacteriology，1995，vol.177，No.24，p7171-7177)在内的生物化学上重要的物质。与酿酒酵母相比，产朊假丝酵母的特点是它可利用磷酸戊糖循环产生吡啶碱，并表现较弱的代谢抑制(Biotechnology，3，30(1993))。而且，因为实验研究多用酿酒酵母，所以少有关于产朊假丝酵母的发现。在此情况下，没有产朊假丝酵母如何合成谷胱甘肽的报道，仅有报道称，一种特殊的有锌抗性的产朊假丝酵母株系，在比正常酵母培养温度低5℃或更多的情况下，可产生大量的谷胱甘肽(JP03-18872B)。
这样，在产朊假丝酵母中编码谷胱甘肽合成酶的基因没有报道，也没有通过控制胞内谷胱甘肽含量来生产应用于工业方面的物质的已知方法。
发明概述本发明的目的之一是提供来自产朊假丝酵母的编码谷胱甘肽合成酶的基因，以及谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸及其提取物的含量很高的产朊假丝酵母。本发明的另一目的是提供含有谷胱甘肽、γ-谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸或半胱氨基甘氨酸的食物以及生产这样食物的方法。
已有报道显示对每单位糖源来说产朊假丝酵母的生长好过酿酒酵母(Biotechnology，卷3，30页(1983))。而且，由于在严格的有氧条件下并没有产生乙醇作为副产物(Kondo et al.(J.Bacteriology，Dec.，1995，pp.7171-7177))，因而在培养过程中不十分需要注意副产物乙醇的影响。因此，本发明人认为从产朊假丝酵母得到的酵母提取物有很高的γ-谷氨酰半胱氨酸含量，比起从酿酒酵母中得到的酵母提取物来更为便宜，因而有利于工业生产。
基于以上的概念，本发明人刻苦研究以达到前述的目标。结果，基于来源于其他生物体的酶的同源性，他们成功地从产朊假丝酵母中克隆得到编码谷胱甘肽合成酶的基因和编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因。他们发现通过基因修饰过的产朊假丝酵母具有高含量的γ-谷氨酰半胱氨酸，因此本发明得以完成。
本发明基本如下(1)编码定义为如下(A)或(B)的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有包括一个或几个氨基酸替代、缺失、插入或添加的SEQ IDNO2的氨基酸序列，并且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。
(2)如(1)中所述的DNA，且其定义为如下(a)或(b)(a)含有SEQ ID NO1中从58到1485位核苷酸的核苷酸序列的DNA；(b)能与含有SEQ ID NO1中从58到1485位核苷酸的序列的DNA或者与由所述的核苷酸序列制得的探针在严苛的条件下相杂交的DNA，并且它们编码有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。
(3)采用(1)或(2)中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少。
(4)采用(1)或(2)中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性增加。
(5)采用下述(c)或(d)中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少(c)含有SEQ ID NO1中从58到981位核苷酸的核苷酸序列的DNA；(d)能与含有SEQ ID NO1中从58到981位核苷酸序列的DNA或者与由所述的核苷酸序列制得的探针在严苛的条件下相杂交的DNA。
(6)如(3)到(5)中任一项所述的产朊假丝酵母，其中用SEQ IDNO3的DNA进一步修饰产朊假丝酵母以使其γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性提高。
(7)食物或饮料，其含有可通过在适宜条件下培养权利要求3到6任一项中的产朊假丝酵母所得到的培养物，包含谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸的所述培养物的级分(fraction)，或者谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸中γ位谷氨酸经过热处理或酶处理而释放的所述培养物或级分。。
(8)通过由在适宜条件下培养(3)到(6)任一项中的产朊假丝酵母得到的培养物生产的酵母提取物。
(9)生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食物的方法，该方法包括培养权利要求3到6任一项中的产朊假丝酵母，将得到的培养物或者其级分，或者经过热处理的培养物或其级分与食物或饮料的原料混合来加工食物或饮料。
附图简述

图1显示酿酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的替代盒(cassette for substituting)的构建图2显示酿酒酵母Nα4株系(strain)的构建图3显示产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因的表达载体的构建图4显示产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表达载体的构建图5显示产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因中断盒(cassette fordisrupting)的构建(前半部分)图6显示产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因中断盒的构建(后半部分)发明详述此后，本发明将详细解释如下。
<1>产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因本发明的DNA是编码定义为如下(A)或(B)的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列SEQ ID NO2上替代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。
术语“谷胱甘肽合成酶活性”指的是催化由γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸产生谷胱甘肽的反应的活性。
本发明的DNA编码的谷胱甘肽合成酶可包括那些在SEQ ID NO2的氨基酸序列上一个或几个位点替代、缺失、插入、添加或倒置一个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，只要酶活性没有被削弱。虽然此处“几个”氨基酸的具体数目在蛋白质的三维结构中随着位置和氨基酸残基的类型变化而变化，它也具体可指2到25，优选2到12，更优选2到7。
例如，编码(A)中蛋白的DNA可以提及具有序列表上SEQ ID NO1中的58到1485位核苷酸序列的DNA(CGSH2 DNA)。进而，可通过修饰CGSH2 DNA的方法得到编码基本上与前述的谷胱甘肽合成酶相同的蛋白的DNA，修饰的方法例如特定氨基酸残基位点上的包括替代、缺失、插入、添加或倒置在内的定点突变。进一步的，上述修饰过的DNA也能通过已知的诱变处理而获得。诱变处理的例子包括在体外用羟胺或类似物处理CGSH2 DNA的方法和处理含有CGSH2DNA的微生物的方法，例如，艾希氏属的细菌利用紫外照射或常用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)或乙基甲磺酸盐(EMS)处理。
进一步的，引起前述替代、缺失、插入、添加、倒置或其它此类的氨基酸残基突变包含天然存在的突变或者变异，例如，归于含有谷胱甘肽合成酶的产朊假丝酵母的不同株系的突变或变异。
编码基本上与谷胱甘肽合成酶相同的蛋白的DNA可通过在适宜的酿酒酵母等细胞中表达具有以上描述的突变的DNA并且检验细胞中谷胱甘肽合成酶的活性而获得。
进而，本发明的DNA包括可在严苛条件下与具有CGSH2 DNA全部或部分的核苷酸序列的探针杂交并且编码有谷胱甘肽合成酶活性蛋白的DNA，或者可编码有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白且与CGSH2DNA核苷酸序列有不少于90％的同源性，优选同源性不少于95％，更优选不少于99％的DNA。“严苛条件”在此是指能使所谓的特异性杂交形成而非特异杂交不能形成的条件。用任何数字化的值都很难清楚的表述出这些条件。但是，举例来说，严苛条件包括这样的条件，在此条件下同源性为75％或更高，优选85％或更高，更优选95％或更高的DNA之间会相互杂交，但同源性低于上述数值的DNA之间不发生杂交。更具体说，严苛条件包括保持DNA间杂交的符合通常Southern杂交洗涤的盐浓度条件，即1X SSC，0.1％SDS，优选0.1X SSC，0.1％SDS，60℃。
CGSH2 DNA核苷酸序列的一部分也可以用来作为探针。这样的探针可以以基于CGSH2 DNA核苷酸序列的寡聚核苷酸作为引物以含有CGSH2 DNA核苷酸序列的DNA片段作为模板用PCR的方法制得。当长度约为300bp的DNA片段用来当作探针时，杂交的洗涤条件可能是，举例来说，2X SSC，0.1％SDS，50℃。
在上述条件下杂交的DNA包括其中产生了终止密码子的那些或由于突变而失去活性的那些。然而，这样的DNA可通过检测表达产物的酶促活性而去除。
CGSH2 DNA已经确认为编码谷胱甘肽合成酶，因为当它导入已经削弱了谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母株系中后，谷胱甘肽的合成如以后描述的实施例那样加速了。
在数据库中搜索SEQ ID NO2的同源氨基酸序列，发现它与酿酒酵母谷胱甘肽合成酶氨基酸的氨基酸序列有48％的同源性。
<2>本发明的产朊假丝酵母本发明的产朊假丝酵母是用本发明的DNA的全长或部分片段修饰以使谷胱甘肽合成酶活性增加或者降低的株系，而且优选用SEQ IDNO.3的DNA进一步修饰来增加γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性。
用来修饰产朊假丝酵母来使它的谷胱甘肽合成酶活性相对于野生型降低的DNA可以有SEQ ID NO.1中的58到981位核苷酸的序列，或者是在严苛条件下可与具有SEQ ID NO.1的58到981位核苷酸序列的DNA杂交的DNA或由此核苷酸序列制得的探针。
修饰后谷胱甘肽合成酶活性降低的本发明的产朊假丝酵母优选地是相对于亲代株系谷胱甘肽合成酶活性降低的株系而且，例如，优选地谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少，更优选的谷胱甘肽合成酶活性为0.001μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少(“GSH”代表谷胱甘肽)。进一步优选那些谷胱甘肽合成酶活性低于可检测的范围的。
修饰后谷胱甘肽合成酶活性增高的本发明的产朊假丝酵母优选地是相对于亲代株系谷胱甘肽合成酶活性增高的株系而且，例如，优选的株系谷胱甘肽合成酶活性不少于0.450μmol GSH/mg蛋白/小时，更优选的谷胱甘肽合成酶活性不少于0.600μmol GSH/mg蛋白/小时。谷胱甘肽合成酶的活性可以用Gushima等人的方法测量(T.Gushima etal.，J.Appl.Biochem.，5，210(1983))。
本发明的产朊假丝酵母是通过修饰适宜的株系得到的，举例来说，产朊假丝酵母的野生型株系，利用基因重组技术(例如，下述出版物中公开的技术可以采用FEMS Microbiology Letters，165，335-340(1998)；J.Bacteriology，Dec.1995，PP.7171-7177；Curr.Genet.10(8)573-578(1986)；WO98/14600)来使胞内谷胱甘肽合成酶的活性增强或降低。谷胱甘肽合成酶活性的降低包括失去谷胱甘肽合成酶活性。
进一步的，作为利用基因重组技术降低谷胱甘肽合成酶活性的一种方法，可以提到对编码谷胱甘肽合成酶的基因进行修饰来使谷胱甘肽合成酶活性降低。产朊假丝酵母ATCC15239株系的谷胱甘肽合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。以前并不知道任何假丝酵母属酵母的谷胱甘肽合成酶基因。本发明的发明人搜索各种有机体的谷胱甘肽合成酶氨基酸序列中的高度保守区域，发现了在SEQID NO5至11列出的区域。接着，他们用与前述区域中SED ID NO6、10和11氨基酸序列相应的引物利用PCR的方法从产朊假丝酵母染色体上成功扩增得到了预期编码谷胱甘肽合成酶的基因片段。他们利用5’-RACE和3’-RACE的方法从片段成功分离得到编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的全长基因。对于用以获得全长基因的引物，其序列可以是SEQ ID NO12到19。进一步的，虽然产朊假丝酵母的株系没有具体的限定，它可以是例如ATCC15239株系。此株系是由美国分类培养保藏中心(ATCC)获得的(地址10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，United States of America)。
关于修饰谷胱甘肽合成酶的编码基因以降低谷胱甘肽合成酶活性的方法，举例来说，可以提到对基因的表达调控序列进行修饰，以使谷胱甘肽合成酶的表达量降低，或者修饰基因的编码区以使具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白不能被表达。具体的，例如，可以用含有去除了5’-和3’-末端的突变谷胱甘肽合成酶基因的重组DNA转化产朊假丝酵母来使染色体上基因中断(disrupted)，引起染色体上野生型基因和突变基因间发生重组。按照这样的方法，如果重组DNA中含有可利用宿主的特点比如营养缺陷型进行选择的标记基因的话，操作会变得更加容易。进而，如果重组DNA提前用限制性酶等消化成线性的，可以有效地得到在染色体中转入重组DNA的株系。
更进一步的，将含有去除了部分谷胱甘肽合成酶基因而仅能产生功能异常的谷胱甘肽的突变基因的重组DNA导入，且使染色体上正常基因和突变基因间发生重组，也可使产朊假丝酵母染色体上的基因中断。
在上述染色体中并入了重组DNA的株系中，在染色体上原始存在的谷胱甘肽合成酶基因和导入的DNA之间发生了重组，因而野生型谷胱甘肽合成酶基因和突变型谷胱甘肽合成酶基因的两个融合基因会插入染色体将重组DNA的其它部分(载体部分和标记基因)夹在中间。因此，这种状态下野生型的谷胱甘肽合成酶基因依然起作用。
接下来，为了在染色体DNA上仅仅留下突变型谷胱甘肽合成酶，一个拷贝的谷胱甘肽合成酶基因连同载体部分(包含标记基因)一起通过两个谷胱甘肽合成酶基因重组的方式从染色体DNA上去除。在这一步，将切除突变型谷胱甘肽合成酶基因而将野生型的谷胱甘肽合成酶基因留在染色体DNA上，或者将切除野生型谷胱甘肽合成酶基因而将突变型的谷胱甘肽合成酶基因留在染色体DNA上。既然标记基因在两种情况下都会去除掉，第二次重组的发生可以通过标记基因相应的表型来确认。进一步的，可以通过PCR扩增谷胱甘肽合成酶基因检验其结构来挑选目标基因替代株。
对于用来中断基因的谷胱甘肽合成酶基因或者其片段，除了有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA外，还包括在严苛条件下可与该DNA杂交的DNA和/或与SEQ ID NO1中核苷酸序列有90％或更多，优选为95％或更多，更优选为99％或更多的同源性的DNA。严苛条件包括保持DNA间杂交的符合通常Southern杂交洗涤的盐浓度条件，如1X SSC，0.1％SDS，优选0.1X SSC，0.1％SDS，60℃。
