一种新的有机磷农药降解酶及其编码基因的制作方法

专利名称：一种新的有机磷农药降解酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株对有机磷农药具有高效广谱降解能力的细菌菌株——C2-1的分离，并涉及此菌株分泌的有机磷农药降解酶及其酶学性质研究，以及编码这种酶的基因的克隆。
背景技术：
有机磷农药是农药中的主要类别，占世界农药总量的80％[1]，是农业生产必不可少的。但有机磷农药具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能，对人存在着程度不同的毒性。随着人们生活质量的提高和环保意识的加强，有机磷农药的残留毒性问题越来越受到人们的关注。
自1973年Sethunarhan和Yoshida[2]从接触过有机磷农药的土壤中分离出第一株有二嗪农和对硫磷降解活性的黄杆菌以来，人们不断发现一些土壤微生物(细菌、真菌)能够降解有机磷农药，这主要是由于它能够分泌一种酶降解有机磷，同时降解后的产物可作为微生物生长的碳、氮、磷源，为其生长提供营养[3，4，5]。
有机磷通常含有三个磷酯键，所以常被称为磷酸三酯。一般有机磷被分为两种类型，一是磷通过双键与氧结合(P＝O)，如甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等；另一种是磷通过双键与硫结合(P＝S)，如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱(乐斯本)等[6]。有研究表明，如果有机磷中的一个磷酸酯键被水解将大大降低其毒性，以对硫磷为例，将使其毒性降低100倍[7，8]。因此，破坏有机磷的磷酯键是降低有机磷农药毒性行之有效的方法。
有机磷农药降解酶(Organophosphorus acid hydrolase，EC 3.1.8.2)可降解有机磷农药分子，破坏有机磷的磷酯键而使其脱毒。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药。有机磷农药降解酶目前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法[9]。
近年来对于有机磷农药降解酶的分子生物学研究随着人们对农药残留的认识而不断深入。DiSioudi等人[10，11]研究了其编码基因的结构，并进行了分子改造，使其改变了底物特异性，从而能对多种有机磷农药具有高效的降解效率。同时，人们还将农药降解酶基因克隆到大肠杆菌中，并使其在细胞表面表达，增加其降解效率[12，13]。
本发明的目的是为了进一步研究这个具有优良酶学性质的有机磷农药降解酶，并利用基因工程的手段克隆其有机磷农药降解酶基因，最终将其高效表达，廉价生产有机磷农药降解酶。

发明内容
本发明提供了一种能有效降解多种有机磷农药的菌株，并提供该菌株分泌的一种新的有机磷农药降解酶，以及一种编码本发明的农药降解酶的基因。
1.本发明提供一种可降解多种有机磷农药的菌株C2-1本发明中菌C2-1是采用农药富集的方法分离得到。主要步骤如下取农药厂经农药长期污染的土样，在100mL液体Burk无机盐培养基中，32℃振荡培养过夜。菌液用无菌水梯度稀释后分别涂布于加有敌敌畏和甲基对硫磷的Burk无机盐培养基上，置于32℃培养箱中培养，挑取单菌落，经平板划线纯化。将分离到的单菌落菌株分别接种于分别含有不同有机磷农药的Burk无机盐平板上，32℃培养箱培养，进行降解试验，培养两天后开始观察是否有消解圈以及消解圈的大小。对分离出的在农药平板上有消解圈的菌株所分泌的有机磷农药降解酶进行酶活性测定，筛选出具有高活性且有广谱降解农药特性的菌株。
其中，编号为C2-1的菌在几种农药平板上均有消解圈，并且酶活性高，说明其有机磷农药降解特性最为优良。将筛选到的菌株C2-1转接于斜面编号保存，送交中国科学院微生物研究所国家菌种保藏检测中心进行菌种鉴定。经鉴定该菌株属于假产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)。并于2004年2月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京，中关村，北一条13号)，保藏号为CGMCC1150。
该菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌，菌体呈短杆状，大小为0.8×1.5-3.0微米，一般有1-3根鞭毛及极毛，无芽孢，氧化酶和接触酶测定为阳性，其生长严格好氧，菌落一般是光滑的。此菌能够在加有有机磷农药的无机盐培养基上生长，降解农药为其生长提供碳源。
2.本发明提供一种新的有机磷农药降解酶OPHC2的分离纯化及其酶学性质的研究用LB完全培养基大量培养菌体，超声波破碎细胞，离心，上清用硫酸铵沉淀收集蛋白。将沉淀的蛋白重悬于缓冲液中，经透析浓缩得到粗酶液。通过聚丙烯酰胺(PAGE)非变性胶电泳将粗酶液中的蛋白各组分分离开，在电洗脱仪(Phamasia)上将各蛋白分别洗脱下来，经酶活性测定确定所需蛋白。将确定为农药降解酶的蛋白洗脱液过夜透析，浓缩，走SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，并初步确定OPHC2的分子量约为35KD。
