专利名称：植物毛状体特异表达的基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域，具体地讲，涉及一个基因启动子。
背景技术：
植物基因的表达与其它真核生物一样是在DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平等多个层次上进行调控的。从效果上来看，转录水平上的调控是最为经济和有效的，因此转录调控是控制植物基因表达的最重要的方式。基因转录为mRNA受到基因某个区域的调控，这个位于转录起始位点之前的调控基因转录的区域通常被称为启动子。靠近转录起始位点近端区域构成“核心启动子区”(core promoter region)；其中通常含有TATA盒和CAAT盒序列，以及转录起始位点。核心启动子区通常与各种转录因子以及一些辅助蛋白结合，形成转录起始复合物。位于核心启动子区上游的是基因表达调控序列，包含许多不同的调节元件，决定着基因表达的水平，表达的时间与空间方式，以及基因的诱导表达方式。使用重组DNA方法进行启动子的修饰可获得选择性的基因表达模式。
根据以前的研究，驱动基因在植物毛状体中表达的启动子有棉花脂质转移蛋白(cotton lipid transfer protein)基因LPT3、LPT6启动子(Liu et al.，BBA 1487106-111，2000；Hsu et al.，Plant Sci 14363-70，1999)，烟草P450基因CYP71D16启动子(Wang et al.，J Exp Bot 531891-1897，2002)和棉花纤维基因RDL1启动子(Wang et al.，Plant Cell162323-2334，2004)。这些启动子都能驱使GUS报告基因在毛状体中特异表达，但是这些启动子的核苷酸序列的相似性不大。不过这些启动子序列中都含有MYB识别元件，Wang等(2002)推测这些MYB识别元件与毛状体特异性表达有关，后来Wang等(2004)的研究表明L1框与MYB识别元件共同参与拟南芥毛状体中RDL1启动子的激活。
发明内容
本发明的目的是提供一种新克隆的蛋白酶抑制剂基因SaPIN2b启动子，用于驱动外源基因在转基因植物的毛状体中特异表达。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述启动子序列与所需的目的基因的编码区核苷酸序列连接后产生的基因的重组质粒。
本发明的另一个目的是提供一种由上述重组质粒转化的重组微生物。
本发明的另一个目的是提供上述重组微生物在转基因植物中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述重组质粒在转基因植物中的应用。
本发明从龙葵中分离克隆出一种蛋白酶抑制剂基因(SaPIN2b)启动子并对它进行序列分析，然后克隆到双元载体pBI101.1中并转化农杆菌A.tumefaciens LBA4404，接着用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草与龙葵。对获得的转基因植株T0和T1代进行组织化学染色分析表明，-1430至-9共1422bp长的启动子区域可驱使GUS报告基因在毛状体中特异表达。
蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor)广泛存在于自然界各种生物体尤其是植物中，在大多数植物的种子和块茎中，其含量可高达总蛋白的1％～10％。大量研究表明，蛋白酶抑制剂在植物防御昆虫和病原体侵染的天然防御系统中起着重要作用。因此，蛋白酶抑制剂广泛应用于植物抗虫基因工程中，如马铃薯PIN2。对马铃薯PIN2基因启动子的研究集中于机械致伤与化学分子诱导表达方面。龙葵蛋白酶抑制剂IIb(SaPIN2b)，属马铃薯PIN2一类，其启动子在受到致伤与化学分子诱导后，可明显增加所驱使的外源基因在叶中的表达。而在未受外界刺激时，SaPIN2b基因启动子可驱使外源基因在毛状体中特异表达。
本发明所提供的DNA序列，如SEQ ID NO1所示，代表的是龙葵SaPIN2b基因启动子序列。其序列从-1430至-9共1422bp，具有指导基因在植物毛状体中表达的能力。+30到+32为翻译起始密码子，-38到-32为推测的TATA框，假定的CAAT框位于-116到-113或者-51到-48的区段上。除此之外，该启动子还包含6个MYB识别元件和1个L1框，据Wang等(2004)的研究，推测很可能L1框(TAAATGTA，-103～-96)和位于-17到-12区段的MYB识别元件(TAACCA)使得该启动子具有驱使外源基因在毛状体表达的特性。
