专利名称：家蚕丝腺生物反应器及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种蛋白异源表达系统，更具体地说，是关于一种丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动外源基因在家蚕丝腺特异分泌表达的家蚕丝腺生物反应器及其构建方法。
背景技术：
一个好的真核蛋白的异源表达系统，应当具有表达量高，所表达真核蛋白能被正确地修饰、折叠、定位，便于下游纯化等特征，其中纯化的问题是最难的。现有的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞-杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。其中，大肠杆菌和酵母表达系统表达的蛋白量多，成本低，但所表达外源蛋白在修饰、折叠等方面不能满足要求。哺乳动物细胞表达系统在所表达蛋白的功能修饰方面是最好的，在表达大分子量真核蛋白方面优势明显，但该系统耗时耗资，表达量不高，不易大规模生产。杆状病毒与昆虫细胞组成的系统表达量高，所表达蛋白也修饰折叠正常而具有正确的功能，杆状病毒对哺乳动物不感染因而安全性也好。但在培养细胞中进行表达成本偏高。
家蚕是一种能吐丝的经过家养驯化的鳞翅目经济昆虫。数千年来，经过不同目的的人工筛选育种，已得到了许多吐丝量大、个体大等具有不同特性的经济品系。在中国这样的蚕业比较发达的国家，为了满足制丝工业的需要，已经发展出了规范化的家蚕规模饲养模式。这不仅保障了蚕丝业的正常发展，也方便了对家蚕其它用途的开发。由于家蚕有巨大的蛋白合成能力，它被认为是用来进行高附加值的异源蛋白表达的良好载体。在这方面，已经有两种不同的技术路线取得了成功。一个是以家蚕转基因为代表的稳定的外源基因表达品系的培育。这当中有为建立系统而进行的绿色荧光蛋白报告基因在不同组织的表达，也有重组人胶原蛋白的表达(T.Tamura，et al.Nat.Biotech.，2000，1881-84；Tomita M，et al.Nat.Biotech，2003，2152-56；Imamura M，et al.Genetics，2003，1651329-1340；Thomas JL，et al.Insect Biochem Mol Biol，2002，32247-253)。另一个是以携带高附加值的异源蛋白基因表达框架的重组家蚕核型多角体病毒接种家蚕幼虫或蛹，从感染的虫体收获重组蛋白的蚕体生物反应器的技术路线。这当中已有人α-干扰素、人乙型肝炎病毒表面抗原、人生长激素、酸性和碱性纤维原细胞生长因子、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和牛γ-干扰素等许多种异源蛋白得到了成功表达(Maeda S，et al.Nature，1985，315592-594；Higashihashi N，et al.J Virol Methods，1991，35159-167；Kadonookuda K.，et al.Biochemicaland Biophysical Research Communication，1995，213389-396；Wu X，et al.Protein Expr Purif，2001，21192-200；Shi X，et al.Biotechnol Appl Biochem，1996，24245-249；Murakami K，etal.Cytokine，2001，1318-24)。两种路线中，家蚕转基因品系的培育的技术难度较大。
昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统后建立起来的又一高效表达系统。它利用携带高附加值蛋白基因高效表达框架的重组杆状病毒对昆虫或其细胞系高效感染的能力，在感染后的宿主个体或培养细胞中大量表达目的蛋白。因为用作表达载体的杆状病毒基因组上不仅可以在一些不影响感染复制功能的区段插入长达10kb的外源DNA片段，这些区段在一定长度范围内也可以缺失掉或被外源DNA片段取代。BEVS自1983年建立以来[11]，已有近千种外源基因在该系统得到了表达。目前该系统所用重组杆状病毒主要是重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(rAcMNPV)和重组家蚕核型多角体病毒(rBmNPV)。前者宿主秋粘虫个体很小，一般是以秋粘虫(Spodopterda frugperda)培养细胞-rAcMNPV配合成一个系统使用。重组家蚕核型多角体病毒则主要是与家蚕幼虫或蛹配合在一起使用，走蚕体生物反应器的路线。