以纯化的农药降解酶OPHC2为材料，测得其最适反应温度为65℃。60℃和70℃下此酶相对较稳定，说明此酶有很好的耐热性；其最适反应pH为9，且在pH6-11的范围内酶的相对活力均在60％以上，说明其有很宽的pH酶解范围；在研究不同金属离子及化学试剂对酶反应的影响时，发现只有SDS影响最大，其他金属离子及化学试剂对酶的活性影响不大。
3.本发明有机磷农药降解酶OPHC2的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列的获得委托奥科生物技术公司对OPHC2酶蛋白进行了N端肽段测序，同时委托军事医学科学院仪器测试分析中心对OPHC2蛋白进行了酶解后的内肽测序，得到了4个内肽段的N端序列。根据N端及内肽段的序列设计合成了简并性引物，通过PCR反应得到了部分编码基因(786bp)的核苷酸序列，根据得到的序列设计合成了两对特异性的引物。大量培养C2-1菌，提取质粒DNA，用限制性内切酶消化后连接，以此DNA为模板，进行PCR反应，扩增得到特异DNA条带，回收后克隆，测序，得到编码基因全长核苷酸序列(SEQ ID NO1)，同时推出有机磷农药降解酶OPHC2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。


图1C2-1菌在含有0.05％(v/v)甲基对硫磷的Burk无机盐平板上生长5天所产生的消解圈。
图2OPHC2纯化过程SDS-PAGE电泳图。
图3对硝基酚含量测定标准曲线。
图4温度对OPHC2酶反应的影响。
图5OPHC2酶的温度稳定性。
图6pH对OPHC2酶反应的影响。
图7OPHC2酶的pH稳定性。
图8有机磷农药降解酶OPHC2氨基酸序列。
图9有机磷农药降解酶结构基因ophc2核苷酸序列。
本发明的可降解多种有机磷农药的菌株C2-1于2004年2月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京，中关村，北一条13号)，保藏号为CGMCC 1150。
具体实施例方式
下述实施例是为了更详细地解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。
一.生化试剂、酶及试剂盒限制性内切酶为宝生物及BioLabs公司产品、连接酶为Promega公司产品、Taq酶为上海生工生物工程公司产品；DNA回收试剂盒购于宝生物工程公司、T载体连接试剂盒购于Promega公司；其他生化试剂均购于Sigma、Promega及北京化学试剂公司。
二、培养基1.Burk无机盐培养基(g/L)K2HPO4，0.2；KH2PO4，0.8；MgSO4.7H2O，0.2；CaSO4.H2O，0.1；NaMoO4.2H2O，0.003；FeSO4.7H2O，0.005；(NH4)2SO4，1.0；酵母粉0.5；pH7.2，121℃灭菌20分钟，固体培养基加入1.5％琼脂。2.LB完全培养基(g/L)NaCl，10；蛋白胨；10；酵母粉，5。
三.蛋白及DNA测序、引物合成委托北京奥科生物技术公司对OPHC2进行了蛋白N端测序；委托军事医学科学院仪器测试分析中心进行蛋白酶解后的内肽测序；委托上海基康生物技术有限公司进行DNA测序；委托北京奥科生物技术公司合成所有实验用的引物。
实施例1本实施例说明筛选可降解多种有机磷农药的天然菌株C2-1的筛选过程，其主要步骤如下1.取土样0.5g在100mL Burk无机盐液体培养基中，32℃振荡培养过夜。
2.菌液用无菌水梯度稀释，稀释倍数为10、102、103、104、105、106，分别涂布于加有0.2mg/mL敌敌畏(纯品)和0.2mg/mL甲基对硫磷(纯品)的Burk无机盐固体培养基平板上，置于32℃培养箱中培养，挑取单菌落，经平板划线纯化。
3.将分离到的单菌落菌株分别接种于分别含有有机磷农药甲基对硫磷(0.05％)、对硫磷(0.05％)、甲胺磷(0.05％)、氧化乐果(0.05％)、辛硫磷(0.05％)(均为v/v)(上述农药均购自中国国家农药质量监督检验中心)的Burk无机盐五种平板上，32℃温箱培养，进行消解试验，培养两天后开始观察是否有消解圈以及消解圈的大小。
4.选取在5种农药平板上均有消解圈的菌株，接种于5mL LB完全液体培养基上，32℃振荡培养过夜，收集菌体，悬于50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)中，超声波破碎菌体，15,000rpm离心5分钟去细胞残渣，上清液用来进行酶活性测定。酶活性测定方法取100μL待测酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基对硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)缓冲液的体系中，37℃保温10分钟，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na2CO3溶液显色，410nm测定OD值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。一个酶的活性单位(U)定义为在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需酶量为一个酶活性单位。其中C2-1菌所产生的农药降解酶活性最高，将其保存，送交中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定，并于2004年2月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京，中关村，北一条13号)，保藏号为CGMCC1150。图1为C2-1菌在含有0.05％(v/v)甲基对硫磷的Burk无机盐平板上生长5天所产生的消解圈。