本发明所阐述的来自于SaPIN2b启动子区的序列可作为一个启动子元件插在DNA双元载体中而用于所有能够使用该启动子的植物(即该植物的RNA聚合酶能与本文公开的启动子序列结合)的转化来表达目的基因。在DNA构建体中，与该启动子连接的可以是任何目的基因序列；目的基因的DNA序列可以来自同源植物、外源植物、真菌、藻类、细菌、病毒或动物基因，也可以是人工设计、合成的DNA序列。这些序列可以是一段编码有功能的蛋白质或其一部分的正义序列或一段反义序列。可以利用多种转化手段将本发明所涉及的植物表达载体转入植物中，任何适合于植物或植物细胞的转化方法都可以使用。如使用农杆菌介导侵染法，电击法，基因枪轰击法，花粉管导入法，细胞和原生质体显微注射法等。被转化后的细胞在合适的条件下就可再生成完整的转基因植株。
本发明中使用GUS基因作为报告基因。GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，可以在体外催化裂解人工合成的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸)底物，产生深蓝色化合物沉淀于植物组织。
作为植物的第一道防线，毛状体通常通过空间阻隔、物理诱捕或分泌有毒化学物质来抵抗害虫攻击，因而在可持续虫害防治策略的发展中，以毛状体为基础的防御起着重要作用；腺体毛状体经常分泌多种有重要经济价值的产物，如化装品、芳香物质和树脂等等，所以，毛状体特异性表达的、并且在腺细胞中有高活力的启动子在生物工程中有着重要的经济利用价值。
本发明的有益效果本发明以毛状体特异性启动子来驱使外源基因表达的生物工程策略有如下几个优点1、对于植物来说，毛状体并非必需，它会将表达产物分泌出来存积在叶表面，这就避免了有毒物质或者是生长抑制剂在植物体内的聚积；2、毛状体特异性启动子把外源基因的表达局限在毛状体中，这就有效的避免了外源蛋白在谷物、果实等供人食用的器官中的积累；3、毛状体中特异表达和表达产物被分泌到叶表面存积，大大减少了产物存贮上的物理空间限制，从而有利于产物的高水平表达；4、因为产物被分泌到叶表存积，这就使得产物的回收纯化变得相对简单易行。
图1为双元载体pPBBS的构建流程图；图2为SaPIN2b基因启动子驱动的GUS报告基因在转基因烟草中(T0)的组织特异性表达分析；其中，图2中，A为叶表毛状体；B为叶柄毛状体；C为茎毛状体；D为花萼毛状体；E为花瓣毛状体；F为花芽上的毛状体；A-C取自生长在温室中苗期(30cm高)的转基因烟草；D-F取自生长在温室中开花期的转基因烟草。
具体实施例方式
实施例1采用接头连接PCR(Adaptor-ligation PCR)法进行基因组DNA步移，从龙葵基因组DNA中扩增并克隆出SaPIN2b基因启动子序列。基因组步移所用试剂盒为Clontech公司的GenomeWalkerTMKit。具体步骤如下1.龙葵基因组DNA的提取取5克龙葵叶于液氮中研磨成粉后转移到30ml离心管中，加入15ml提取缓冲液[100mM Tris(pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，500mM NaCl，10mM β-巯基乙醇]，混匀。接着向管中加入1ml 20％的SDS，充分混匀，于65℃温育10分钟。然后加入5ml 5M的乙酸钾，充分混匀后置于冰上20分钟。25000×g离心20分钟，取上清至另一干净离心管中，加入10ml的异丙醇，混匀后于-20℃静置30分钟。20000×g离心15分钟，去上清，DNA沉淀自然风干后溶于750μl TE[50mM Tris(pH 8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]。将上述DNA溶液转移到一Eppendorf管中，分别用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次。上清DNA溶液转移到另一Eppendorf管，再加入500μl异丙醇和75μl的NaAc(pH5.2)，混匀，于12000×g离心5分钟，沉淀用80％的乙醇洗涤，风干后溶于500μl TE(pH8.0)中。