在利用培养昆虫细胞和杆状病毒系统表达外源蛋白时，一个简化纯化步骤的策略是使表达的外源蛋白分泌于培养基中，从而减少与目标蛋白混合在一起的杂蛋白量(Tessier，D.C.，et al.Gene，1991，8177-183；O’Reilly，D.R.，Miller，L.K.，and Luchow，V.A.Baculovirus expression vectors.1992，W.H.Freeman and Company，New York)。
家蚕丝腺是典型的外分泌腺体。它是由功能高度特化为合成、分泌丝蛋白的巨核细胞所围成的单层细胞管壁的管状器官。丝腺合成并分泌到丝腺腔里的蛋白共两类，即丝素蛋白与丝胶蛋白。丝素蛋白在后部丝腺合成，由重链、轻链和P25三种蛋白分子以6∶6∶1的比例构成，难溶于水(Cong-Zhao Zhou，et al.Nucleic Acids Research，2000，28(12)2413-2419；Inoue S，et al.J Biol Chem，2000，275(51)40517-28)。
丝胶主要由ser1和ser2两个基因在中部丝腺经过选择性剪接各产生的4种和2种分子构成，可水溶(Michaille J.J.，et al.Biochimie，1986，681165-1173；Michaille J.J.，et al.Gene，1990，86177-184)。某些家蚕品种丝腺合成的丝蛋白构成的蚕茧干重可达0.5克。一般丝胶占丝蛋白的30％，以ser1表达产物为主。由于丝腺合成、分泌丝蛋白的巨大能力，它被看作是一种极巨潜力的优良生物反应器(Louis Marie Houdebine.Transgenic Research，2000，9305-320)。而且，由于丝腺腔中只含有丝素蛋白和丝胶蛋白，其性质比较特殊，很容易与其他目的蛋白质分开，将对于后分离纯化带来极大方便。这一优点将是已有的表达系统所不及的。
如上面所述，在家蚕体内表达外源蛋白基因通常用重组BmNPV，而且一般认为，AcMNPV对家蚕是不感染的，除非其p143基因被BmNPV的p143基因部分取代(Maeda S，et al.J Virol，1993，676234-6238；Croizier G，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1994，9148-52)。本申请的发明人经过研究发现，p143基因不突变的AcMNPV也能够感染一些家蚕的经济品系(Guo T.et al.Archives of Virology，2004，Sep 21[Epub ahead of print])。
发明内容
本申请的发明人经过研究发现，p143基因不突变的AcMNPV也能够感染一些家蚕的经济品系，而且被感染蚕所显示的病症与被重组BmNPV感染所显示的病症相似。也就是说，也有可能利用普通的重组AcMNPV病毒感染某些品系的家蚕幼虫或蛹而构成家蚕生物反应器。由于商业化的AcMNPV构建和使用比较方便，我们利用AcMNPV建立丝腺专一的分泌表达系统，也适宜于BmNPV重组病毒。
本发明的目的就在于利用AcMNPV能感染部分家蚕品系的能力以及丝腺合成、分泌蛋白的巨大能力，从而提供一种家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器。
本发明的另一个目的在于提供一种上述家蚕丝腺生物反应器的构建方法。
本发明的家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器的构建方法如下a、构建含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段、丝胶-1基因polyA信号位点的序列、以及外源目的基因的丝腺特异分泌表达质粒；b、采用合适的内切酶切下丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的外源目的基因表达框，插入病毒表达系统的转座供体质粒；c、将克隆有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的外源目的基因表达框的转座供体质粒转化进入病毒表达系统专用的菌株；d、抽提菌株的病毒DNA，导入载体细胞，装配成具有感染、复制能力的重组病毒质粒，并对病毒进行大规模扩增；e、以得到的重组病毒接种家蚕，构建成家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器。