实施例2本实验说明有机磷农药降解酶OPHC2的纯化过程，其主要步骤如下1.农药降解酶(OPHC2)粗酶液的提取用1000mL LB完全培养基大量培养C2-1菌体细胞，32℃振荡培养过夜，5000rpm离心10分钟，弃上清，并将菌体重悬浮于100mL含有0.1mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF的50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)缓冲液中，用超声波破碎仪(美国Branson公司)破碎细胞，12,000rpm离心20分钟，收集上清，用饱和度为20％-90％的硫酸铵沉淀蛋白。沉淀重新悬浮于20mL 50mmol/L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，并透析脱盐、浓缩，得到OPHC2粗酶液。
2.OPHC2的分离和纯化通过聚丙烯酰胺(PAGE)非变性胶电泳(凝胶的浓度15％)，将粗酶液中的蛋白各组分分离开，取边上的一条电泳道的胶染色，以此作为对照切下对应的未染色蛋白带，在电洗脱仪(Phamasia)上将各蛋白分别洗脱下来，经酶活性测定确定所需蛋白。PAGE电泳后，有三条较明显的蛋白带，将它们分别切下来，在电洗脱仪上洗脱下来，经酶活性测定位于中间的条带的蛋白是我们所需要的目的蛋白。将含有目的蛋白的洗脱液透析，浓缩，走SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，并初步确定OPHC2的分子量约为35KD。图2所示OPHC2纯化过程SDS-PAGE电泳图。
实施例3本实施例说明有关农药降解酶OPHC2酶学性质的研究，其主要步骤如下1.有机磷降解酶酶活性测定方法有机磷降解酶可将甲基对硫磷等摩尔的分解为二乙基硫代磷酸酯和黄色的对硝基酚，通过测定产物对硝基酚的量即可测定酶的活性。
对硝基酚的含量测定及标准曲线制作步骤如下秤取0.08346g对硝基酚，先用少量95％乙醇溶解，然后用水定容至100mL，浓度为6mmol/L。按下表分别加入不同量的对硝基酚溶液和50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)缓冲液，总体积为1mL，然后每管加入1mL10％三氯乙酸，再加入1mL 10％Na2CO3溶液，总体积为3mL，410nm测定光吸收值。同时，绘制对硝基酚含量测定标准曲线(图3)。
表1标准曲线的绘制

根据有机磷降解酶酶活性标准曲线，得出有机磷降解酶酶活单位计算公式 其中3×10-3反应总体积(L)；N酶液的稀释倍数；10①将100μL稀释酶液中的酶活性折算为1mL的酶活性；10②反应时间。
取100μL待测酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基对硫磷和900μL50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)缓冲液的体系中，37℃保温10分钟，加入1mL10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na2CO3溶液显色，410nm测定OD值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。一个酶的活性单位(U)定义为在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需酶量。
2.OPHC2酶反应最适温度及热稳定性研究以纯化的农药降解酶OPHC2为材料，在不同温度下进行酶促反应后，如上所述测定其酶活性，得到其最适反应温度；在60℃和70℃下分别处理酶液，处理时间为2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟，处理后在37℃下测酶活性，以确定其热稳定性。结果表明，其最适反应温度为65℃。温度在低于65℃时，随着温度升高酶活性逐步上升，但在20℃时相对酶活仍有25.87％。高于65℃酶活力迅速下降，到80℃只有最大活力的7.7％(见图4)。图5为OPHC2的热稳定性曲线，60℃此酶很稳定，保温30分钟后，其相对酶活有85.6％；70℃下保温30分钟，其酶活性有所下降，但相对酶活仍有近40％，说明此酶有很好的耐热性。
3.OPHC2酶反应的最适pH及pH稳定性以纯化的农药降解酶OPHC2为材料，在不同的pH下如上所述进行酶促反应，测定了其最适pH；将酶液在不同pH的缓冲液中于37℃保温30分钟后，测酶活性以确定其pH稳定性；测定结果表明，其最适反应pH为9，但在pH6-11的范围内，酶的相对活力均在60％以上，说明其有很宽的pH酶解范围，见图6。在不同pH下保温30分钟后，酶的相对活力影响不大，即使是pH5其相对酶活也达到72.53％，且在碱性条件下更加稳定，见图7。