酿酒酵母谷胱甘肽合成酶基因的中断在WO00/30474中已公开。
将重组DNA导入产朊假丝酵母的方法的实例包括电转法(electroporation method)(Luis et al.，FEMS Microbiology Letters，165，335-340(1998))。
谷胱甘肽合成酶活性降低的株系可利用对甲基乙二醛敏感性作为表型进行筛选(Y.Ohtake et al.，Agri.Biol.Chem.，54(12)3145-3150(1990))。可合成一定量的谷胱甘肽的细胞株(具有谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的细胞株)对甲基乙二醛表现出抗性。进而，谷胱甘肽合成酶活性的降低也可以通过检验细胞株在不含有谷胱甘肽的培养基中的生长状态来确定。进一步的，降低了谷胱甘肽合成酶活性的株系可以利用MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)浓度梯度平板有效地得到。
另一方面，作为利用基因重组技术增强谷胱甘肽合成酶活性的一种方法，可以用修饰谷胱甘肽合成酶基因来提高基因编码的蛋白的谷胱甘肽合成酶活性或者修饰谷胱甘肽合成酶基因来提高该基因的表达量作为例子。举例来说，通过将表达谷胱甘肽合成酶的具有SEQ IDNO1核苷酸序列的DNA以可表达的形式导入到产朊假丝酵母可以提高谷胱甘肽合成酶活性。
将谷胱甘肽合成酶基因导入产朊假丝酵母的方法包括用包含谷胱甘肽合成酶基因和产朊假丝酵母染色体上存在的一段DNA序列的重组DNA转化产朊假丝酵母(Kondo，K.et al.，J.Bacteriol.，1995，177，p7171-7177)。具体地，DNA的导入可以用与上述的基因替换相似的方法来进行。
本发明的产朊假丝酵母在改变了谷胱甘肽合成酶活性之外可能还提高了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的提高可通过向产朊假丝酵母以可表达的形式导入γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因来实现。γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶基因的实例包括如SEQID No.3所示由产朊假丝酵母衍生的基因。
将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因导入产朊假丝酵母的方法的实例包括，举例来说，用含有该基因和产朊假丝酵母染色体上存在的一段DNA序列的重组DNA转化产朊假丝酵母，将重组DNA掺入染色体(Kondo，K.et al.，J.Bacteriol.，1995，177，p7171-7177)。具体地，导入可以用与前述基因替换相似的方法来进行。
进一步的，目的基因也可以利用含有存在于染色体DNA上的自主复制序列(ARS)的质粒来导入产朊假丝酵母。产朊假丝酵母的ARS及利用它进行转化在WO95/32289中有说明。
<3>本发明涉及的酵母提取物、食品和饮料以及生产它们的方法通过在适宜条件下培养如前所述的修饰过谷胱甘肽合成酶活性的酵母获得的培养物或其级分含有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸。培养物可以是含有酵母细胞的培养基液体、酵母细胞、破碎的细胞或者从培养物得到的细胞提取物(酵母提取物)。含有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的级分可由破碎的细胞或酵母提取物获得。
当加热含有γ-谷氨酰半胱氨酸的前述培养物或其级分时，γ-谷氨酰半胱氨酸分解成为半胱氨酸和吡咯烷酮羧酸并因而释放出半胱氨酸。具体地，将培养物或其级分保持在酸性或中性的条件下可以制得半胱氨酸，具体的是指在pH值1到7，在50到120摄氏度且有水存在的条件下3到300小时。
进一步的，也可调节含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物或其级分的pH为3到9，加入γ-谷氨酰肽解酶(γ-谷氨酰转移酶、γ-谷氨酰环化转移酶、谷氨酰胺酶等)并在15到70摄氏度下与γ-谷氨酰半胱氨酸作用1到300分钟以生产半胱氨酸。
加热含有谷胱甘肽的前述培养物或其级分时，谷胱甘肽分解成为半胱氨酰甘氨酸和吡咯烷酮羧酸并因而释放出半胱氨酰甘氨酸。具体地，将培养物或其级分保持在酸性或中性的条件下可以制得半胱氨酰甘氨酸，具体的是指在pH值1到7，在50到120摄氏度且有水存在的条件下3到300小时。
进一步的，也可调节含有谷胱甘肽的培养物或其级分的pH为3到9，加入γ-谷氨酰肽解酶(γ-谷氨酰转移酶、γ-谷氨酰环化转移酶、谷氨酰胺酶等)在15到70摄氏度下与谷胱甘肽作用1到300分钟以生产半胱氨酰甘氨酸。
用于培养的培养基没有特别的限制，只要本发明的酵母生长良好且能有效地生产谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸。如果需要，根据酵母的特性在培养基中加入必须的营养物。
培养的条件、酵母提取物的制备等可以按照一般培养酵母和制备酵母提取物的方式进行。酵母提取物的生产可以通过热水提取酵母细胞或者消化酵母细胞来进行。进而，本发明的酵母提取物可以是已经由热处理或酶作用后产生了半胱氨酰或半胱氨酰甘氨酸的提取物，或者是在同其它原料一起制作食物或饮料的时候或其后再接受热处理的提取物。
具体地，酵母提取物的热处理按如下操作。向酵母提取物粉加水，混合物用盐酸调pH值到5，制备成浓度为10％的含水溶液。接着将溶液98℃加热180分钟。
含有γ-谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽或半胱氨酰甘氨酸的培养物或其级分可用来制造食物或饮料。食物或饮料的例子如酒精饮料、面包、发酵的食物调味品。由γ-谷氨酰半胱氨酸加热产生半胱氨酸以及由谷胱甘肽加热产生半胱氨酰甘氨酸可以在食物或饮料生产过程中或者其后进行。可替代的，也可选择在食物或饮料生产之前对酵母培养物或其级分进行热处理。
上述的食物或饮料是将含有γ-谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽或半胱氨酰甘氨酸的培养物或其级分与其它原料混合并且将此混合物加工成食物或饮料而生产的。除了使用前述的培养物或者级分，本发明涉及的食物或饮料可用与一般的食物或饮料相同的原料按相似的方法制作。这些原料的例子包括稻米、大麦、玉米淀粉等(用于制作酒精饮料)，小麦粉、糖、盐、黄油、发酵酵母等(用于制作面包)，黄豆、小麦等(用于制作发酵的食物调味品)。进而，酵母提取物或其浓缩物，或它们的干的产物可用作发酵的食物调味品。
实施例本发明将参考以下实施例得到更为具体的解释。
<1>推定为编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的基因的获得产朊假丝酵母ATCC15239株系30℃下在试管中用YPD培养基振摇培养，利用针对酵母的Dr.GenTLE(Takara Shuzo Co.，Code 9084)从细胞中制备染色体。葡萄糖 2％蛋白胨 1％
酵母提取物 1％(pH5.0)在酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和大鼠的谷胱甘肽合成酶中筛选出如下的高度同源的氨基酸序列(参见Chris et al.，Molecular Biology of theCell.，8，1699-1707(1997))。
(i)QEVAVVYYR(SEQ ID NO5)(ii)GSKKIQQ(SEQ ID NO6)(iii)VLKPOREGGGNNVLKPQREGGGNN(SEQ ID NO7)(iv)ISELGTYG(SEQ ID NO8)(v)GGVAAGF(SEQ ID NO9)基于这些氨基酸序列设计简并引物，用分别与下面(i)和(ii)、(i)和(iii)、(i)和(iv)、(i)和(v)、(ii)和(iii)、(ii)和(iv)、(ii)和(v)、(iii)和(iv)、(iii)和(v)、(iv)和(v)的每一对相应的简并引物来做简并PCR。每种PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下预期大小的区带部分来制备RNA。进而，利用利用制得的DNA作为模板进行巢式PCR，扩增得到目的片段。
接下来，参考产朊假丝酵母密码子的频率设计相应于以下氨基酸序列的引物。
(vi)GSKKIQQ(SEQ ID NO6)(vii)EGGGNN(SEQ ID NO10)(viii)PQREGGG(SEQ ID NO11)用相应于氨基酸序列(vi)的引物(GGT TCY AAG AAG ATY CARCA，SEQ ID NO12)和相应于氨基酸序列(vii)的引物(CCA CCA CCYTCT CTY TGT GG，SEQ ID NO13)来做PCR。采用KODDASH(TOYOBO Co.，Code LDP-101)按照产品说明书进行PCR，反应条件94℃2分钟，接着以94℃1分钟、55℃(每个循环后降低0.5℃)1分钟、74℃40秒进行22个循环，94℃1分钟、50℃1分钟、74℃40秒再进行15个循环反应。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(Nusieve 3∶1琼脂糖3％，1X TAE溶液(Takara Shuzo Co.，Code F5180A))。凝胶用溴化乙锭染色，切下100到300bp的相应区域，用MagExtractor(TOYOBO Co.，CodeNPK-601)从胶中回收DNA。
当用此DNA作为模板进行巢式PCR时，设计相应于(vi)的引物(SEQ ID NO12)和相应于(viii)的引物(GTT GTT ACC ACC ACC YTC，SEQ ID NO14)，在100到300bp的相应区域内出现3个条带。在如上同样的条件下进行PCR。分别切出这三个条带并从胶中回收相应DNA。每个条带的DNA都用DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo Co.)连接到pGEM-T Easy vector(promega Co.)载体上用来转化艾希氏大肠杆菌JM109感受态细胞(Takar Shuzo C0.，Code9052)。得到的转化株中有一株可望含有能编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的基因片段。用常规的方法检测该转化株中插入的核苷酸序列。
3’的cDNA快速扩增(RACE)是在上面描述的核苷酸序列基础上用试剂盒 3’-RACE System For Rapid Amplification of cDNAEnds(Gibco BRL，Cat.No.18373-027)进行的。最初的CDNA链由用Rneasy Mini Kit(QIAGEN Co.，Cat.No.74104)从产朊假丝酵母提取的mRNA中制得，PCR进行三次。采用的引物如下所示。
第一次PCRAAG ATA TAC CCA TTG GAT GG(SEQ ID NO15)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRTCA GAT CTT GGT AAA GAG GC(SEQ ID NO16)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRAGA CTG GCA TTT GAG TCT CC(SEQ ID NO17)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物依照产品说明书使用KOD DASH(TOYOBO Co.，Code LDP-101)进行PCR，反应条件先94℃2分钟，接着以94℃1分钟、50℃30秒、74℃40秒进行30个循环。
PCR产物连接到pGEM-T Easy vector载体用来转化艾希氏大肠杆菌。分析所得转化株中插入的核苷酸序列来获取有望为编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的基因片段的信息。
在上面描述的核苷酸序列基础上用试剂盒GeneRacer Kit(Invitrogen Co.，Cat.No.L1502-01)进行5’RACE，但是在逆转录时用SuperSucript III RT(Invitrogen Co.，Cat.No.18080-044)替代试剂盒中的SuperSucript II。最初的CDNA链由用Rneasy Mini Kit(QIAGENCo.，Cat.No.74104)从产朊假丝酵母提取的mRNA中制得，接着进行巢式(nested)PCR。
采用的引物如下所示。
制备cDNA的引物TTG ACA CCA ACT CGG AGA CAT CAG A(SEQ ID NO18)巢式PCRGAG AGT ACC TTC TCA TCC GTC AAG A(SEQ IDNO19)，和试剂盒中附带的GeneRacer 5’巢式引物按照TOPO TA克隆方法将PCR产物连接到试剂盒中pCR4-TOPO载体来转化艾希氏大肠杆菌。分析所得转化株中插入的核苷酸序列来获得推定为含有编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因的基因片段。
以如上描述所获得的信息为基础设计引物，进行PCR并测定扩增产物的核苷酸序列。PCR反应的酶用Pyrobest(Takar Shuzo Co.)，依照产品说明书反应条件设定为先98℃2分钟，接着以98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟进行40个循环。
采用的引物如下所示。
引物F1TAG CCA ATA CAA CCA GCA ACA C(SEQ ID NO20)引物R1GAA GGA ATT CTA ATT CGT GAG G(SEQ ID NO21)用常规的方法检测上面PCR扩增产物的核苷酸顺序，发现与SEQID NO1的核苷酸序列一致。此核苷酸序列推定编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2中所示。因而，产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因的同源物已经获得。
<2>推定为编码产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因的获得在酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Ohtake et al.，Yeast，7(9)953-961(Dec.，1991)；Mutoh et al.，J.Biochem.(Tokyo)，117(2)283-288(feb.，1995))的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶中筛选出如下的高度同源的氨基酸序列。
(ix)MGFGMG(SEQ ID NO22)(x)GWRVEFR(SEQ ID NO23)基于每一个氨基酸序列设计简并引物，进行简并PCR。设计相应于(ix)的引物F1(ATG GGN TTY GGN ATG GG，SEQ ID NO24)和相应于(x)的引物R1(RAA YTC NAC NCK CCA，SEQ ID NO25)。以KODDASH(TOYOBO Co.，Code LDP-101)做DNA聚合酶按照产品说明书进行PCR，反应条件94℃3分钟，接着以94℃1分钟、52℃1分钟、74℃1分钟进行30个循环反应。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下约700bp的预期大小的区带部分，用MagExtractor(TOYOBO Co.，Code NPK-601)从胶中回收DNA。