本发明构建的家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器，由于目标蛋白是分泌在丝蛋白中，而丝蛋白中蛋白种类只有约10种，因此，分离纯化非常方便；而且，家蚕作为高等真核生物，其丝腺一般都能正确表达、修饰真核蛋白。
图1为丝胶1基因(ser1基因)启动子及其信号肽编码区的PCR克隆产物经加A处理后的凝胶电泳示意图。
图2为用于重组病毒的供体质粒的构建示意图。
图3为丝胶1基因启动子及其信号肽编码区引导的egfp在丝腺表达分布情况及EGFP的分泌情况示意图。
图4为感染重组病毒的蚕所吐茧丝蛋白及丝腺腔液态丝蛋白中EGFP存在情况的Western杂交检测结果示意图。
图5A为EGFP初提物的离子交换分离纯化峰图。
图5B为EGFP初提物的离子交换分步收集物的荧光光谱扫描结果示意图。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
实施例1、丝胶1基因(ser1基因)启动子及其信号肽编码区的PCR克隆分别参考GeneBandTM/EMBL Data Bank数据库中索引号为M64781的序列和Garel等的发表论文(Garel A.，et al.Insect Biochem.Molec.Biol.1997，27469-477)，设计两引物引物15′gaaattcttagctacatctagcccag 3′；引物25′gcatgcctgcaggtgaccgaaagcttttacgc 3′；以200ng家蚕品种54A的基因组DNA(中国农业科学院蚕业研究所(江苏，镇江))为模板，PCR克隆含有ser1基因启动子的5′旁侧序列与为信号肽编码的外显子1、内含子1及外显子2部分序列的DNA片段；因为片段较长，所用DNA聚合酶为LA Taq(TaKaRaBiotechnology Co.，Ltd.)；PCR反应体系如下25μl中含引物1和引物2各20pmol；各dNTP终浓度0.4mM；54A基因组DNA 200ng；MgCl2终浓度1.5mM；10×PCR reaction buffer 2.5μl；LA Taq 1.25U。
PCR反应条件为
94℃变性5分钟，25循环的94℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸150秒，循环结束后再72℃延伸10分钟。
PCR产物加入适量双蒸水调整体积到0.5ml，加入等体积酚氯仿(平衡酚与氯仿等体积混合物)，充分振荡，12000g离心10分钟。将上清转移至一新离心管，加入1/10体积3M NaAc(pH＝5.2)，两倍体积无水乙醇，充分振荡，12000g离心10分钟得到DNA沉淀。用70％乙醇洗涤一次，瞬时离心，吸除乙醇。将回收片段溶解至10μl，加入10×PCRreaction buffer 2.5μl，2.5mM dATP 2μl，普通taq酶1.25U，适量双蒸水至总体积25μl。72℃水浴10分钟进行加A处理。然后进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。电泳后，割下含有约3700bp大小DNA条带的位置的胶块放入一1.5ml离心管。加入适量双蒸水调整体积到0.5ml，置于65℃水浴10分钟使胶块融化。取出离心管，加入等体积平衡酚，充分振荡，12000g离心10分钟。将上清转移至一新离心管，加入等体积酚氯仿(平衡酚与氯仿等体积混合物)，充分振荡，12000g离心10分钟。将上清转移至一新离心管，加入等体积氯仿，充分振荡，12000g离心10分钟。将上清转移至一新离心管。加入1/10体积3M NaAc(pH＝5.2)，两倍体积无水乙醇，充分振荡，12000g离心10分钟得到DNA沉淀。用70％乙醇洗涤一次，瞬时离心，吸除乙醇。然后将得到的回收片段克隆进T载体pUCm-T(博彩生物技术公司)，得到的质粒命名为pSerp-T，用Bgl II和SphI从质粒pSerp-T切下含丝胶1基因启动子及其信号肽编码区段的DNA片段，经测序其具有如SEQ ID NO1所示的序列。