2.基因组DNA的酶切消化和接头连接，构建“基因组文库”将提取的龙葵基因组DNA用产生平末端的限制性内切酶(DraI，EcoRV，StuI，PvuII)进行酶切。100μl酶切反应体系中加入8U(U为酶活力单位)的限制性内切酶，于37℃恒温过夜，然后用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次。将上清DNA溶液转移至Eppendorf管，向管中加入2倍体积的冰冷无水乙醇，1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和20μg的糖原，混匀。12000×g离心10分钟，沉淀所得DNA用80％的乙醇洗涤，风干后溶于20μl TE(pH7.5)。各自酶切后的基因组DNA分别与基因组步移接头进行连接，10μl反应体系中包含4μl纯化的酶切基因组DNA，1.9μl基因组步移接头(25μM)(接头长链5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’；接头短链5’-PO4-ACCAGCCC-NH2-3’)，1.6μl 10×连接缓冲液，0.5μl T4DNA连接酶(6U/μl)。混合液于16℃过夜反应后，于70℃保温5分钟以终止反应，得到“基因组文库”。
3.基因组DNA步移和扩增用上述构建好的“基因组文库”，进行PCR扩增，共两轮PCR。根据已测定的SaPIN2b cDNA(GenBank登录号为AF209709)序列，设计、合成基因特异引物2bGSP1和2bGSP2。
2bGSP15’-GGAGCCAAGTCCTCATGGATGATC-3’(24bp)2bGSP25’-GCAAGTATTTGGGTTTTTAGGGTCAGAACT-3’(30bp)。首轮PCR。50μl反应体系中包含5μl 10×PCR反应缓冲液(10mM)，2μl dNTP(10mM)，2.2μl MgAc2(25mM)，1μl接头引物1(AP1，10mM)(AP15’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)，1μl基因特异引物2bGSP1(10mM)(序列如上所示)，1μl Advantage GenomicPolymerase Mix，1μl DNA模板，36.8μl去离子水。PCR反应参数为(1)94℃25秒，72℃3分钟，7个循环；(2)94℃25秒，67℃3分钟，32个循环；(3)67℃保温7分钟。将首轮PCR产物稀释50倍，用于第二轮PCR。
第二轮PCR。50μl反应体系中包含5μl 10×PCR反应缓冲液，2μl dNTP(各10mM)，2.2μl MgAc2(25mM)，1μl接头引物2(AP2，10mM)(AP25’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’)，1μl基因特异引物2bGSP2(10mM)(序列如上所示)，1μl Advantage GenomicPolymerase Mix，1μl稀释了50倍的首轮PCR产物，36.8μl去离子水。PCR反应参数为(1)94℃25秒，72℃3分钟，5个循环；(2)94℃25秒，67℃3分钟，20个循环；(3)67℃保温7分钟。
4.序列测定及拼接第二轮PCR产物纯化回收后连接到pGEM-T Easy载体(Promega)上，转化大肠杆菌E.coli DH5a，在含有IPTG和X-gal的LB培养基上培养，挑选白色菌落并提取质粒DNA进行酶切鉴定。根据测序结果获得的SaPIN2b基因启动子序列见SEQ ID NO1。
通过对龙葵SaPIN2b基因进行RLM-5’RACE(RNAligase-mediated rapid amplification of 5’cDNA ends)分析，确定该基因的转录起始位点。
按照Invitrogen公司的RLM-5’RACE分析试剂盒推荐步骤扩增SaPIN2b cDNA的5’端用TRIzol试剂(Invitrogen)从龙葵花芽中提取总RNA；提取的总RNA用小牛肠磷酸酶CIP处理除去5’磷酸；然后用烟草酸性焦磷酸酶(TAP)处理，去除全长mRNA的5′端帽子结构；接着将GeneRacerTMRNA寡聚接头(5’-CGACUGGAGCACGA-GGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3’)连接到处理后的mRNA 5’端；以连好接头的mRNA为模板，用2bGSP1引物在SuperscriptTMII反转录酶催化下合成第一条cDNA链；以合成的cDNA链为模板，进行PCR扩增，50μl反应体系中包含5μl 10×PCR反应缓冲液，1μl dNTP(各10mM)，1μl 5’GeneRacerTM引物(5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’)，1μl 2bGSP2引物，1μl反转录后的cDNA，0.5μl Ex Tag酶(TaKaRa)，40.5μl灭菌水。