用此DNA作为模板进行巢式PCR。以如上同样的方法进行PCR。分别切出这三个条带并从胶中回收相应DNA。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳然后用溴化乙锭染色，切下约700bp的相应区带部分，用MagExtractor从胶中回收DNA。该DNA用DNA连接试剂盒DNALigation Kit Ver.2(Takara Shuzo Co.)连接到pGEM-T Easy vector载体上用来转化艾希氏大肠杆菌JM109感受态细胞。得到的转化株中有一株被认定含有能编码产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因片段。用常规的方法检测该转化株中插入的核苷酸序列。
3’RACE是在上面描述的核苷酸序列基础上用3’-RACE SystemFor Rapid Amplification of cDNA Ends(Gibco BRL)进行的。最初的CDNA链是由用Rneasy Mini Kit从产朊假丝酵母提取的mRNA中制得的，PCR进行三次。
采用的引物如下所示。
第一次PCRTGA ACA GAG CTC GTT ACC TC(SEQ ID NO26)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRTCA TGG GCT AAT TTT GCA CC(SEQ ID NO27)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRTTC CTA GCA TTG ACG GCA GC(SEQ ID NO28)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物依照产品说明书采用KOD DASH(TOYOBO Co.，Code LDP-101)进行PCR，反应条件为先94℃2分钟，接着以94℃1分钟、50℃30秒、74℃40秒进行30个循环。PCR产物连接到pGEM-TEasy vector载体用来转化艾希氏大肠杆菌。分析所得转化株中插入的核苷酸序列来获取有望含有编码产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的基因片段的信息。
接着，以先前阐明的核苷酸序列为基础进行5’RACE。使用的试剂盒为5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends ReagentAssembly Version 2.0(Gibco BRL)。
用以逆转录来获得最初cDNA链的引物如下所示。
AGC ACC AGA AAT GAC GTT C(SEQ ID NO29)利用依照产品说明书和以下引物构建的cDNA文库进行3次PCR。PCR根据产品说明书采用KOD DASH来进行，反应条件为先94℃2分钟，接着以94℃1分钟、50℃30秒、74℃40秒进行30个循环。
采用的引物如下所示。
第一次PCRCCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG(SEQ ID NO30)和试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRGTC AGC TAA GTG GCC TTT G(SEQ ID NO31)和试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRCAC TGG CGC TGC TGC CGT C(SEQ ID NO32)和试剂盒附带的AUAP引物PCR产物连接到pGEM-T Easy vector载体上用来转化艾希氏大肠杆菌。分析所得转化株中插入的核苷酸序列来获取有望含有编码产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的基因片段的信息。基于与其它有机体的同源性考虑，认为没有得到全长的克隆，继续进行5’RACE。
用以逆转录来获得最初cDNA链的引物如下所示。
TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT(SEQ ID NO33)
利用依照产品说明书构建的cDNA文库进行3次PCR。
采用的引物如下所示。
第一次PCRCTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC(SEQ ID NO34)和试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRCAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG(SEQ ID NO35)和试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRAGC CAG CGG TGT CGC CTC(SEQ ID NO36)和试剂盒附带的AUAP引物PCR产物连接到pGEM-TEasy vector载体用来转化艾希氏大肠杆菌。分析所得转化株中插入的核苷酸序列来获取有望含有编码产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的基因片段的信息。
以如上描述所获得的信息为基础设计引物，进行PCR并测定扩增产物的核苷酸序列。PCR反应的酶用Pyrobest(Takar Shuzo Co.)，依照产品说明书反应条件定为先98℃2分钟，接着98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟进行40个循环。
采用的引物如下所示。
引物F2GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG(SEQ ID NO37)引物R2AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT(SEQ ID NO38)用常规的方法检测上面PCR扩增产物的核苷酸顺序，结果如SEQID NO3所示。而且，可望被此核苷酸序列编码的产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的氨基酸序列在SEQ ID NO4已列出。这样，产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的同源物已经得到。
通过在酿酒酵母中表达由产朊假丝酵母衍生的经上面鉴定的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因和谷胱甘肽合成酶同源基因来检验它们的功能。构建在酿酒酵母中表达每个基因的载体并导入到酿酒酵母中，这样即可分析同源基因的功能。
使用的细胞株为WO01/90310中描述的酿酒酵母Nα3株系，它是降低了谷胱甘肽合成酶活性的酿酒酵母。
Nα3株系的构建是用编码活性减弱的谷胱甘肽合成酶的基因替换亲代Nα1株系(WO01/90310)的谷胱甘肽合成酶基因，亲代Nα1株系是尿嘧啶营养缺陷型单倍体细胞。
<3>降低了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的酿酒酵母的获得(1)GSH1基因取代盒的产生首先，以前述Nα1株系染色体DNA为模板，PCR扩增γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因中部区域到3’末端这一片段(SEQ ID NO39)。依照产品说明书PCR采用KOD DASH(TOYOBO Co.)，反应混合物组成如后面，反应条件为94℃1分钟，接着94℃30秒、60℃40秒、74℃1分钟进行30个循环。引物采用GF1(GTG GAC GAC CGT ACTCCG AAG，SEQ ID NO41)和GR1(ACC CAA ATC GAT AAT GTCAAC，SEQ ID NO42)。
如上述方法扩增得到的GSH1基因片段依照产品说明书与质粒pGEM-T Easy(Promega Co.)相连得到GSH1dash/pGEM。
接着，通过定点突变用GSH1dash/pGEM所含γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(SEQ ID NO39)的终止密码子替代γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(SEQ ID NO40)第372和373位氨基酸(即丝氨酸和赖氨酸)相对应的密码子。此项操作采用Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE Co.)按照产品的使用方案来进行。引物为QCF1(CTTTTC TTG GGT GGG TAG TAA TTT TTC AAT AGG ACT，SEQ IDNO43)和QCR1(AGT CCT ATT GAA AAA TTA CTA CCC ACC CAAGAA AAG，SEQ ID NO44)。这样得到了GSH1Mdash/pGEM质粒。
如上所述倒入的突变γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶活性减弱了(减弱的谷胱甘肽合成酶，WO01/90310)。
接下来，WO01/90310中描述的质粒pYES2dash(从质粒pYES2(Invitrogen Co，)去除2μori获得的质粒)和上述GSH1Mdash/pGEM质粒均用限制性酶SacI和SphI消化。从pYES2dash切得含有URA3基因的片段，从GSH1Mdash/pGEM切得含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶部分基因序列的区域，将二者相互连接制得质粒GSH1Mdash/pYES2dash。用限制性酶BbeI消化GSH1Mdash/pYES2dash得到基因取代盒(图1)。
(2)将GSH1基因取代盒导入酿酒酵母用上述方法制得的基因取代盒替代Nα1株系的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因。预先培养Nα1细胞株，培养物接种在50ml的YPD培养基中直到细胞到达对数生长期。培养的细胞混悬在1M山梨醇中，与基因取代盒混合并进行电转。转化株涂在含1mM谷胱甘肽的SD平板上培养，选出生长的细胞株。用PCR方法确认基因取代盒并入了染色体的目标位置，得到的株系称为Nα4中间体。接下来，进行如下操作以仅仅使突变型γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因留在染色体上。在含1mM谷胱甘肽的YPD培养基中培养Nα4中间体，将液体培养物接种到含1mM谷胱甘肽的SDFOA平板上。对在平板上生长的细胞株的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因进行测序，确定目标位置的序列被正确的取代，这样获得了Nα4株系(图2)。
接下来，检验上面获得的Nα4株系的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性是否减弱了。Ohtake等人测定了通过诱变处理酿酒酵母YNN27株系获得的YH1细胞株中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性(Agric.Biol.Chem.，54(12)3145-3150(1990))。依照此方法进行活性检测。结果是Nα4株系的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性低于可检测临界。在SD培养基中培养Nα4细胞株，在对数生长期检测细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。然而，γ-谷氨酰半胱氨酸没检测到而谷胱甘肽浓度是0.01％。进一步的，因为Nα4株系对2mM甲基乙二醛显示出敏感性，可以确认在YH1细胞株的情形下γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因已经进行了取代。
<4>源自产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶同源物的表达载体的构建以产朊假丝酵母染色体DNA为模板用PCR方法扩增产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因同源物(CGSH2)的开放式阅读框区域。PCR的酶用Pyrobest(Takar Shuzo Co.)，依照产品说明书反应条件为先98℃2分钟，接着以98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟进行40个循环。
PCR采用加了KpnI酶切位点的N-末端引物CGSH2F1(AGA TTG GGTACC ATG AGT ATT CCT CAG TTA TCT G，SEQ ID NO45)，以及加了XbaI酶切位点的C-末端引物CGSH2R1(ATC CGG TCT AGA CTATTG GAG AGC AAC ACC ATC，SEQ ID NO46)，在上述条件下进行PCR并使用QIAquick PCR purification kit纯化扩增的产物。纯化后的PCR产物以及pAUR123载体(Takar Shuzo Co.)用限制酶KpnI和XbaI酶切，而后互相连接并用以转化艾希氏大肠杆菌JM109感受态细胞。这样就制得CGSH2/pAUR123载体。接下来，用限制酶BamHI酶切CGSH2/pAUR123载体和pYES2载体。由CGSH2/pAUR123载体得到一段含有CGSH2开放式阅读框和源自pAUR123载体的启动子的区段，它与pYES2载体酶切后去磷酸化末端相连接，并且用来转化艾希氏大肠杆菌JM109感受态细胞。这样，CGSH2/pYES2载体，产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶同源物的表达载体就制得了(图3)。
<5>源自产朊假丝酵母的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶同源物的表达载体的构建以产朊假丝酵母染色体DNA为模板用PCR方法扩增产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因同源物(CGSH1)的开放式阅读框区域。PCR的酶用Pyrobest(Takar Shuzo Co.)，依照产品说明书反应条件为先98℃2分钟，接着以98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟进行40个循环。PCR采用加了KpnI酶切位点的N-末端引物CGSH1F1(GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGG AC，SEQID NO47)，以及加了XbaI酶切位点的C-末端引物CGSH1R1(CCCTTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT C，SEQ IDNO48)，在上述条件下进行PCR并使用QIAquick PCR purification kit纯化扩增的产物。纯化后的PCR产物以及pAUR123载体(Takar ShuzoCo.)用限制酶KpnI和XbaI酶切，而后互相连接并用以转化艾希氏大肠杆菌JM109感受态细胞。这样就制得CGSH1/pAUR123载体。接下来，用限制酶BamHI酶切CGSH1/pAUR123载体和pYES2载体。