4.不同金属离子及化学试剂对OPHC2酶反应的影响以纯化的农药降解酶OPHC2为材料，在酶促反应体系中分别加入不同金属离子及化学试剂，各种化合物的终浓度为1mmol/L，如上所述测酶活性，以研究不同金属离子及化学试剂对酶反应的影响。表2所示不同金属离子及化学试剂对OPHC2酶反应的影响。其中SDS影响最大，为OPHC2酶的强烈变性剂；Cu2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+对OPHC2酶活性有轻微的影响，其他的金属离子及化学试剂对其影响不大或有的有促进作用。
表2不同金属离子及化学试剂对OPHC2酶解反应的影响

实施例4本实施例说明有机磷农药降解酶OPHC2的部分氨基酸序列测定。
将纯化的蛋白走SDS-PAGE电泳，通过电转仪(Phamacia公司)将胶上的蛋白转至PVDF膜(购于美国Millipore公司)上，委托北京奥科生物技术公司对OPHC2进行成熟蛋白N端测序。同时，将纯化的OPHC2酶蛋白走SDS-PAGE电泳，电泳后按常规固定、染色，电泳胶交给军事医学科学院仪器测试分析中心进行酶解后的内肽测序。奥科生物技术公司测试分析得出的成熟蛋白N端氨基酸序列为AAPAQQKTQVPGYYR(SEQ ID NO3)。军事医学科学院仪器测试分析中心对OPHC2蛋白进行了胶内酶解，得到了4个内肽段的N端氨基酸序列，分别为APEGMQGMFK(SEQ ID NO4)；GIDDKDLQSLLAR(SEQ ID NO5)；ILAEAATDK(SEQ ID NO6)；MAQQAVAPYAK(SEQ ID NO7)。
实施例5本实施例说明农药降解酶OPHC2编码基因ophc2全序列的获得，其主要步骤如下1.首先进行质粒消除实验，以确定有机磷农药降解酶基因是在C2-1菌的染色体上还是在质粒上。将菌株接种于LB液体培养基中，32℃振荡培养过夜，按10％接种量转接于含有1.5μg/mL丝裂霉素C的LB培养基中培养36小时，用LB培养基稀释菌液，稀释倍数为10、102、103、104、105，分别涂布于LB平板上，32℃温箱培养至菌落出现。挑取单菌落培养后进行农药降解酶酶活性测定。结果表明，质粒消除后检测不到酶活性，说明有机磷农药降解酶基因是位于质粒上。
2.根据成熟蛋白N端氨基酸序列设计合成了5’端简并性引物5’CA(A/G)GT(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)TA(T/C)TA(T/C)(C/A)G3’(SEQ ID NO8)；并根据内肽段的N端氨基酸序列设计合成4个3’端简并性引物，分别是722-3’5’(T/C)TG(A/G/C/T)A(A/G)(A/G)TC(C/T)TG(A/G)TC(A/G)TC 3’(SEQ IDNO9)548-3’5’AACAT(A/G/C/T)CC(T/C)TGCAT(A/G/C/T)CC(T/C)TC 3’(SEQ ID NO10)589-3’5’GC(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)GC(T/C)TG(T/C)TT(A/G/T/C)GCCAT3’(SEQID NO11)466-3’5’TT(G/A)TC(A/G/C/T)GT(A/G/C/T)GC(A/G/C/T)GC(T/C)TC(A/G/C/T)GC3’(SEQ ID NO12)3.携带有机磷农药降解酶基因的质粒的提取用LB液体培养基5mL培养C2-1菌，离心收集菌体，将细菌沉淀悬于350μL STET(NaCl0.1mol/L，Tris HCl 10mmol/L(pH8.0)，EDTA 1mmol/L(pH8.0)，Triton X-1005％)溶液中，加入25μL新配制的溶菌酶溶液(10mg/mL，用pH8.010mmol/L Tris HCl配制)，振荡混均。将离心管放到沸水浴中煮沸45秒，15,000rpm离心10分钟后，挑出沉淀，上清中加入40μL 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μL异丙醇，振荡混均后，室温放置5分钟。15000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀抽干水分后，溶于400μL TE缓冲液中，依次用酚、酚-氯仿、氯仿抽提，去杂蛋白，乙醇沉淀后溶于双蒸水备用。
4.以5’端简并性引物和4个3’端简并性引物分别配对，以质粒DNA为模板，分别PCR，PCR反应条件为94℃5分钟；94℃45sec，55℃45sec，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟。分别得到4条特异性的条带，一条为100bp左右，两条为500bp左右，一条为750bp左右。克隆到T载体上后，测序。测序结果显示，由5’端简并性引物和466-3’端引物扩增出来的片段为762bp，其他片段均为其中的一部分。在这762bp的片段中，发现位于412bp处有一个单一EcoRI酶切位点，位于455bp处有一个单一SphI酶切位点。根据EcoRI酶切位点前已测定序列合成一对分别向两端扩增的引物Q15’CCGAGTGCCATACGGTAGTA 3’(SEQ ID NO13)Q25’AACGCGACCGTGGAGGTG 3’(SEQ ID NO14)