反应参数为(1)94℃，2分钟，1个循环；(2)94℃30秒，62℃30秒，72℃80秒，35个循环；(3)72℃保温10分钟。扩增产物直接连接到pGEM-T Easy载体上，转化大肠杆菌E.coli DH5a，筛选阳性克隆，提取质粒酶切鉴定后测序，确定SaPIN2b基因的转录起始位点为SEQID NO1的“+1”位点的核苷酸“A”。
用龙葵SaPIN2b基因启动子-1430至-9共1422bp长片段与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因嵌合，转化烟草与龙葵，对所得到的转基因植株T0代与T1代进行组织化学染色分析，确定此启动子的表达模式，具体步骤如下。
1.双元表达载体的构建将PCR扩增出来的1422bp长的SaPIN2b启动子片段插入到pBI101.1的EcoRI和HindIII位点上，命名为pPBBS；用pPBBS转化大肠杆菌E.coli DH5a，筛选出阳性克隆；然后提取质粒转化农杆菌A.tumefaciens LBA4404。构建过程见图1。
2.农杆菌介导的烟草和龙葵转化首先从平板接种农杆菌单菌落于5ml YEB液体培养基(卡那霉素50μg/ml，利福平50μg/ml，链霉素200μg/ml)，28℃下180rpm振荡培养两天；然后用液体再生培养基稀释农杆菌液至OD600约为0.2～0.3(约稀释20倍)；将无菌的烟草和龙葵叶切至0.5cm2，放入稀释的农杆菌液中，轻摇5分钟后取出用无菌滤纸吸干叶片表面的液体后，平展于再生固体培养基平板上，共培养2-3天；将共培养后的叶片外植体用MS液体培养基漂洗5次，然后置于滤纸上吸干，并转移到再生培养基固体平板(卡那霉素100μg/ml，羧苄青霉素250μg/ml)上，28℃培养，每两周换一次培养基；4至6周后，切下1～2cm的小芽转移到组织培养瓶中生根壮苗，生根培养基中含100μg/ml的卡那霉素及100μg/ml的羧苄青霉素。
3.组织化学染色分析取新鲜样品置于X-gluc染色液
中，抽真空半个小时后37℃保温过夜。用70％，80％，95％乙醇梯度脱色，直到除去叶绿素。脱色后的样品在光学显微镜下观察拍照或置于50％甘油中保存。
通过对烟草、龙葵转基因植株T0代与T1代不同发育阶段的不同部位进行染色分析，表明GUS报告基因特异性地在毛状体中表达，在整个发育阶段都是如此。这表明，1422bp长的SaPIN2b基因启动子能驱使外源基因特异地在毛状体中表达。染色结果见图2。
UN3304~1.TXTSEQUENCE LISTING<110>中山大学<120>植物毛状体特异表达的基因启动子<130>
<160>2<170>
<210>1<211>1598<212>DNA<213>龙葵Solanum americanum<400>1ACCATAATAA TAATCTTACA CTTTTAAATT CTTTTGATCT ATAAATTTTT TCACTTCTAT-1509AAAAAAGAGT TACAATTATA GAATCTTATT CATCGACGAT CTCAACAACA TTGTCTCAAA-1449GTCTTCTTCA TCAATTTCGC CGTAACTTTG AATCAATTTT CAAATTTTCT TTGTCTTAAA-1389ATCTATTTTT TTAGAAGTTT TTTGTGATTT GAAGAACACA ACAATAATTG CTAAGTTATC-1329TCAAGTTTCT TATCTTCAAA ATATTTAACT TAGATTGTAA AGATATAATT CAACAGAAAA-1269AAATAACAAA AACAATAAAA ATAATTTACC GCACTAGAAC AAAATACATA TGTTATTTGA-1209AATAAAGCCT AAATTTCTAC AATAGCATAT TTGAGATACA GTATTTGTTT ACATTTGAAT-1149AGATATAGAA TTTATTATAG CATCAATTGT TGTGTTTTAA TAATTCTTTA TATATATATA-1089TATATATATA TAAAAAATTC TATTGATTGA CGTGATATAC ACGTGCAAAG