由CGSH1/pAUR123载体得到一段含有CGSH1开放式阅读框和源自pAUR123载体的启动子的区段，它与pYES2载体酶切后去磷酸化末端相连接，并且用来转化艾希氏大肠杆菌JM109感受态细胞。这样，CGSH1/pYES2载体，产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶同源物的表达载体就制得了(图4)。
<6>互补作用测试接下来，将CGSH1/pYES2载体或CGSH2/pYES2载体导入Nα3细胞株和Nα4细胞株得到转化株。预先培养Nα3细胞株和Nα4细胞株并接种到50ml的液体培养基中(含1mM谷胱甘肽的YPD培养基)直到细胞到达对数生长期。培养的细胞混悬在1M山梨醇中，与CGSH1/pYES2载体或CGSH2/pYES2载体混合并进行电转。转化株涂在含1mM谷胱甘肽的SD平板上培养，选出生长的细胞株。Nα3细胞株和Nα4细胞株表现为尿嘧啶营养缺陷型并且只有当含有CGSH1/pYES2载体或CGSH2/pYES2载体时才能在SD培养基中生长。采用常规的方法，确认得到的转化株含有CGSH1/pYES2载体或CGSH2/pYES2载体。
这样，获得了转化株Nα3/CGSH1细胞株、Nα4/CGSH1细胞株、Nα3/CGSH2细胞株和Nα4/CGSH2细胞株。Nα3/CGSH1对2mM甲基乙二醛显示出敏感性，然而Nα4/CGSH1株系对2mM甲基乙二醛不显示出敏感性。另一方面，Nα3/CGSH2株系对2mM甲基乙二醛不显示出敏感性，然而Nα4/CGSH2对2mM甲基乙二醛显示出敏感性。进一步的，当在SD培养基中培养它们时，Nα3/CGSH1和Nα4/CGSH2细胞株在对数生长期几乎不含谷胱甘肽，然而，Nα3/CGSH2和Nα4/CGSH1细胞株在对数生长期含0.4％的谷胱甘肽。Nα3株系的谷胱甘肽合成能力降低是由于酿酒酵母谷胱甘肽合成酶发生的突变，然而Nα4株系的谷胱甘肽合成能力降低是由于酿酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶发生的突变。因此证明了CGSH1与酿酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶互补以及CGSH2与酿酒酵母谷胱甘肽合成酶互补。
通过改变编码谷胱甘肽合成酶部分DNA而产生降低了谷胱甘肽合成酶活性的产朊假丝酵母的例子见以下参考实施例。降低了谷胱甘肽合成酶活性的产朊假丝酵母也可通过类似的方法，利用含有SEQ IDNO1中从58到981位核苷酸序列的DNA，或者能与含SEQ ID NO1中从58到981位核苷酸序列的DNA杂交的DNA或者可由此核苷酸序列在严苛的条件下制得的探针而得到。
<参考实施例1>产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因中断盒的制备以产朊假丝酵母ATCC15239的染色体DNA为模板并以SEQ IDNO49及SEQ ID NO50那样的引物进行PCR。PCR的酶用Pyrobest(Takar Shuzo Co.)，依照产品说明书反应条件为先98℃2分钟，接着以98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟进行40个循环。
扩增的产物使用QIA Quick PCR Purification Kit(QIAGEN Co.，Cat.No.28106)纯化，纯化的产物在末端用加上腺嘌呤并与pGEM-T Easy载体相连。腺嘌呤的添加是使用AmpliTaq(ABI，Code N808-0161)和2.5mM dATP来替代dNTP在72℃10分钟下进行的。随后，使用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE Co.，Catalog #200518)对克隆的片段中两处核苷酸序列进行定点重组导入HindIII和KpnI酶切位点，这样得到CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy载体。用于定点重组的引物如下所示。GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C(SEQ ID NO51)G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC(SEQ ID NO52)[突变的第二次导入(导入KpnI酶切位点)]CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG(SEQID NO53)CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG(SEQID NO54)接着，以产朊假丝酵母AATCC15239的染色体DNA为模板用如下引物进行PCR来扩增含有URA3基因的片段。依照产品说明书使用KODDASH(TOYOBO Co.，Code LDP-101)进行PCR，反应条件先94℃2分钟，接着以94℃1分钟、54℃30秒、74℃40秒进行30个循环。
CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC(SEQ ID NO55)GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC(SEQ IDNO56)扩增的产物与pGEM-T Easy载体相连得到CURA3/pGEMT-Easy载体。
CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy载体和CURA3/pGEMT Easy载体均用HindIII和KpnI酶切。从CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy载体制得含有CGSH2和pGEMT-Easy主要部分的片段，从CURA3/pGEMT-Easy载体制得含有CURA3的片段。制得的片段相互连接并用来转化艾希氏大肠杆菌JM109感受态细胞。这样，就得到了CURA3ΔCGSH2/pGEMT-Easy载体。
以限制酶NotI酶切过的CURA3ΔCGSH2/pGEMT-Easy载体为模板用SEQ ID NO49及SEQ ID NO50那样的引物进行PCR。这样，得到了产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的基因中断盒(图5和6)。
<参考实施例2>尿嘧啶营养缺陷型产朊假丝酵母ATCC15239ura-株系的获得ATCC15239ura-株系，一种源自ATCC15239的尿嘧啶营养缺陷型细胞株，可通过常规的方法得到(Luis et al.，FEMS MicrobiologyLetters，165，335-340(1998))。由于如以后所说明的那样ATCC15239ura-株系与URA3基因互补，该株系预计为ura3突变型。
<参考实施例3>源于产朊假丝酵母的γ-谷氨酰半胱氨酸生产酵母(ATCC15239Δgsh2株系)的获得首先，ATCC15239ura-株系30℃下在YPD培养基试管中培养过夜。将液体培养物接种到摇瓶中的YPD培养基里(500ml的sakaguchi瓶加50ml培养基)在30℃下振摇培养。在对数生长期搜集细胞并用冷却到4℃的1M山梨醇溶液洗涤三次。洗过的细胞混悬在冷却的1M山梨醇溶液中。混悬液加入50μl(2μg)的谷胱甘肽合成酶基因中断盒，在0.2cm小玻璃管中混匀并用Gene Pulser System(bioRad Co.)在电阻为200Ω、电容125μF、设定电压1.5kV条件下进行电转。向小玻璃管中倒入1ml冷却的1M山梨醇溶液，将小玻璃管冰浴10分钟。混悬的细胞涂在SD平版上30℃下培养。
在平版上生长的细胞株复制到SD平版和含有10mM甲基乙二醛的SD平版上30℃下培养。筛选出7株对甲基乙二醛敏感的细胞株。这7个细胞株每株都30℃下在YPD培养基试管中振摇培养过夜。将2％培养液接种到SD培养基(500ml的sakaguchi瓶加50ml培养基)在30℃下振摇培养。在对数生长期搜集细胞并用无菌水洗涤两次。洗过的细胞用70℃热水抽提10分钟并将从酵母细胞中提取到的γ-谷氨酰半胱氨酸用HPLC分离和定量。进而，将含在一定量的培养基中的酵母细胞洗净后放在滤纸上，用105℃加热4小时，称量剩余细胞的重量作为酵母细胞干重。这样，ATCC15239Δgsh2细胞株可作为产朊假丝酵母中γ-谷氨酰半胱氨酸含量占酵母细胞干重1％或更多的株系而获得。
将ATCC15239Δgsh2细胞株接种到SD培养基中30℃下振摇育种两天。向SD培养基中接种终浓度为2％的培养物并在30℃下振摇培养。测得的γ-谷氨酰半胱氨酸含量在7小时和9小时后分别为1.08％和1.12％。谷胱甘肽含量低于可检测的最低限。
<参考实施例4>ATCC15239Δgsh2细胞株谷胱甘肽合成酶活性的测定将ATCC15239Δgsh2细胞株接种到YPD培养基中并在30℃下振摇培养。接种终浓度为2％的所得的培养物到SD培养基(2升锥形瓶加400ml)中并在30℃下振摇培养。在对数生长期搜集细胞并用冷却到4℃的1M山梨醇溶液洗涤两次。洗后的细胞混悬于0.5ml含有0.1mM苯甲磺酰氟(PMSF)的10mM Tris-HCL缓冲液(pH7.5)。混悬液加玻璃珠(425-600微米酸洗玻璃珠(SIGMA Co.，Code G-8772))，用玻璃珠搅拌器(WAKENYAAKU Co.)破细胞。破碎的细胞在显微镜下确认。而后，加入1ml上述的缓冲液，玻璃珠和细胞碎片通过离心的方法除去。这样就得到了细胞的粗提物。使用ULTRAFREE-15Biomax10(MILLIPORE Co.，Cat.No.UFV2BGC40)纯化细胞粗提物得到酶溶液。采用Bradford法对所得酶溶液中的蛋白进行定量。使用CBB蛋白分析液(Protein Assay CBB Solution(Nakarai Co.，Code 29449-15))使颜色发生变化，测量595nm处的吸收值。使用AlbuminStandard(PIERCE Co.，No.23210)作出标准曲线。
上面酶溶液的谷胱甘肽合成酶活性是按照Gushima等的如下方法(T.Gushima et al.，J.Appl.Biochem.，5，210(1983))测定的。100mMγ-谷氨酰半胱氨酸 100μl100mM MgCl2100μl50mM ATP 100μl100mM Gly100μl1MTris-HCl(pH8.0)85.5μl160mM PEP12.5μl1mg/ml PK2μl酶溶液(1到10mg蛋白)纯化的水总计 2mlPEP磷酸烯醇式丙酮酸(SIGMA Co.，Code P-7127)PK丙酮酸激酶(SIGMA Co.，Code P-1903)使具有如上组分的反应混合物30℃时在蛋白含量为1到10mg的酶存在的情况下反应0到2小时。反应混合物加入1/5当量的甲基丙酸烯终止反应并接着调pH值到8.0，检测生成的GSH含量。这时酶的活性低于可检测的下限而并未检测到。
接着，用类似方法检测ATCC15239Δgsh2细胞株的亲代ATCC15239株系的谷胱甘肽合成酶活性。结果ATCC15239株系的谷胱甘肽合成酶活性测定为0.383μmol-GSH/mg蛋白/小时。因此，利用本发明的DNA获得了修饰过的谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmolGSH/mg蛋白/小时或者更少的产朊假丝酵母。
工业适用性本发明提供了产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶基因和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因。通过使用本发明的基因繁殖的产朊假丝酵母，可以低成本地生产可用来提高食物的香气、味道等等的酵母提取物。
当用优选的具体实例对本发明进行了详细说明之后，很显然本领域的技术人员在不背离本发明的范围的情况下可以对它进行各种变化并使用其等效手段。每一份前面提及的文献，包括外国优先权文件JP2003-310084，在此完整引入作为参考。
序列表<110>Ajinomoto Go.，Inc.
<120>来自产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶编码基因<130>
<150>JP2003-310084<151>2003/09/02<160>56<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1571<212>DNA<213>产朊假丝酵母<220>
<221>CDS<222>(58)..(1485)<223>
<400>1aagtagccaa tacaaccagc aacacatccg cttgcttgag cgttgagatt gtgaaag 57atg agt att cct cag tta tct gag ggc cag gag gat gat ctg gtc cat 105Met Ser Ile Pro Gln Leu Ser Glu Gly Gln Glu Asp Asp Leu Val His1 5 10 15gca ttg cac cac tat gcc cta tcc aat ggg ttg gtg atg tat cca gtt 153Ala Leu His His Tyr Ala Leu Ser Asn Gly Leu Val Met Tyr Pro Val20 25 30gga ttt aag cca cac tcc cca gtc gct gct cca gta acg ttg tac cca 201Gly Phe Lys Pro His Ser Pro Val Ala Ala Pro Val Thr Leu Tyr Pro35 40 45aca cca ttc cct caa cag gcg ttt gag aag gcc cag atg gta cag gag 249Thr Pro Phe Pro Gln Gln Ala Phe Glu Lys Ala Gln Met Val Gln Glu50 55 60
