专利名称：微藻细胞破壁方法
技术领域：
本发明属于微藻生物技术领域，具体是富含生物活性物质的微藻细胞破壁技术。
背景技术：
微藻作为生物圈中第一生产力的重要组成部分，是水生态系统中水产动物整个生长过程(或特定发育阶段)的唯一饵料或饵料生物的饵料。同时，微藻接近植物种类的50％，在种质、生态分布、遗传信息、生化组成、代谢途径等方面具有出多样性、复杂性和特殊性，进一步决定了其潜在食用、营养、保健和药学等价值。人类完全有可能从中开发出人类大量需求、结构特异的高附加值生物活性成分(如β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素等类胡萝卜素及其衍生物、AA、EPA和DHA等高度不饱和脂肪酸，以及维生素、萜类、氨基杂环、大环内酯、多糖及其衍生物、核苷酸、特异蛋白和多肽等)。微藻将成为人类继成功开发微生物后的又一重要再生生物资源库。
然而，大多数种类的微藻细胞具有纤维素性细胞壁，某些种类的微藻细胞壁还有大量难以消化分解的其它成分，细胞壁厚、质地也特别坚硬，非常不利于活性物质的进一步提取，也大大降低了微藻产品的生物利用效率。因此，需要通过特定的技术将微藻产品进行破壁处理。
目前尽管生物细胞破壁的方法很多，如传统上的机械粉碎、冻融、超声波、胶体磨等物理方法和生物酶解方法等。但是上述方法都存在明显的缺陷，或用时较长、或温度较高、或粉碎效果不佳、或没有有效保护生物活性成分。结果导致细胞破壁效率低下以及生物活性成分损失严重。
如何快速、高效地对微藻原料进行破壁处理，同时有效地避免地加工过程中主要生物活性成分的降解，成为开发微藻生物资源的关键的核心技术。为解决该技术问题，我们针对微藻的生物特性和生物活性物质的理化特征，在传统上的机械粉碎、冻融、超声波、胶体磨等物理方法和生物酶解方法工作基础上，进一步开展了系列高压均质和超高速气体粉碎研究，形成本发明技术。
发明内容
本发明提供一种微藻细胞破壁方法，可以高效率地实现破碎微藻细胞坚硬的厚壁，提高微藻活性物质的生物利用率和进一步提取效率，同时有效保护生物活性物质的目的。
本发明的技术方案是本发明的基本思路是通过人工添加适量的保护剂形成均质保护层，在低温和避光条件下，利用高速流体颗粒的强力碰撞，形成巨大机械作用力，完成破碎微藻细胞的厚壁。
本发明包括三部分技术湿法微藻藻泥细胞破壁技术，干法微藻藻粉细胞破壁技术，以及有效保护生物活性成分、降低其被氧化分解的相关技术。
本发明中第一部分湿法微藻藻泥细胞破壁主要指高压均质技术，首先对湿物料施以高压，然后再让湿物料瞬间失去压力到常压状态，失压的微藻物料以极高的流速快速喷出。在上述压力降低过程中，微藻粒子受到撞击效应、剪切效应和空穴效应联合作用，微藻细胞快速破碎，并形成了颗粒大小不等的微米材料、亚微米材料甚至纳米材料。
本发明中第二部分干法微藻藻粉细胞破壁采用超声速气流超微粉碎技术，微藻干物料随超声速气流进入圆柱形腔体工作区。在气体喷射的加速作用下，干物料颗粒环绕腔体进行螺旋运动，最终达到3倍超音速，不同速度的粒子发生剧烈碰撞，产生粉碎效果实现微藻细胞破碎。
本发明第三部分指避免微藻内生物活性物质的氧化分解，在保护其生物活性的技术中，主要措施有适当降低操作温度和适量添加保护剂。
解决本发明所提出的技术问题采取湿法高压均质、干法超声速气流超微粉碎、降低物料的温度和添加保护剂，具体方案和措施包括1、降低物料温度。
物料在高速碰撞过程中易于产生热量并带来物料温度提高，为此有必要对微藻物料进行预处理，降低微藻细胞温度，更利于保护生物活性成分。不同的破碎方法采用的物料不同，降温处理的方法以及温度参数也完全不一样。
高压均质破碎的物料为湿物料，为保障湿物料在该温度范围内依然带有流动性，预处理温度一般降低到0℃～15℃之间，通常在4℃左右。湿物料预处理降低温度的方法有冷冻、冰冻等。