同样，根据SphI酶切位点后已测定序列合成一对分别向两端扩增的引物H15’TTGCGCCATCTTGAACATGC 3’(SEQ ID NO15)H25’CAGGCAGTCGCACCCTATGC 3’(SEQ ID NO16)用EcoRI、SphI分别酶切质粒DNA，酶切后连接使其环化，以这两个DNA分别为模板，分别用以上两对引物进行PCR扩增(PCR反应条件同上)。其中以SphI酶切的为模板，Q1和Q2为引物扩增出600bp左右的片段，得到的是酶的前段编码基因；其中以EcoRI酶切的为模板，H1和H2为引物扩增出500bp左右的片段，得到的是酶的后段编码基因。将这两段克隆到T载体上后，测序后，即可拼接出完整的基因序列。再根据此完整序列设计基因两端引物ophc2-5’5’ATGCGTCTTTTCTCGCTGAGC 3’(SEQ ID NO17)ophc2-3’5’TCAGCGGTCGCTACGGATCGG 3’(SEQ ID NO18)以质粒DNA为模板，进行PCR扩增反应(反应条件同上)，得到了完整的有机磷农药降解酶基因ophc2。经测序验证，与拼接出的完整基因序列完全一样。
得到的有机磷农药降解酶结构基因ophc2全长975个核苷酸，编码324个氨基酸。有机磷农药降解酶的氨基酸序列见图8，其编码基因的核苷酸序列见图9。根据信号肽序列的结构规则及成熟N端氨基酸序列测定结果，N端24个氨基酸为信号肽。信号肽的切割位点在+24位的Ala之后。此基因与到目前为止报道过的6个有机磷农药降解酶基因的最高同源性仅有46％，见表3。
表3 ophc2与已报道的有机磷农药降解酶的同源性比较


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SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院生物技术研究所中国农业科学院饲料研究所<120>一种新的有机磷农药降解酶及其编码基因<130>I040310<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>975<212>DNA<213>假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>1atgcgtcttt tctcgctgag caccgcattg tcgtccgcca tgatcgccct ggtcagcctg 60ccgctgcagg cggccgcacc ggcacaacag aagacccagg taccgggcta ctaccgtatg120gcactcggtg acttcgaagt caccgctctg tatgacggct acgtcgacct gcctgccagc180ctgctcaagg gcatcgatga caaggacctg caatcgctgc tggctcgcat gttcgtggcg240
tcggagaaag gcgtgcagac tgcggtcaac gcctacctga tcaacactgg cgacaacctg300gtgctgatcg ataccggcgc cgcccagtgc ttcggcccga ctctcggcgt ggtgcagacc360aacctcaagg catccggcta ccagccggag caggttgata ccgtgctgct cacccacctg420cacccagacc atgcctgcgg cctggtcaac gccgacggca gcccggccta ccccaacgcg480accgtggagg tgccgcaggc ggaggctgaa ttctggctcg acgaggcgac catggccaag540gcccccgaag gcatgcaagg catgttcaag atggcgcaac aggcagtcgc accctatgcc600aagatgaaca agctcaagcc ctacaagaca gaaggcgaat tgttgcctgg cgtcagcctg660gtagcgagcc cgggacacac gcccggacat acctcttacc tgttcaaatc gggtggacag720agcctgctgg tatggggcga cattctgctt aaccacgccg tgcagttcgc caagcctgaa780gtggtcttcg agttcgatgt cgacagcgac caggccaggc aatcccgcca acgcatcctg840gccgaagcgg ccacagacaa gctgtgggtc gctggtgcgc acctgccctt ccccggcctg900ggccacgtac gcaaggaagc ccaaggctac gcctgggtac ccgtcgagtt cagcccgatc960cgtagcgacc gctga 975<210>2<211>324<212>PRT<213>假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>2Met Arg Leu Phe Ser Leu Ser Thr Ala Leu Ser Ser Ala Met Ile Ala1 5 10 15