CACGTACACT-1029AAACTAGTAA CTTATAAAAT ACCTGTAAAT TCTTTTTTAT TTTAGTTATT AGTTATTATT-969TTTCTTAAAT ATATACTTAG TTAGATGAAG TTTCATTGTA TAGTACTCCT ATTTATTCTA-909ACGGTTTAAA TGTTTTTAGA AAAGTCTCTC TCCCATATTA TTGTACGCTG CATCACTGCC-849TCAATTTTCT TCATATAGGT ATGGCGGTCC AATTTAGGCT GCCAAAAGTT TCTAATTGGG-789CCATCTGTTT AATTTACTAT TTGCAAAAAG TAATTTCTAT CCACTAAAAT TAGAGCATAT-729AAATCAAAAA TAAAATAAAA ATAAAAGCAA TGGGCAAATG GCAATTTTGT TCCTTGTATT-669ATTGGTTTAT TTTTATTTTC ATCTTTGTAT AATAGCTTTC AATTTATATA AATGTGTAAT-609TTTGATCCTC AAATTAATGG AAATTGAAAT TTTAAAGAAA TTATTAATTA AAAATAAATA-549AGAAAAGAGA AAAAGAAAAA TACATCCAAG GGTACTAAAT GCGCTTAAAG GGTCATATTT-489TTTAAAAAAA AATTCTATAT TTTATATTTA ACGATTGTGT TTAAATTTTT AAACGTTCGT-429TAGCGTGAAG AATCAAAATC GATCTTTTGT ATCAATGGTG GGTTAATTAT ACTTAATCGT-369ATCATATATA CCGGACCAAA AGTCCAAAAC TATAATAAAT TCTACTAACA TAAGGATTAA-309AATTGCAATT TCCCCTAAAG CTATATATTC AATAATTGAC TTCCAACTTA ATTATCACGT-249GGAGAAGAAA ATTGTTGGTA GATGACAATA ATTTCAAAAA ACAAGCAAGT CGTGGTCAGT-189ACAGCTTGCT ACGAAAAAGA AGAGGGAAGC GTAAGTACCT TGCCAAACTA GTTACACTAA-129AGTCCTTTTT ATCAATTAGA GGACATAAAT GTAATATTAA TGTGAAAAAA TAATTTTAGC-69TAGCTATCTT TTTTTATCAA TCGCGTTTGC TATAAATAAG ATGGACCTCC TTAACCAAAA-9AGAAAACAAG ATAACTAATC ACGATCGAGA AAGAATAA<210>2<211>1422<212>DNA<213>龙葵Solanum americanum<400>2gccgtaactt tgaatcaatt ttcaaatttt ctttgtctta aaatctattt ttttagaagt-1370tttttgtgat ttgaagaaca caacaataat tgctaagtta tctcaagttt cttatcttca-1310aaatatttaa cttagattgt aaagatataa ttcaacagaa aaaaataaca aaaacaataa-1250aaataattta ccgcactaga acaaaataca tatgttattt gaaataaagc ctaaatttct-1190acaatagcat atttgagata cagtatttgt ttacatttga atagatatag aatttattat-1130agcatcaatt gttgtgtttt aataattctt tatatatata tatatatata tataaaaaat-1070tctattgatt gacgtgatat acacgtgcaa agcacgtaca ctaaactagt aacttataaa-1010atacctgtaa attctttttt attttagtta ttagttatta tttttcttaa atatatactt-950agttagatga agtttcattg tatagtactc ctatttattc taacggttta aatgttttta-890gaaaagtctc tctcccatat tattgtacgc tgcatcactg