超声速气流超微粉碎利用的是干物料，不需要保持物料的流动性，因此干物料预处理温度可以降低到冰点以下，最低可以降到-100℃以下，一般可以控制在0℃～-50℃之间。物料预处理降低温度的方法包括冷冻、冰冻、干冰或液氮处理等。
2、避光处理破碎细胞过程在工作腔内进行，工作腔及相关装置所用材料要求具有避光特性，设备材料主要是避光、耐压和不易产生杂质的不锈钢。微藻物料颗粒碰撞等过程全部在黑暗中进行，尽量降低生物活性成分的光破坏作用。
3、添加保护剂无论干、湿微藻物料，在细胞破壁处理前后都需要分别添加适量的保护剂，使微藻物料在破壁粉碎后，在颗粒周围形成一层保护屏障，有效阻断氧气和生物活性成分的接触，抑制氧化分解反应。
选用的保护剂首先必须符合国家食品卫生标准，食用安全可靠，并且具有物理隔断氧气同微藻破壁物料直接接触的作用，或具有较强的抗氧化活性。
符合上述要求的保护剂有维生素E、2，6-二叔丁基甲酚(BHT)、羟丁基茴香醚、没食子酸丙酯、乙氧基奎宁等。其剂量依据保护剂种类不同而有一定的差异，一般控制在各保护剂的国家食用安全标准范围内。
4、高压均质高压均质机具有1个或多个往复运动的柱塞，经过降温预处理微藻物料(含适量的保护剂)通过柱塞作用进入工作腔体。然后在400巴以上、1500巴以下(通常600～1200巴)的高压下通过限流窄缝。尽管更高的压力更有利于细胞破壁，但对材料要求更高、增压设备要求也高、能耗更多、成本更大。因此从经济角度，工业上不采取更高的压力了。
被柱塞压缩的微藻物料内积聚了极高的能量，当物料通过窄缝后瞬间失压，造成内部高能释放引起空穴爆炸而强烈膨胀，产生孔穴效应，致使物料强烈粉碎细化。同时，瞬间失压的微藻物料以极高的线速度(约3～5倍左右的音速)喷出，撞击在用特殊材料制成的质地坚硬的撞击环上，产生强大的冲撞力，造成物料粉碎。另外，碰撞前后的微藻物料随液体高速运动，通过泵腔内通道和阀口狭缝时会产生巨大的剪切力。
在孔穴效应、撞击效应和剪切效应的联合作用下，湿物料微藻的细胞壁在瞬间(1～2秒内)就完成了细胞破碎，物料粒度几乎全部细化到1～2μm以下的粒径的微米材料。其中，50％左右的粒度直径在100nm～1.0μm亚微米材料，而有30％～40％的粒径大小为100nm以下的纳米材料。
在微藻物料经过高压均质细胞破壁前后，湿物料出口温度通常要比进口温度高出大约10℃～15℃。而先期进行物料低温处理到4℃左右(一般在0℃～10℃之间)，可有效地控制微藻物料暴露在20℃～25℃以下的温度中，避免了因高温造成的生物活性成分分解或失活。
由于上述微藻湿物料中预先添加了保护剂，在高压均质过程中，保护剂非常均匀地将粉碎的微藻颗粒包埋，形成一层保护屏障，隔断了氧其中的生物活性成分的接触，也大大降低了随后进一步加工过程中微藻原料被氧化分解的可能性。
5、超声速气流超微粉碎经过低温预处理的微藻干物料(包括适量的保护剂)，在压缩气体(空气或氮气)的作用下，沿切线方向高速进入圆柱形腔体工作区。
微藻物料在工作腔体内进一步受气流喷射器的加速作用，颗粒沿螺旋线加速运动，最后速度达到3倍左右的音速。
微藻物料的高速颗粒和低速颗粒在工作腔体内发生剧烈碰撞，产生的巨大撞击力，造成很高的细胞破壁效果。
颗粒在工作腔体内沿螺旋线运动中，受到离心力的作用，大颗粒微藻物料始终保持在工作腔体的外围，继续循环上述超声速气流粉碎过程。而相对较小的微藻物料颗粒随气体从工作腔体的中心排出，而收集到一起。
微藻细胞干物料经过超声速气流粉碎，细胞壁可以在瞬间几秒内就完成了细胞壁的破碎，物料粒度有一定程度的细化作用，大约30％左右的细胞已经明显破裂，85％的细胞出现裂痕缝隙。对提高微藻原料的生物利用率和生物活性物质的提取效率具有很好的效果。