Leu Val Ser Leu Pro Leu Gln Ala Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr20 25 30Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg Met Ala Leu Gly Asp Phe Glu Val Thr35 40 45Ala Leu Tyr Asp Gly Tyr Val Asp Leu Pro Ala Ser Leu Leu Lys Gly50 55 60Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser Leu Leu Ala Arg Met Phe Val Ala65 70 75 80Ser Glu Lys Gly Val Gln Thr Ala Val Asn Ala Tyr Leu Ile Asn Thr85 90 95Gly Asp Asn Leu Val Leu Ile Asp Thr Gly Ala Ala Gln Cys Phe Gly100 105 110Pro Thr Leu Gly Val Val Gln Thr Asn Leu Lys Ala Ser Gly Tyr Gln115 120 125Pro Glu Gln Val Asp Thr Val Leu Leu Thr His Leu His Pro Asp His130 135 140Ala Cys Gly Leu Val Asn Ala Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Pro Asn Ala145 150 155 160Thr Val Glu Val Pro Gln Ala Glu Ala Glu Phe Trp Leu Asp Glu Ala165 170 175Thr Met Ala Lys Ala Pro Glu Gly Met Gln Gly Met Phe Lys Met Ala180 185 190
Gln Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ala Lys Met Asn Lys Leu Lys Pro Tyr195 200 205Lys Thr Glu Gly Glu Leu Leu Pro Gly Val Ser Leu Val Ala Ser Pro210 215 220Gly His Thr Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Phe Lys Ser Gly Gly Gln225 230 235 240Ser Leu Leu Val Trp Gly Asp Ile Leu Leu Asn His Ala Val Gln Phe245 250 255Ala Lys Pro Glu Val Val Phe Glu Phe Asp Val Asp Ser Asp Gln Ala260 265 270Arg Gln Ser Arg Gln Arg Ile Leu Ala Glu Ala Ala Thr Asp Lys Leu275 280 285Trp Val Ala Gly Ala His Leu Pro Phe Pro Gly Leu Gly His Val Arg290 295 300Lys Glu Ala Gln Gly Tyr Ala Trp Val Pro Val Glu Phe Ser Pro Ile305 310 315 320Arg Ser Asp Arg<210>3<211>15<212>PRT<213>假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)
<400>3Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg1 5 10 15<210>4<211>10<212>PRT<213>假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>4Ala Pro Glu Gly Met Gln Gly Met Phe Lys1 5 10<210>5<211>13<212>PRT<213>假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>5Gly Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser Leu Leu Ala Arg1 5 10<210>6<211>9
<212>PRT<213>假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>6Ile Leu Ala Glu Ala Ala Thr Asp Lys1 5<210>7<211>11<212>PRT<213>假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>7Met Ala Gln Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ala Lys1 5 10<210>8<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(3)
<223>r＝g或a<220>
<221>misc_feature<222>(6，9，12)<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(15，18)<223>y＝t或c<220>
<221>misc_feature<222>(19)<223>m＝c或a<400>8cargtnccng gntaytaymg 20<210>9<211>18<212>DNA