aag ttc aat gaa ctc tac gct aag gtc tcg agt gat gtt gag tgg ctg 297Lys Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Lys Val Ser Ser Asp Val Glu Trp Leu65 70 75 80agt gct gtt tta gac tcg ttt gcc caa ttc gat gca gga ttc acc ggt 345Ser Ala Val Leu Asp Ser Phe Ala Gln Phe Asp Ala Gly Phe Thr Gly85 90 95aag cta tgg gag agt tac aag aag gca aag gaa att ggc att aag caa 393Lys Leu Trp Glu Ser Tyr Lys Lys Ala Lys Glu Ile Gly Ile Lys Gln100 105 110agc gtt tcc ctc ggt gtc ttt aga tcg gac tat atg ctt gat cat gac 441Ser Val Ser Leu Gly Val Phe Arg Ser Asp Tyr Met Leu Asp His Asp115 120 125caa atc aag cag gtt gaa ttc aac acc gtc agt gtg agc ttt gga gga 489Gln Ile Lys Gln Val Glu Phe Asn Thr Val Ser Val Ser Phe Gly Gly130 135 140cta agc acc aaa gtt ggt gat ttg cac aag tac ttg aat gac tct ggt 537Leu Sar Thr Lys Val Gly Asp Leu His Lys Tyr Leu Asn Asp Ser Gly145 150 155 160tac tac aca agt agt gct tca aag ttc tat aca gac gag aca atc ccg 585Tyr Tyr Thr Ser Ser Ala Ser Lys Phe Tyr Thr Asp Glu Thr Ile Pro165 170 175gtg tct gaa tct tct gta aag ctt gca gat ggt tta gct gat ggt gtt 633Val Ser Glu Ser Ser Val Lys Leu Ala Asp Gly Leu Ala Asp Gly Val180 185 190aag cac tat aac aag agc cag ggc acc aag gat acc gtt gtg ctt gtt 681Lys His Tyr Asn Lys Ser Gln Gly Thr Lys Asp Thr Val Val Leu Val195 200 205att gtt caa gaa ggt gag cgt aat gtc ttt gat caa cgt cat ttg gaa 729Ile Val Gln Glu Gly Glu Arg Asn Val Phe Asp Gln Arg His Leu Glu210 215 220tac tca ctg tta aaa aac cac gga atc gta tca cgt cgt atc acg tta 777Tyr Ser Leu Leu Lys Asn His Gly lle Val Ser Arg Arg Ile Thr Leu225 230 235 240cat gag ctt aca gat aag act cgt gtt gac cat gac cgt cgt ttg ttc 825His Glu Leu Thr Asp Lys Thr Arg Val Asp His Asp Arg Arg Leu Phe245 250 255ctg aac agc acg gat gag gaa gta tca gtt gtg tac ttt aga tcc gga 873Leu Asn Ser Thr Asp Glu Glu Val Ser Val Val Tyr Phe Arg Ser Gly260 265 270tat gca cca aca gac ttc aaa act gac cag gat tgg aca aac cgt gta 921Tyr Ala Pro Thr Asp Phe Lys Thr Asp Gln Asp Trp Thr Asn Arg Val
275 280 285acg ttg gag act aca ttg gcc atc aag gct cct tca ttg ctg acc cag 969Thr Leu Glu Thr Thr Leu Ala Ile Lys Ala Pro Ser Leu Leu Thr Gln290 295 300ttg agt ggt gca aag aaa att caa caa atc ttg acg gat gag aag gta1017Leu Ser Gly Ala Lys Lys Ile Gln Gln Ile Leu Thr Asp Glu Lys Val305 310 315 320ctc tcc aag ttt att aag tct gat gtc tcc gag ttg gtg tca aca ttt1065Leu Ser Lys Phe Ile Lys Ser Asp Val Ser Glu Leu Val Ser Thr Phe325 330 335gtc aag ata tac cca ttg gat ggt tca gat ctt ggt aaa gag gct aaa1113Val Lys Ile Tyr Pro Leu Asp Gly Ser Asp Leu Gly Lys Glu Ala Lys340 345 350aga ctg gca ttt gag tct cca gag gag tac gtg ttg aag cct cag cat1161Arg Leu Ala Phe Glu Ser Pro Glu Glu Tyr Val Leu Lys Pro Gln His355 360 365gaa ggt ggt ggt aat aac att tac aaa gaa gat ata cct ggt ttc tta1209Glu Gly Gly Gly Asn Asn Ile Tyr Lys Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu370 375 380aga tct att cca gaa gat gaa tgg caa gga tac att cta atg caa ttg1257Arg Ser Ile Pro Glu Asp Glu Trp Gln Gly Tyr Ile Leu Met Gln Leu385 390 395 400atc cat cca cct ctg aat aag aat aaa ctc gtc cgt gag ggt gag gta1305Ile His Pro Pro Leu Asn Lys Asn Lys Leu Val Arg Glu Gly Glu Val405 410 415ttt aca gat gag ata gtt tct gag ctt ggc cgt ttc ggc acc atc tta1353Phe Thr Asp Glu Ile Val Ser Glu Leu Gly Arg Phe Gly Thr Ile Leu420 425 430ttc gac caa tcg act ggt gag gtt atc aaa aac tct gat gct ggc tgg1401Phe Asp Gln Ser Thr Gly Glu Val Ile Lys Asn Ser Asp Ala Gly Trp435 440 445ttg ttg aga tcg aaa ttc tca agc tcc aac gaa ggt ggt gtt gct gca1449Leu Leu Arg Ser Lys Phe Ser Ser Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala450 455 460ggg ttt gga tgt gtt gat ggt gtt gct ctc caa tag atggagccgc 1495Gly Phe Gly Cys Val Asp Gly Val Ala Leu Gln465 470 475atttagatat ccacctcacg aattagaatt ccttcgtctc cttttccgag ggctccaaaa 1555aaaaaaaaaa aaaaaa 1571
<210>2<211>475<212>PRT<213>产朊假丝酵母<400>2Met Ser Ile Pro Gln Leu Ser Glu Gly Gln Glu Asp Asp Leu Val His1 5 10 15Ala Leu His His Tyr Ala Leu Ser Asn Gly Leu Val Met Tyr Pro Val20 25 30Gly Phe Lys Pro His Ser Pro Val Ala Ala Pro Val Thr Leu Tyr Pro35 40 45Thr Pro Phe Pro Gln Gln Ala Phe Glu Lys Ala Gln Met Val Gln Glu50 55 60Lys Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Lys Val Ser Ser Asp Val Glu Trp Leu65 70 75 80Ser Ala Val Leu Asp Ser Phe Ala Gln Phe Asp Ala Gly Phe Thr Gly85 90 95Lys Leu Trp Glu Ser Tyr Lys Lys Ala Lys Glu Ile Gly Ile Lys Gln100 105 110Ser Val Ser Leu Gly Val Phe Arg Ser Asp Tyr Met Leu Asp His Asp115 120 125Gln Ile Lys Gln Val Glu Phe Asn Thr Val Ser Val Ser Phe Gly Gly130 135 140Leu Ser Thr Lys Val Gly Asp Leu His Lys Tyr Leu Asn Asp Ser Gly145 150 155 160Tyr Tyr Thr Ser Ser Ala Ser Lys Phe Tyr Thr Asp Glu Thr Ile Pro165 170 175Val Ser Glu Ser Ser Val Lys Leu Ala Asp Gly Leu Ala Asp Gly Val180 185 190Lys His Tyr Asn Lys Ser Gln Gly Thr Lys Asp Thr Val Val Leu Val195200 205Ile Val Gln Glu Gly Glu Arg Asn Val Phe Asp Gln Arg His Leu Glu210 215 220Tyr Ser Leu Leu Lys Asn His Gly Ile Val Ser Arg Arg Ile Thr Leu225 230 235 240His Glu Leu Thr Asp Lys Thr Arg Val Asp His Asp Arg Arg Leu Phe245 250 255Leu Asn Ser Thr Asp Glu Glu Val Ser Val Val Tyr Phe Arg Ser Gly260 265 270Tyr Ala Pro Thr Asp Phe Lys Thr Asp Gln Asp Trp Thr Asn Arg Val
275 280 285Thr Leu Glu Thr Thr Leu Ala Ile Lys Ala Pro Ser Leu Leu Thr Gln290 295 300Leu Ser Gly Ala Lys Lys Ile Gln Gln Ile Leu Thr Asp Glu Lys Val305 310 315 320Leu Ser Lys Phe Ile Lys Ser Asp Val Ser Glu Leu Val Ser Thr Phe325 330 335Val Lys Ile Tyr Pro Leu Asp Gly Ser Asp Leu Gly Lys Glu Ala Lys340 345 350Arg Leu Ala Phe Glu Ser Pro Glu Glu Tyr Val Leu Lys Pro Gln His355 360 365Glu Gly Gly Gly Asn Asn Ile Tyr Lys Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu370 375 380Arg Ser Ile Pro Glu Asp Glu Trp Gln Gly Tyr Ile Leu Met Gln Leu385 390 395 400Ile His Pro Pro Leu Asn Lys Asn Lys Leu Val Arg Glu Gly Glu Val405 410 415Phe Thr Asp Glu Ile Val Ser Glu Leu Gly Arg Phe Gly Thr Ile Leu420 425 430Phe Asp Gln Ser Thr Gly Glu Val Ile Lys Asn Ser Asp Ala Gly Trp435 440 445Leu Leu Arg Ser Lys Phe Ser Ser Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala450 455 460Gly Phe Gly Cys Val Asp Gly Val Ala Leu Gln465 470 475<210>3<211>2224<212>DNA<213>产朊假丝酵母<220>
<221>CDS<222>(110)..(2101)<223>
<400>3gggtttgttg tctatcggct taaggtttag tcgggaggaa caagaagcga cacacacagc60gaaccgacac acttgggaac ccattgctta agctattgag taccatacg atg ggg ctg 118Met Gly Leu
1cta tca tta ggg act ccg ctt cct tgg gaa cag aca agg gag tac gcg 166Leu Ser Leu Gly Thr Pro Leu Pro Trp Glu Gln Thr Arg Glu Tyr Ala5 10 15gag cac gtc cgc act gag ggt atc gaa cag ttg atc aag atg ttc aag 214Glu His Val Arg Thr Glu Gly Ile Glu Gln Leu Ile Lys Met Phe Lys20 25 30 35gct gca tat gca aga acc ggt gat ggc tat cta tgg gga gac gaa gtg 262Ala Ala Tyr Ala Arg Thr Gly Asp Gly Tyr Leu Trp Gly Asp Glu Val40 45 50gag tat acc ctg gtc aag ttt gat cat ggt cgt ggt ctt gct ctg ttg 310Glu Tyr Thr Leu Val Lys Phe Asp His Gly Arg Gly Leu Ala Leu Leu55 60 65agt atc gat aag gac agc gta ttg gct gat ctc aac gag ggc gga tca 358Ser Ile Asp Lys Asp Ser Val Leu Ala Asp Leu Asn Glu Gly Gly Ser70 75 80ctg gca cag ttg tct gtg gac aat gat ctc aac ttc cac ccg gaa tat 406Leu Ala Gln Leu Ser Val Asp Asn Asp Leu Asn Phe His Pro Glu Tyr85 90 95ggc cgc ttc atg ctg gag gcg aca ccg ctg gct ccg tac aac ggt gat 454Gly Arg Phe Met Leu Glu Ala Thr Pro Leu Ala Pro Tyr Asn Gly Asp100 105 110 115tcg ctg gag aac tac ttg tac gtg gag agg aac atg aac agc aga aga 502Ser Leu Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Glu Arg Asn Met Asn Ser Arg Arg120 125 130tca gtg gcg cag act gcg att gct gac ggc acc atc aag ccg ttg acc 550Ser Val Ala Gln Thr Ala Ile Ala Asp Gly Thr Ile Lys Pro Leu Thr135 140 145ata acg gtg tac cca ttg atg ggc atc aac acc ttc acc ttc cca tca 598Ile Thr Val Tyr Pro Leu Met Gly Ile Asn Thr Phe Thr Phe Pro Ser150 155 160gcg gtg gct aac ggc gag gca tca caa tcg ctg ttc tta ccg gat gag 646Ala Val Ala Asn Gly Glu Ala Ser Gln Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu165 170 175atc atc aac aga cat gcg aga ttc cca aca ttg acg gcc aac att cgg 694Ile Ile Asn Arg His Ala Arg Phe Pro Thr Leu Thr Ala Asn Ile Arg180 185 190 195aaa cgc cgt ggt gag aag gtg gcc atc aac gta ccg ctc tac aag gat 742Lys Arg Arg Gly Glu Lys Val Ala Ile Asn Val Pro Leu Tyr Lys Asp200 205 210aca aat acg tta tcc att gac gag tca att cca aag gga cgc tcc ctg 790