实施例2、含丝胶1基因polyA信号位点的序列的克隆设计如下引物引物35′tctagaggttccagcacaagtggaggagc 3′；引物45′cgatgacacctcaacggggtgtgag 3′；用引物3和4以200ng家蚕54A基因组DNA为模板PCR扩增得到含有丝胶1基因polyA信号位点的序列。
PCR反应体系如下25μl中含相应两引物各20pmol；各dNTP终浓度0.2mM；模板DNA；MgCl2终浓度1.5mM；10×PCR reaction buffer 2.5μl；高保真Taq DNA聚合酶1.25U。
PCR反应条件为94℃变性5分钟，25循环的94℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸30秒，循环结束后再72℃延伸10分钟。
所得到的片段经加A处理后克隆进T-载体(Promega)，得到的质粒命名为pSer3-T，经测序其具有如SEQ ID NO2所示的序列。
实施例3、外源目的基因—绿色荧光蛋白egfp基因的克隆设计如下引物引物55′aagcttgtcgacagatctgcatgcatggtgagcaagggcg 3′；引物65′ggtaccggatccttacttgtacagctcgtc 3′；用引物5和6以10ng质粒pEGFP-N1(Clontech)为模板PCR扩增得到绿色荧光蛋白egfp基因片段。
PCR反应体系如下25μl中含相应两引物各20pmol；各dNTP终浓度0.2mM；模板DNA；MgCl2终浓度1.5mM；10×PCR reaction buffer 2.5μl；高保真Taq DNA聚合酶1.25U。
PCR反应条件为94℃变性5分钟，25循环的94℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸30秒，循环结束后再72℃延伸10分钟。
所得到的片段经加A处理后克隆进T-载体(Promega)，得到的质粒命名为pEGFP-T，经测序其具有SEQ ID NO3所示的序列。
实施例4、丝腺特异分泌表达质粒pSerpEGFP的构建以EcoR I和Kpn I双酶切质粒pSer3-T，得到含丝胶1基因polyA信号位点的序列，插入质粒pUC19(Gibco BRL公司)的相应位点。所得到的质粒用Hind III和Kpn I双酶切，电泳回收其3300bp片段。
用Hind III和Kpn I双酶切质粒pEGFP-T，得到750bp绿色荧光蛋白egfp基因小片段，与上一步骤得到的3300bp的片段连接，得到质粒pEGFPser3。
用Bgl II和Sph I双酶切质粒pSerp-T，切出含丝胶1启动子及信号肽编码区的DNA片段，将其插入pEGFPser3中位于egfp基因5′的相应位点，得到丝腺特异分泌表达质粒pSerpEGFP。经序列测定其具有SEQ ID NO4所示的序列。
实施例5、重组病毒制备有关重组病毒制备方法参照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System instructionmanual(Invitrogen life technologies)，主要步骤如下
1、用于重组病毒的供体质粒的构建以EcoR I和Bgl II双酶切质粒pSerpEGFP，从中切出egfp基因的表达框架；以EcoRI和BamH I双酶切质粒pFFa2(Guo et al，Archives of Virology，Published online21，September，2004)，回收其4600bp片段，然后与egfp基因的表达框架连接，得到供体质粒pFFa2-serpegfp，过程示意见图2。
2、供体质粒向病毒基因组的转座重组2.1、制备含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素和25μg/ml氯霉素的LB细菌固体培养平板和含3ml同样浓度抗生素LB液体的细菌培养试管。