<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1，10)<223>y＝t或c<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(6，7，13，16)<223>r＝a或g<400>9ytgnarrtcy tgrtcrtc18<210>10<211>20<212>DNA
<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(6，15)<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(9，18)<223>y＝t或c<400>10aacatnccyt gcatnccytc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(3，6，15)
<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(9，12)<223>y＝t或c<400>11gcnacngcyt gyttngccat 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>r＝g或a<220>
<221>misc_feature<222>(6，9，12，18)
<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(15)<223>y＝t或c<400>12ttrtcngtng cngcytcngc 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>13ccgagtgcca tacggtagta 20<210>14<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>14aacgcgaccg tggaggtg18
<210>15<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>15ttgcgccatc ttgaacatgc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>16caggcagtcg caccctatgc 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>17atgcgtcttt tctcgctgag c21
<210>18<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>18tcagcggtcg ctacggatcg g21151权利要求
1.一种有机磷农药降解酶，其特征在于，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述有机磷农药降解酶的基因，其特征在于，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的有机磷农药降解酶在制备用于消除有机磷农药残留的产品中的应用。
4.一种筛选具有有机磷农药降解酶特性的菌株的方法，其包括1)取经农药长期污染的土样，并于液体培养基中过夜预培养；2)稀释预培养的菌液，并在含敌敌畏和甲基对硫磷的固体培养基上分离单菌落；3)将分离的单菌落在分别含甲基对硫磷，对硫磷，甲胺磷，氧化乐果，辛硫磷的5种固体培养基上进行消解试验；4)测定在上述5种固体培养基上均有消解圈的菌株的酶活性；5)对具有最高农药降解酶活性的菌株进行菌种鉴定。
5.权利要求4的方法，其特征在于，所述培养基是Burk无机盐培养基，其基本组分为0.2g/L K2HPO4；0.8g/L KH2PO4；0.2g/LMgSO4.7H2O；0.1g/L CaSO4.H2O；0.003g/L NaMoO4.2H2O；0.005g/LFeSO4.7H2O；1.0g/L(NH4)2SO4和0.5g/L酵母粉；pH7.2。
6.权利要求4的方法，其特征在于，所述菌株的培养温度是32℃。
7.权利要求4的方法，其特征在于所述酶活性的测定是在含甲基对硫磷的Tris-HCl缓冲体系中在37℃的温度下进行。
8.权利要求4的方法，其特征在于，所述敌敌畏和甲基对硫磷的含量为0.2mg/mL。
9.权利要求4的方法，其特征在于，所述甲基对硫磷，对硫磷，甲胺磷，氧化乐果，辛硫磷的含量为0.05％(v/v)。
全文摘要
本发明提供了一株对有机磷农药具有高效广谱降解能力的细菌菌株，此菌株属于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，我们将其命名为C2－1，还提供了该菌株的分离过程、培养条件和降解特性，它可利用农药在无机盐培养基上生长。同时提供了该菌株分泌的有机磷农药降解酶的分离和纯化及其酶学性质的研究，以及编码它的基因的分离和克隆。它将为我们利用基因工程手段克隆有机磷农药降解酶基因提供很好的基因源，最终达到廉价生产有机磷农药降解酶的目的。
文档编号C12N9/00GK1644687SQ20041008015
公开日2005年7月27日 申请日期2004年9月24日 优先权日2003年11月3日
发明者伍宁丰, 姚斌, 史秀云, 范云六, 邓敏捷 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 中国农业科学院饲料研究所