上述超声速气流粉碎过程中，微藻干物料中预先添加了保护剂。保护剂非常均匀地涂布到微藻细胞粉碎颗粒外围，形成一层保护屏障，隔断了氧与其内生物活性成分的接触，从而降低了随后进一步加工过程中微藻生物活性成分被氧化分解或失活的可能性。
超声速气流粉碎过程中，压缩气体在失压过程中需要吸收大量热量，保持工作腔体内部在-45℃左右，一般在-40℃～-50℃范围内。另外，微藻颗粒也进行了低温预处理，因此有效避免了粉碎过程中微藻生物活性成分发生分解反应。
本发明培养的微藻主要指经济微藻，包括来自于淡水微藻、咸水和海水等环境中的微藻，如扁藻、小球藻、栅藻、红球藻、紫球藻、雪藻或硅藻等其它微藻。培养的经济微藻用于水产养殖饵料和进行特殊生物活性成分开发。
本发明的优点是1、本发明克服了传统粉碎技术难以破碎微藻坚硬细胞壁的技术屏障，实现了安全高效地破碎微藻细胞破壁，高速气体破壁效率在85％以上，高压均质破壁效率几乎100％。
2、本发明通过对粉碎材料进行低温预处理，粉碎中有失压吸热过程，保障了整个粉碎过程处于低温条件下，避免了微藻生物活性成分的损失。
3、本发明微藻破壁粉碎过程用时很短，在几秒种内瞬间完成，增加了工作效率。
4、本发明微藻破壁粉碎过程，添加了保护剂并使保护剂均匀地涂布在微藻颗粒周围，形成一层隔离屏障，降低了氧同微藻颗粒的接触，保护了微藻生物活性成分不被氧化分解。
5、本发明微藻破壁粉碎过程主要利用细胞之间的高速碰撞，无异物混入，可以获得高纯度的微藻细胞破壁的微细颗粒。
6、本发明微藻破壁粉碎过程在黑暗条件下进行，尽可能地避免了光对生物活性成分的破坏作用。
7、本发明微藻破壁粉碎过程设备全封闭运行，不污染环境，符合环保要求。
具体实施例方式
虾青素是类胡萝卜素的氧化衍生产物，具有很强的生物活性，其还原活性是维生素E的500倍，具有“超级维生素E”之称，有希望开发成新型的抗衰老、降低心血管和癌症发病率等药效的药品或保健食品。同时，虾青素在化妆品、和软饮料，水产品和家禽畜饲料等加工制造方面具有广泛应用价值和开发前景。
红球藻在特定条件能够大量累积虾青素，可占藻体干重的1-4％，是目前已知生产虾青素的最好天然资源。红球藻具有复杂的生活史，通常大量累积虾青素的红球藻处于不动细胞阶段，具有非常坚硬的细胞壁。
如何有效开展富含虾青素活性成分红球藻细胞破壁，对整个微藻细胞破壁和高效保护生物活性成分具有非常典型的代表作用，以下实例为不同方法对该藻的细胞破壁效果。
实施例1高压均质对红球藻湿物料的粉碎。向红球藻湿物料中添加食用保护剂(本实施例食用保护剂为2，6-二叔丁基甲酚(BHT))，物料干重和保护剂按照99∶1的重量比例混匀。然后将湿物料进行低温预处理，降低温度到4℃左右，分别利用400巴～1500巴之间的高压推动物料进入工作腔体。然后湿物料通过高压均质机的限流窄缝瞬间失去压力到常压状态，失压的微藻物料以3倍的音速快速喷出，在上述压力降低过程中，经过孔穴效应、撞击效应和剪切效应的联合作用，湿物料微藻的细胞壁在瞬间就完成了细胞破碎，细胞破壁效果十分明显。物料粒度几乎全部细化到1～2μm以下的粒径的微米材料。其中，50％左右的粒度直径在100nm～1.0μm亚微米材料，而有30％～40％的粒径大小为100nm以下的纳米材料。卸出的微藻粉碎物料温度在20℃～25℃之间。
实施例2高速气体对红球藻干物料的粉碎。向红球藻干物料中添加食用保护剂(本实施例食用保护剂为2，6-二叔丁基甲酚(BHT))，物料干重和保护剂按照99∶1的重量比例混匀。然后将红球藻干物料进行冰冻处理，物料温度冷却到-20℃以下。然后在压缩空气带动下，沿切线方向高速进入圆柱形腔体工作区，并不断加速运动，最终达到3倍的超音速，导致高速红球藻物料颗粒和低速颗粒发生剧烈碰撞，可以在几秒内的瞬间产生细胞破壁效果。其中，较小的红球藻物料颗粒随气体从工作腔体的中心排出并收集。卸料后的红球藻物料温度小于20℃，粒度也有一定程度的细化作用，大约30％左右的细胞已经明显破裂，85％的细胞出现裂痕缝隙，大大提高了生物利用率。