Thr Asn Thr Leu Ser Ile Asp Glu Ser Ile Pro Lys Gly Arg Ser Leu215 220 225ttc aag cac gac gaa gaa cca gag ctc ggt gca gca ctg cca ggg cat 838Phe Lys His Asp Glu Glu Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Pro Gly His230 235 240ata tac atg gac tcc atg gga ttc ggt atg gga tgc tca tgt cta caa 886Ile Tyr Met Asp Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gln245 250 255gta aca gtg caa gca cca aac ttg aac aga gct cgt tac ctc tat gat 934Val Thr Val Gln Ala Pro Asn Leu Asn Arg Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp260 265 270 275tca tgg gct aat ttt gca cca ttg ttc cta gca ttg acg gca gca gcg 982Ser Trp Ala Asn Phe Ala Pro Leu Phe Leu Ala Leu Thr Ala Ala Ala280 285 290cca gtg ttc aaa ggc cac tta gct gac cag gat gtc aga tgg aac gtc1030Pro Val Phe Lys Gly His Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg Trp Asn Val295 300 305att tct ggt gct gtt gat gat cgt act gcc tac gag cgt gat gtt aag1078Ile Ser Gly Ala Val Asp Asp Arg Thr Ala Tyr Glu Arg Asp Val Lys310 315 320cct ctg cat agc gat ggc gca ttt ggt gga atg aca gac gaa gcc aaa1126Pro Leu His Ser Asp Gly Ala Phe Gly Gly Met Thr Asp Glu Ala Lys325 330 335gct cgg gct cag aag atc cct aaa tct cgt tac gat ggc atc gat tct1174Ala Arg Ala Gln Lys Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Asp Gly Ile Asp Ser340 345 350 355ttc ctt ggt gat att cag aac gat ttc gca aaa gat ggg gaa gca gtg1222Phe Leu Gly Asp Ile Gln Asn Asp Phe Ala Lys Asp Gly Glu Ala Val360 365 370ttc aag tac ttc tct cca gag ttg aac gac atc agc cct cca atc aac1270Phe Lys Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Asn Asp Ile Ser Pro Pro Ile Asn375 380 385gag agg acg cta cag aga ctc gca cag gaa cct cag ttt gac cct gtc1318Glu Arg Thr Leu Gln Arg Leu Ala Gln Glu Pro Gln Phe Asp Pro Val390 395 400ctt gct cgt cac ttt gca cac ttg tac gtt cgt gat cca att gtg ata1366Leu Ala Arg His Phe Ala His Leu Tyr Val Arg Asp Pro Ile Val Ile405 410 415ttc gaa gaa cgt ata cac caa gac aat gac gat gaa acg gat cac ttt1414Phe Glu Glu Arg Ile His Gln Asp Asn Asp Asp Glu Thr Asp His Phe420 425 430 435
gag aac att caa tcc act aat tgg cag acg ttg agg ttc aag cca cca1462Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu Arg Phe Lys Pro Pro440 445 450act caa cag gca aca ccg gat aac aaa tcc gtt cca gga tgg aga gtg1510Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Asn Lys Ser Val Pro Gly Trp Arg Val455 460 465gaa ttc aga aca atg gag atc cag ctc aca gat ttt gag aat gct gct1558Glu Phe Arg Thr Met Glu Ile Gln Leu Thr Asp Phe Glu Asn Ala Ala470 475 480ttc tca atc ttc att gtt ctc ctg gga cag gca ata ctt gcg aca gat1606Phe Ser Ile Phe Ile Val Leu Leu Gly Gln Ala Ile Leu Ala Thr Asp485 490 495tcc aac tgg tac att cca atc tcc aag att gaa gat aac atg aaa cgt1654Ser Asn Trp Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Ile Glu Asp Asn Met Lys Arg500 505 510 515gca cat cac agg gac gca gta ttg aag gac aag ttc cat ttc aaa gct1702Ala His His Arg Asp Ala Val Leu Lys Asp Lys Phe His Phe Lys Ala520 525 530gat atc agc tcg cca gca ttc gac acg gtg gag ctg tca ctg gac gag1750Asp Ile Ser Ser Pro Ala Phe Asp Thr Val Glu Leu Ser Leu Asp Glu535 540 545att gtc aat ggc tgc gat agc ttt atc gga ttg atg gca ctt gtg aag1798Ile Val Asn Gly Cys Asp Ser Phe Ile Gly Leu Met Ala Leu Val Lys550 555 560aag cac ttg gaa tct cgc ttt gga att act ggt gac gac tta tcg cca1846Lys His Leu Glu Ser Arg Phe Gly Ile Thr Gly Asp Asp Leu Ser Pro565 570 575aag ggt aca cac gct agg atc tac tac tac ttg gaa ttg atc tcc aag1894Lys Gly Thr His Ala Arg Ile Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu Ile Ser Lys580 585 590 595aga gcc agt ggc gag cta cca act gct gct aaa ttc ata aga agg ttc1942Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe Ile Arg Arg Phe600 605 610ttg ctc gac cat aag gac tat caa cac gac tcc aaa ata act gct aga1990Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gln His Asp Ser Lys Ile Thr Ala Arg615 620 625atg aat tac gat ttg ttg aac acg ttg aat agc att tca gaa ctt ggc2038Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr Leu Asn Ser Ile Ser Glu Leu Gly630 635 640gaa gat gtt aga cag ttg ttg ggt gat gac att ggc aac tac ttg ata2086Glu Asp Val Arg Gln Leu Leu Gly Asp Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Ile
645 650 655aac aac cca aag gct taatgacact aagggggagg aaactcgcca ttttgcatat2141Asn Asn Pro Lys Ala660aaacatagac aacgtcctat acagtattta attataaaag agttcagctc gtgatatcga 2201tggatatgac gaccaagaca gct 2224<210>4<211>664<212>PRT<213>产朊假丝酵母<400>4Met Gly Leu Leu Ser Leu Gly Thr Pro Leu Pro Trp Glu Gln Thr Arg1 5 10 15Glu Tyr Ala Glu His Val Arg Thr Glu Gly Ile Glu Gln Leu Ile Lys20 25 30Met Phe Lys Ala Ala Tyr Ala Arg Thr Gly Asp Gly Tyr Leu Trp Gly35 40 45Asp Glu Val Glu Tyr Thr Leu Val Lys Phe Asp His Gly Arg Gly Leu50 55 60Ala Leu Leu Ser Ile Asp Lys Asp Ser Val Leu Ala Asp Leu Asn Glu65 70 75 80Gly Gly Ser Leu Ala Gln Leu Ser Val Asp Asn Asp Leu Asn Phe His85 90 95Pro Glu Tyr Gly Arg Phe Met Leu Glu Ala Thr Pro Leu Ala Pro Tyr100 105 110Asn Gly Asp Ser Leu Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Glu Arg Asn Met Asn115 120 125Ser Arg Arg Ser Val Ala Gln Thr Ala Ile Ala Asp Gly Thr Ile Lys130 135 140Pro Leu Thr Ile Thr Val Tyr Pro Leu Met Gly Ile Asn Thr Phe Thr145 150 155 160Phe Pro Ser Ala Val Ala Asn Gly Glu Ala Ser Gln Ser Leu Phe Leu165 170 175Pro Asp Glu Ile Ile Asn Arg His Ala Arg Phe Pro Thr Leu Thr Ala180 185 190Asn Ile Arg Lys Arg Arg Gly Glu Lys Val Ala Ile Asn Val Pro Leu195 200 205Tyr Lys Asp Thr Asn Thr Leu Ser Ile Asp Glu Ser Ile Pro Lys Gly