2.2、CaCl2法制备DH10BacΔEGT(Guo et al，Archives of Virology，Published online21，September，2004)感受态细胞。方法参照《分子克隆》(Sambrook J et al.Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。
2.3、取200μl冻存的感受态细胞，冰浴融化后，加入1μl约100ng供体质粒DNA冰浴30min，42℃处理90s，冰浴2min。然后转移到含3ml LB细菌液体培养基的试管以250～300rpm在37℃振荡培养4小时。
2.4、在三个含有四种抗生素的LB平板上各图布50μl溶于二甲基甲酰胺的100mg/ml的X-gal和10μl 200mg/ml的IPTG水溶液。然后将上一步培养4小时后的菌液离心，保留约300μl LB溶液将所得菌体悬浮。然后在每个平板表面分别均匀图布5μl，50μl和250μl。
2.5、37℃培养24-48小时，至有清晰的兰白斑克隆出现。
3、重组病毒基因组DNA(Bacmid)的分离3.1、用接种环挑10个左右清晰的白斑，在新配制的含有四种抗生素、图布有X-gal和IPTG的LB平板上划线培养。
3.2、挑划线后长出的白色单克隆接种于含四种抗生素的液体LB试管，37℃以250-300rpm振荡培养24小时。
3.3、将1.5ml上步培养液转移至一1.5ml离心管，14000g离心1分钟。
3.4、吸去上清，以碱裂解法小量提取质粒所用溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA)200μl悬浮菌体沉淀；然后加入200μl溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，缓缓颠倒离心管混匀，室温放置5分钟；缓缓加入200μl预冷的溶液III(3mol/L NaAc，5mol/L HAc pH4.8)，轻缓颠倒离心管混合几次，冰上放置5～10分钟。
3.5、14000g离心10min。上清转移至新离心管，并加入540μl异丙醇，缓缓颠倒离心管混匀，冰上放置5～10分钟，或-20℃过夜保存。
3.6、14000g室温离心15分钟。吸除上清，加入500μl 70％乙醇，颠倒离心管数次洗涤沉淀。14000g室温离心5分钟，吸尽上清，室温放置5分钟左右适当干燥沉淀。
3.7、以40μl TE溶解沉淀DNA，-20℃保存备用。
3.8、重组Bacmid的PCR鉴定。
所用引物对一对为M13正向和反向引物(上海生物工程公司)，另一对为egfp正向引物(实施例1.2，引物3)和M13反向引物。同时用M13正、反引物扩增，如果出现约300bp片段，则说明重组病毒不纯或没有重组。如果M13正、反引物扩增没有300bp片段出现，而目的基因特异的引物和M13反向引物能扩增出大小为2000bp的片段则说明所得到的重组病毒DNA是纯的而且发生了正确重组。
PCR反应体系的建立和循环设置参照实施例1.2。
4、重组Bacmid转染Sf-9细胞4.1、Sf-9细胞培养取出液氮中冻存的sf-9细胞(GIBCO BRL)，迅速置27℃水中，迅速摇晃。完全融化后转移至一15ml细胞离心管，缓慢滴加PBS至总体积10ml左右。800rpm离心5分钟，弃去上清。细胞沉淀用含胎牛血清及抗生素的Grace’s培养基(GIBCO BRL)悬浮，转移至25cm2细胞培养瓶，培养基加至5ml，27℃细胞培养箱培养。根据细胞生长情况每两天换液一次或传代。传代时先吸除原来的培养基，加入5ml新鲜培养基，用移液器吸培养液轻轻吹打使部分贴壁细胞脱落。根据吹打下来的细胞多少将它们重新铺于一个或几个新的细胞培养瓶培养，每瓶培养基补至5ml，27℃细胞培养箱培养。原瓶可再加5ml培养基继续培养。
4.2、用Lipofectin Reagent(GIBCO BRL)将重组Bacmid导入Sf-9细胞4.2.1、在细胞培养用12孔板中按每孔1ml加入从细胞生长状况良好的培养瓶中轻缓吹打下来的4×105个细胞/ml的细胞悬浮液，静置培养至少1小时，令贴壁。
4.2.2、在1.5ml离心管中准备两种溶液，A经PCR鉴定为纯的重组bacmid DNA 3μl溶于200μl无抗生素和胎牛血清的Grace’s培养基(GIBCO BRL)；B1μl Lipofectin Reagent溶于200μl无抗生素和胎牛血清的Grace’s培养基。将两者振荡混匀，室温放置20分钟。然后将两者混合，振荡混匀，室温放置30分钟。