cctcaatttt cttcatatag-830gtatggcggt ccaatttagg ctgccaaaag tttctaattg ggccatctgt ttaatttact-770atttgcaaaa agtaatttct atccactaaa attagagcat ataaatcaaa aataaaataa-710aaataaaagc aatgggcaaa tggcaatttt gttccttgta ttattggttt atttttattt-650tcatctttgt ataatagctt tcaatttata taaatgtgta attttgatcc tcaaattaat-590ggaaattgaa attttaaaga aattattaat taaaaataaa taagaaaaga gaaaaagaaa-530aatacatcca agggtactaa atgcgcttaa agggtcatat tttttaaaaa aaaattctat-470attttatatt taacgattgt gtttaaattt ttaaacgttc gttagcgtga agaatcaaaa-410tcgatctttt gtatcaatgg tgggttaatt atacttaatc gtatcatata taccggacca-350aaagtccaaa actataataa attctactaa cataaggatt aaaattgcaa tttcccctaa-290agctatatat tcaataattg acttccaact taattatcac gtggagaaga aaattgttgg-230tagatgacaa taatttcaaa aaacaagcaa gtcgtggtca gtacagcttg ctacgaaaaa-170gaagagggaa gcgtaagtac cttgccaaac tagttacact aaagtccttt ttatcaatta-110
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权利要求
1.一种新克隆的蛋白酶抑制剂基因启动子，其特征在于具有核苷酸-1568至+30的1598bp的序列，如SEQ ID NO1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶抑制剂基因启动子，其特征在于-1430至-9的1422bp核苷酸序列足以驱动外源基因在转基因植物的毛状体中特异表达，其序列如SEQ ID NO2所示。
3.一种含有权利要求1或2所述的核苷酸序列与所需的目的基因的编码区核苷酸序列连接后产生的基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于能在植物毛状体中特异表达。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，它是pPBBS。
6.一种重组微生物，其特征在于该微生物是由权利要求4或5所述重组质粒转化微生物得到的。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于其原始微生物菌种是埃希氏大肠杆菌DH5α。
8.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于其原始菌种是土壤根癌农杆菌LBA4404。
9.权利要求7或8所述的重组微生物在转基因植物中的应用。
10.权利要求3所述的重组质粒在转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物毛状体特异表达的基因启动子。本发明提供了采用基因组DNA步移法克隆的毛状体特异性龙葵蛋白酶抑制剂(SaPIN2b)基因启动子的序列；用5’cDNA末端快速扩增法确定了SaPIN2b转录起始位点；用包含所述SaPIN2b启动子的DNA序列与β－葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合构建植物表达载体；用所产生的载体转化烟草与龙葵，对所获得的转基因植株进行检测，表明GUS报告基因在毛状体中特异地表达。
文档编号C12N15/29GK1657621SQ20041007771
公开日2005年8月24日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者徐增富, 刘进, 邓宇歌, 黄小乐 申请人:中山大学