210 215 220Arg Ser Leu Phe Lys His Asp Glu Glu Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu225 230 235 240Pro Gly His Ile Tyr Met Asp Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser245 250 255Cys Leu Gln Val Thr Val Gln Ala Pro Asn Leu Asn Arg Ala Arg Tyr260 265 270Leu Tyr Asp Ser Trp Ala Asn Phe Ala Pro Leu Phe Leu Ala Leu Thr275 280 285Ala Ala Ala Pro Val Phe Lys Gly His Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg290 295 300Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala Val Asp Asp Arg Thr Ala Tyr Glu Arg305 310 315 320Asp Val Lys Pro Leu His Ser Asp Gly Ala Phe Gly Gly Met Thr Asp325 330 335Glu Ala Lys Ala Arg Ala Gln Lys Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Asp Gly340 345 350Ile Asp Ser Phe Leu Gly Asp Ile Gln Asn Asp Phe Ala Lys Asp Gly355 360 365Glu Ala Val Phe Lys Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Asn Asp Ile Ser Pro370 375 380Pro Ile Asn Glu Arg Thr Leu Gln Arg Leu Ala Gln Glu Pro Gln Phe385 390 395 400Asp Pro Val Leu Ala Arg His Phe Ala His Leu Tyr Val Arg Asp Pro405 410 415Ile Val Ile Phe Glu Glu Arg Ile His Gln Asp Asn Asp Asp Glu Thr420 425 430Asp His Phe Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu Arg Phe435 440 445Lys Pro Pro Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Asn Lys Ser Val Pro Gly450 455 460Trp Arg Val Glu Phe Arg Thr Met Glu Ile Gln Leu Thr Asp Phe Glu465 470 475 480Asn Ala Ala Phe Ser Ile Phe Ile Val Leu Leu Gly Gln Ala Ile Leu485 490 495Ala Thr Asp Ser Asn Trp Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Ile Glu Asp Asn500 505 510Met Lys Arg Ala His His Arg Asp Ala Val Leu Lys Asp Lys Phe His515 520 525Phe Lys Ala Asp Ile Ser Ser Pro Ala Phe Asp Thr Val Glu Leu Ser530 535 540
Leu Asp Glu Ile Val Asn Gly Cys Asp Ser Phe Ile Gly Leu Met Ala545 550 555 560Leu Val Lys Lys His Leu Glu Ser Arg Phe Gly Ile Thr Gly Asp Asp565 570 575Leu Ser Pro Lys Gly Thr His Ala Arg Ile Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu580 585 590Ile Ser Lys Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe Ile595 600 605Arg Arg Phe Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gln His Asp Ser Lys Ile610 615 620Thr Ala Arg Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr Leu Asn Ser Ile Ser625 630 635 640Glu Leu Gly Glu Asp Val Arg Gln Leu Leu Gly Asp Asp Ile Gly Asn645 650 655Tyr Leu Ile Asn Asn Pro Lys Ala660<210>5<211>9<212>PRT<213>产朊假丝酵母<400>5Gln Glu Val Ala Val Val Tyr Tyr Arg1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>产朊假丝酵母<400>6Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln1 5<210>7
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<220>
<223>引物<400>33tgatcttctg ctgttcatgtt21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>34ctccacgtac aagtagttctc21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>35cagcgaatca ccgttgtacgg21<210>36<211>18<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>36
agccagcggt gtcgcctc 18<210>37<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>37gggtttgttg tctatcggcttaag24<210>38<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>38agctgtcttg gtcgtcatat ccat 24<210>39<211>2160<212>DNA<213>酿酒酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(2034)<223>
<400>39atg gga ctc tta gct ttg ggc acg cct ttg cag tgg ttt gag tct agg 48Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gln Trp Phe Glu Ser Arg1 5 10 15
acg tac aat gaa cac ata agg gat gaa ggt atc gag cag ttg ttg tat 96Thr Tyr Asn Glu His Ile Arg Asp Glu Gly Ile Glu Gln Leu Leu Tyr20 25 30att ttc caa gct gct ggt aaa aga gac aat gac cct ctt ttt tgg gga 144Ile Phe Gln Ala Ala Gly Lys Arg Asp Asn Asp Pro Leu Phe Trp Gly35 40 45gac gag ctt gag tac atg gtt gta gat ttt gat gat aag gag aga aat 192Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn50 55 60tct atg ctc gac gtt tgc cat gac aag ata ctc act gag ctt aat atg 240Ser Met Leu Asp Val Cys His Asp Lys Ile Leu Thr Glu Leu Asn Met65 70 75 80gag gat tcg tcc ctt tgt gag gct aac gat gtg agt ttt cac cct gag 288Glu Asp Ser Ser Leu Cys Glu Ala Asn Asp Val Ser Phe His Pro Glu85 90 95tat ggc cgg tat atg tta gag gca aca cca gct tct cca tat ttg aat 336Tyr Gly Arg Tyr Met Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Asn100 105 110tac gtg ggt agt tac gtt gag gtt aac atg caa aaa aga cgt gcc att 384Tyr Val Gly Ser Tyr Val Glu Val Asn Met Gln Lys Arg Arg Ala Ile115 120 125gca gaa tat aag cta tct gaa tat gcg aga caa gat agt aaa aat aac 432Ala Glu Tyr Lys Leu Ser Glu Tyr Ala Arg Gln Asp Ser Lys Asn Asn130 135 140ttg cat gtg ggc tcc agg tct gtc cct ttg acg ctg act gtc ttc ccg 480Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Phe Pro145 150 155 160agg atg gga tgc ccc gac ttt att aac att aag gat ccg tgg aat cat 528Arg Met Gly Cys Pro Asp Phe Ile Asn Ile Lys Asp Pro Trp Asn His165 170 175aaa aat gcc gct tcc agg tct ctg ttt tta ccc gat gaa gtc att aac 576Lys Asn Ala Ala Ser Arg Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu Val Ile Asn180 185 190aga cat gtc agg ttt cct aac ttg aca gca tcc atc agg acc agg cgt 624Arg His Val Arg Phe Pro Asn Leu Thr Ala Ser Ile Arg Thr Arg Arg195 200 205ggt gaa aaa gtt tgc atg aat gtt ccc atg tat aaa gat ata gct act 672Gly Glu Lys Val Cys Met Asn Val Pro Met Tyr Lys Asp Ile Ala Thr210 215 220cca gaa acg gat gac tcc atc tac gat cga gat tgg ttt tta cca gaa 720Pro Glu Thr Asp Asp Ser Ile Tyr Asp Arg Asp Trp Phe Leu Pro Glu
225 230 235 240gac aaa gag gcg aaa ctg gct tcc aaa ccg ggt ttc att tat atg gat 768Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ala Ser Lys Pro Gly Phe Ile Tyr Met Asp245 250 255tcc atg ggt ttt ggc atg ggc tgt tcg tgc tta caa gtg acc ttt cag 816Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gln Val Thr Phe Gln260 265 270gca ccc aat atc aac aag gca cgt tac ctg tac gat gca tta gtg aat 864Ala Pro Asn Ile Asn Lys Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Ala Leu Val Asn275 280 285ttt gca cct ata atg cta gcc ttc tct gcc gct gcg cct gct ttt aaa 912Phe Ala Pro Ile Met Leu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Pro Ala Phe Lys290 295 300ggt tgg cta gcc gac caa gat gtt cgt tgg aat gtg ata tct ggt gcg 960Gly Trp Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala305 310 315 320gtg gac gac cgt act ccg aag gaa aga ggt gtt gcg cca tta cta ccc1008Val Asp Asp Arg Thr Pro Lys Glu Arg Gly Val Ala Pro Leu Leu Pro325 330 335aaa tac aac aag aac gga ttt gga ggc att gcc aaa gac gta caa gat1056Lys Tyr Asn Lys Asn Gly Phe Gly Gly Ile Ala Lys Asp Val Gln Asp340 345 350aaa gtc ctt gaa ata cca aag tca aga tat agt tcg gtt gat ctt ttc1104Lys Val Leu Glu Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Ser Ser Val Asp Leu Phe355 360 365ttg ggt ggg tcg aaa ttt ttc aat agg act tat aac gac aca aat gta1152Leu Gly Gly Ser Lys Phe Phe Asn Arg Thr Tyr Asn Asp Thr Asn Val370 375 380cct att aat gaa aaa gta tta gga cga cta cta gag aat gat aag gcg1200Pro Ile Asn Glu Lys Val Leu Gly Arg Leu Leu Glu Asn Asp Lys Ala385 390 395 400cca ctg gac tat gat ctt gct aaa cat ttt gcg cat ctc tac ata aga1248Pro Leu Asp Tyr Asp Leu Ala Lys His Phe Ala His Leu Tyr Ile Arg405 410 415gat cca gta tct aca ttc gaa gaa ctg ttg aat cag gac aac aaa acg1296Asp Pro Val Ser Thr Phe Glu Glu Leu Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr420 425 430tct tca aat cac ttt gaa aac atc caa agt aca aat tgg cag aca tta1344Ser Ser Asn His Phe Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu435 440 445cgt ttt aaa ccc ccc aca caa caa gca acc ccg gac aaa aag gat tct1392