本发明采用红球藻最有代表性，只要该藻能破壁，其它藻类如扁藻、小球藻、栅藻、紫球藻、雪藻或硅藻就基本可以实现破壁。
权利要求
1.微藻细胞破壁方法，其特征在于微藻物料通过人工添加保护剂形成均质保护层，利用高速流体颗粒碰撞形成的机械作用力，瞬间完成破碎微藻细胞的厚壁；细胞破壁过程的微藻物料为湿物料或干物料，破壁方法分别为湿法微藻藻泥细胞破壁或干法微藻藻粉细胞破壁；湿法微藻藻泥细胞破壁采用高压均质方法，首先对湿物料施以400巴以上的高压，然后再让湿物料瞬间失去压力到常压状态，失压的微藻物料以3倍以上的音速快速喷出，在上述压力降低过程中，微藻粒子受到撞击效应、剪切效应和空穴效应联合作用，微藻细胞快速破碎；干法微藻藻粉细胞破壁采用超声速气流超微粉碎方法，微藻干物料在压缩气体作用下，随超声速气流沿切线方向进入圆柱形腔体工作区，在气体喷射的加速作用下，干物料颗粒环绕腔体进行螺旋加速运动，最终达到3倍以上超音速，不同速度的粒子发生剧烈碰撞，产生粉碎效果实现微藻细胞破碎。
2.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述高压均质方法中，湿料施压为400-1500巴，湿物料喷出速度为3-5倍音速。
3.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述超声速气流超微粉碎方法中，干物料速度为3-5倍音速。
4.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述细胞破壁过程在低温条件下完成，包括物料的冷冻、冰冻、干冰或液氮低温预处理，湿物料预处理温度降低到0℃～20℃之间。
5.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述细胞破壁过程在低温条件下完成，包括物料的冰冻、干冰或液氮低温预处理，所述干物料预处理温度控制在0℃～-50℃之间。
6.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述细胞破壁过程在黑暗条件下完成，破碎细胞在工作腔内进行，工作腔及相关循环管道，设备材料采用避光、耐压和不易不产生杂质的不锈钢。
7.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述微藻来自于淡水微藻、咸水或海水环境中，能够产生生物活性物质的经济微藻，包括扁藻、小球藻、栅藻、红球藻、紫球藻、雪藻或硅藻。
8.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述保护剂为食用保护剂，包括维生素E、2，6-二叔丁基甲酚、羟丁基茴香醚、没食子酸丙酯或乙氧基奎宁。
9.根据权利要求1所述微藻细胞破壁方法，其特征在于所述气体包括压缩空气或氮气。
全文摘要
本发明属于微藻生物技术领域，涉及富含生物活性物质的微藻细胞破壁方法。本发明包含三部分技术湿法微藻藻泥细胞破壁技术，干法微藻藻粉细胞破壁技术，以及有效保护微藻生物活性成分，降低其被氧化分解的相关技术。微藻物料通过人工添加适量的保护剂形成均质保护层，在低温和避光条件下，利用高速流体颗粒的强力碰撞，形成巨大机械作用力，完成破碎微藻细胞的厚壁。本发明在避光、低温和有保护剂参与下进行，具有快速、高效、无异物进入和有效保护生物活性物质的优点。
文档编号C12N1/12GK1786148SQ20041008292
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者刘建国, 刘伟, 林伟, 邢军武 申请人:中国科学院海洋研究所