4.2.3、吸除12孔板中培养细胞的原培养液，并用0.5ml无血清和抗生素的Grace’s培养基轻微摇晃、吸净以洗去原残留培养基。将上步的AB混合液加入孔中，27℃细胞培养箱培养5小时。
4.2.4、吸净培养孔中的AB混合液，加入含胎牛血清及抗生素的Grace’s培养基1ml，27℃细胞培养箱培养72小时左右。
4.2.4、观察细胞形态，有病毒大量扩增复制时细胞涨大变圆，有成串融合的趋势。此时收获培养液于1.5ml离心管，500g离心5分钟，上清移于一新的离心管中得到初次扩增的病毒。4℃黑暗保存，亦可放-70℃保存。
4.3、病毒的大量扩增、纯化、保存及滴度测定4.3.1、大量扩增向细胞长势良好、贴壁细胞几乎铺满瓶壁的25cm2细胞培养瓶中加入20μl初次扩增的病毒培养液。约48小时后可以收获病毒。
4.3.2、大量扩增病毒的纯化收获的病毒先以500g离心10分钟除去细胞碎片，所得上清在Avanti J-E离心机JA-21转头(BECKMAN COULTER)以35000g，4℃离心60分钟。立即吸除上清，沉淀以含抗生素及胎牛血清的1/5原体积的Grace’s培养液重悬。4℃黑暗保存。
4.3.3滴度测定在细胞培养用96孔板中接种103个Sf-9细胞，静置培养1小时以上使贴壁。
用细胞培养基将大量扩增的病毒做10倍梯度稀释，具体方法是取10只1.5ml离心管，每管加入900μl含抗生素及胎牛血清的Grace’s培养基，取100μl大量扩增病毒液加入第一管混匀，从其中取100μl加入第二管混匀，从第二管取出100μl加入第三管混匀，依次稀释到第10管，即得到了大量扩增病毒的10-1-10-10的梯度稀释。
顺次吸去96孔板各孔中原有培养基。立即加入从10-3起的每种稀释梯度的病毒液100μl，每个稀释梯度加10孔。这样，从10-3到10-10，每种梯度有10个平行的感染孔。培养板置27℃细胞培养箱培养6-7天，观察各个梯度的感染情况。
按Tissue Culture Infectious Dose 50(TCID50)的方法(参照Qbiogene“adenovator vectorsystem”)计算病毒滴度。即T＝101+d(s-0.5)，即得到100μl病毒原液中病毒粒子数。其中，d为稀释倍数的对数值，此处为Log10，等于1。S为各稀释梯度的10个孔中被病毒感染孔数占十个孔总数的百分比的和。本实验因为可以预见10-1和10-2会全部感染，两者皆以1计。以本实验的数据为例，在10-6梯度及更高梯度接种的十个孔均感染；在10-7梯度接种的十个孔中有5个感染，在10-8梯度接种的十个孔中有3个感染；10-9和10-10梯度接种的十个孔均未见感染，则S＝1+1+1+1+1+1+0.5+0.3+0+0＝6.8。100μl的滴度为T＝101+1(6.8-0.5)＝107.3，即100μl病毒原液中病毒粒子数约为2×107个。
本方法只有在阴性对照细胞状态仍然良好，且至少最低稀释梯度的十个孔没有一个被感染的的情况下才适用。
实施例6、重组病毒向家蚕的接种及丝腺荧光观察家蚕54A(中国农业科学院蚕业研究所)于25℃桑叶饲养，5龄起蚕时接种病毒。测定滴度后的病毒以细胞培养液稀释至每毫升108PFU。以50μl微量进样器吸取病毒悬浮液按每头蚕10μl皮下注射，使病毒进入蚕体液。无egfp表达框架的重组病毒AcFFa2ΔEGT(Guoet al，Archives of Virology，Published online21，September，2004)作为阴性对照同时注射。注射后的蚕桑叶喂养，一天喷一至两次蚕用抗生素“克蚕菌”(中国农业科学院蚕业研究所)以防蚕细菌感染。
饲养约5天后观察，注射病毒的蚕出现食叶量减少、躯体瘫软少弹性、爬行时腹足萎缩无力、节间膜较多重叠等典型重组病毒感染症状。此时解剖蚕体，从中取出丝腺在PBS(PH7.0)中洗去黏附组织碎片。然后规则地摆在载玻片上，置荧光显微镜(LeicaMZFLIII)下观察拍照，如图3所示，丝腺呈现EGFP绿色荧光，中部丝腺的中部荧光明显强于后部丝腺。