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tca ata gaa agc aaa tgt taaactcctt ttacttcggt tgtgaaagaa 2064Ser Ile Glu Ser Lys Cys675agttgacatt atcgatttgg gtgacacggt gattgaaaaa gcaacgacca gtattatacc 2124tctttttttt attattcagt ttatattttt gcaagt2160<210>40<211>678<212>PRT<213>酿酒酵母<400>40Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gln Trp Phe Glu Ser Arg1 5 10 15Thr Tyr Asn Glu His Ile Arg Asp Glu Gly Ile Glu Gln Leu Leu Tyr20 25 30Ile Phe Gln Ala Ala Gly Lys Arg Asp Asn Asp Pro Leu Phe Trp Gly35 40 45Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn50 55 60Ser Met Leu Asp Val Cys His Asp Lys Ile Leu Thr Glu Leu Asn Met65 70 75 80Glu Asp Ser Ser Leu Cys Glu Ala Asn Asp Val Ser Phe His Pro Glu85 90 95Tyr Gly Arg Tyr Met Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Asn100 105 110Tyr Val Gly Ser Tyr Val Glu Val Asn Met Gln Lys Arg Arg Ala Ile115 120 125Ala Glu Tyr Lys Leu Ser Glu Tyr Ala Arg Gln Asp Ser Lys Asn Asn130 135 140Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Phe Pro145 150 155 160Arg Met Gly Cys Pro Asp Phe Ile Asn Ile Lys Asp Pro Trp Asn His165 170 175Lys Asn Ala Ala Ser Arg Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu Val Ile Asn180 185 190Arg His Val Arg Phe Pro Asn Leu Thr Ala Ser Ile Arg Thr Arg Arg195 200 205Gly Glu Lys Val Cys Met Asn Val Pro Met Tyr Lys Asp Ile Ala Thr210 215 220
Pro Glu Thr Asp Asp Ser Ile Tyr Asp Arg Asp Trp Phe Leu Pro Glu225 230 235 240Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ala Ser Lys Pro Gly Phe Ile Tyr Met Asp245 250 255Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gln Val Thr Phe Gln260 265 270Ala Pro Asn Ile Asn Lys Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Ala Leu Val Asn275 280 285Phe Ala Pro Ile Met Leu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Pro Ala Phe Lys290 295 300Gly Trp Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala305 310 315 320Val Asp Asp Arg Thr Pro Lys Glu Arg Gly Val Ala Pro Leu Leu Pro325 330 335Lys Tyr Asn Lys Asn Gly Phe Gly Gly Ile Ala Lys Asp Val Gln Asp340 345 350Lys Val Leu Glu Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Ser Ser Val Asp Leu Phe355 360 365Leu Gly Gly Ser Lys Phe Phe Asn Arg Thr Tyr Asn Asp Thr Asn Val370 375 380Pro lle Asn Glu Lys Val Leu Gly Arg Leu Leu Glu Asn Asp Lys Ala385 390 395 400Pro Leu Asp Tyr Asp Leu Ala Lys His Phe Ala His Leu Tyr Ile Arg405 410 415Asp Pro Val Ser Thr Phe Glu Glu Leu Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr420 425 430Ser Ser Asn His Phe Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu435 440 445Arg Phe Lys Pro Pro Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Lys Lys Asp Ser450 455 460Pro Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg Pro Phe Glu Val Gln Leu Leu Asp465 470 475 480Phe Glu Asn Ala Ala Tyr Ser Val Leu Ile Tyr Leu Ile Val Asp Ser485 490 495Ile Leu Thr Phe Ser Asp Asn Ile Asn Ala Tyr Ile His Met Ser Lys500 505 510Val Trp Glu Asn Met Lys Ile Ala His His Arg Asp Ala Ile Leu Phe515 520 525Glu Lys Phe His Trp Lys Lys Ser Phe Arg Asn Asp Thr Asp Val Glu530 535 540Thr Glu Asp Tyr Ser Ile Ser Glu Ile Phe His Asn Pro Glu Asn Gly
545 550 555 560Ile Phe Pro Gln Phe Val Thr Pro Ile Leu Cys Gln Lys Gly Phe Val565 570 575Thr Lys Asp Trp Lys Glu Leu Lys His Ser Ser Lys His Glu Arg Leu580 585 590Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu Ile Ser Asp Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro595 600 605Thr Thr Ala Lys Phe Phe Arg Asn Phe Val Leu Gln His Pro Asp Tyr610 615 620Lys His Asp Ser Lys Ile Ser Lys Ser Ile Asn Tyr Asp Leu Leu Ser625 630 635 640Thr Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Asp Asp Ser Lys Gly Glu Leu Thr645 650 655Ser Phe Leu Gly Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Val Lys Lys Asn Lys Pro660 665 670Ser Ile Glu Ser Lys Cys675<210>41<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>41gtggacgacc gtactccgaag 21<210>42<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>42acccaaatcg ataatgtcaac 21
<210>43<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>43cttttcttgg gtgggtagta atttttcaat aggact 36<210>44<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>44agtcctattg aaaaattact acccacccaa gaaaag 36<210>45<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>45agattgggta ccatgagtat tcctcagtta tctg34<210>46<211>33<212>DNA
<213>人工<220>
<223>引物<400>46atccggtcta gactattgga gagcaacacc atc 33<210>47<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>47gagtacggta ccatggggct gctatcatta gggac 35<210>48<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>48cccttatcta gattaagcct ttgggttgtt tatc 34<210>49<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物
<400>49ggttctaaga agattcagca 20<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50ccctcggaaa aggagacgaa gg 22<210>51<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51gaagcctcag catgaagctt gtggtaataa catttac 37<210>52<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52gtaaatgtta ttaccacaag cttcatgctg aggcttc 37<210>53<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53cgaccaatcg actggtaccg ttatcaaaaa ctctg 35<210>54<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54cagagttttt gataacggta ccagtcgatt ggtcg 35<210>55<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55cccaagcttc tctacttgct tctgctcaac 30<210>56<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56gcaggtacca acttccgaaa acagtaatga ac 3权利要求
1.编码定义为如下(A)或(B)的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有包括一个或几个氨基酸替代、缺失、插入或添加的SEQ IDNO2的氨基酸序列，并且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。
2.权利要求1中的DNA，其定义为如下(a)或(b)(a)含有SEQ ID NO1中从58到1485位核苷酸的核苷酸序列的DNA；(b)能与含有SEQ ID NO1中从58到1485位核苷酸的序列的DNA或者与由所说的核苷酸序列制得的探针在严苛的条件下相杂交的DNA，并且它们编码有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。
3.用权利要求1或2中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少。
4.用权利要求1或2中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性增加。
5.用下述(c)或(d)中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少(c)含有SEQ ID NO1中从58到981位核苷酸的核苷酸序列的DNA；(d)能与含有SEQ ID NO1中从58到981位核苷酸的序列的DNA或者与由所述的核苷酸序列制得的探针在严苛的条件下相杂交的DNA。
6.权利要求3到5任一项中的产朊假丝酵母，其中用SEQ ID NO3的DNA进一步修饰产朊假丝酵母以使其γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性提高。
7.食物或饮料，其含有可通过培养权利要求3到6任一项中的产朊假丝酵母所得到的培养物，包含谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸的所述培养物的级分，或者谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸中γ位谷氨酸经过热处理或酶处理而释放的所述培养物或级分。
8.通过由培养权利要求3到6任一项中的产朊假丝酵母得到的培养物生产的酵母提取物。
9.生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食物的方法，该方法包括培养权利要求3到6任一项中的产朊假丝酵母，将得到的培养物或者其级分，或者经过热处理的培养物或其级分与食物或饮料的原料混合来加工食物或饮料。
全文摘要
本发明提供源自产朊假丝酵母的编码谷胱甘肽合成酶的基因，而且，通过在适宜条件下培养经过谷胱甘肽合成酶编码基因修饰的产朊假丝酵母并且将得到的培养物或者其级分或者经过热处理的培养物或其级分与食物或饮料的原料混合来加工食物或饮料，从而进行含有γ－谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸、或半胱氨酰甘氨酸的食物的生产。
文档编号C12P13/12GK1661015SQ20041007515
公开日2005年8月31日 申请日期2004年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者西内博章, 西村康史 申请人:味之素株式会社