实施例7、EGFP初提物的制备、FPLC初步纯化和荧光光谱测定1、EGFP初提物的制备解剖出的丝腺迅速在双蒸水中漂洗除去黏附碎片组织，用干净剪刀剪下中部丝腺另置于一冰冷干净平皿，按一对丝腺1ml加入冰冷的双蒸水。数分钟后即会有大量丝蛋白涌出，此时小心除净丝腺壁组织。剩下的即为丝蛋白和白光下看不见的egfp蛋白。将凝胶状丝蛋白捣碎使充分水溶。吸取液体部分于1.5ml离心管，-20℃冻存。约1小时后取出，室温溶解后立即用干净吸头伸入管中挑出形成的不溶固体部分弃去。也可离心将固体沉淀下来，转移上清至一新的离心管。再次-20℃冻为固体后用冷冻抽干(SpeedVac Savant)的方法浓缩至原体积的1/5。所得浓缩液再-20℃冻存，约1小时后取出室温溶解并立即离心除去析出的固体部分。将这样得到的来自约5对丝腺的上清部分合在一起，-20℃冻为固体后用冷冻抽干的方法浓缩至适合下一步上柱的体积。浓缩液再次-20℃冻，室温溶解后立即离心除去析出的固体。上清-20℃冻存为下一步上柱纯化用。
2、EGFP的FPLC初步纯化配制溶液A20mM Tis-HCl，pH7.5；溶液B含0.4M NaCl的溶液A。
在FPLC system(Pharmacia)上装配1ml HiTrap DEAE column(Pharmacia)离子交换柱。将上一步浓缩液0.4ml上样，以0-30％的B洗脱液洗脱12分钟，然后用50％洗脱液洗脱10分钟，最后以100％B洗脱液洗脱6分钟以清洗交换柱。洗脱时按1ml每管收集洗脱液。洗脱峰峰图见图5A。
3、荧光光谱扫描将一管上步收集的洗脱液加入荧光比色杯，在荧光分光光度计(Hitachi F-4010)上以480nm激发波长从500nm到550nm扫描测定所收集蛋白的发射峰。在510nm出现发射峰的管中即有EGFP蛋白的存在。见图5B，出现发射峰的收集管a，b，c，d与图5A对应，b管具有最强发射，说明EGFP主要集中于b管。
实施例8、SDS-PAGE凝胶电泳即蛋白免疫印迹1、SDS-PAGE凝胶电泳配制如下储存液A、30％丙烯酰胺母液，Arc∶Bis＝29∶1；B、1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8；C、0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8；D、10％SDS；10％过硫酸铵(APS)；E、5×样品缓冲液4.0ml重蒸水，1.0ml 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)缓冲液，0.80ml甘油，1.6ml 10％(w/v)SDS，0.4ml巯基乙醇，0.2ml 0.1％(w/v)溴酚蓝，总体积8ml；F、浓缩电泳缓冲液(5×)取15g Tris，72g甘氨酸，5g SDS，用水溶解至1000ml，pH为8.3(不用调pH值)。
按照如下配方制胶10％分离胶配方4.02ml重蒸水，2.50ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)，100μl 10％SDS，3.33ml 30％丙烯酰胺母液。室温脱气15分钟，加入50μl 10％过硫酸铵(新鲜配制)和5μlTEMED。
4.0％浓缩胶配方3.0ml重蒸水，1.25ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)，50μl 10％SDS，0.67ml 30％丙烯酰胺母液。室温脱气15分钟，加入25μl10％过硫酸铵(新鲜配制)和5μlTEMED。
取重组病毒感染后在丝腺特异表达EGFP的蚕所吐茧丝适量，浸于100℃双蒸水10分钟，制备得到感染蚕茧丝可溶蛋白部分。所得蛋白溶液与丝腺流出物蛋白部分以及相应对照蛋白经10％SDS-PAGE电泳，本步操作参照Laemmli发表论文(Laemmli U.K，Nature，1970，227680-685)，电泳后进行下一步。
2半干式电转移本步操作参照《蛋白质化学研究技术与进展》(夏其昌主编，科学出版社，1997)。
配制如下缓冲液
阳极缓冲液I0.3mol/L Tris，10％甲醇，pH10.4；阳极缓冲液II25mmol/L Tris，10％甲醇，pH10.4；阴极缓冲液25mmol/L Tris，40mmol/L 6-氨基己酸，10％甲醇，pH9.4(用40mmol/L甘氨酸代替6-氨基己酸)。
将PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)先在100％甲醇中润湿2～3秒，再用超纯水漂洗2～3分钟，然后在阳极缓冲液II中平衡15分钟。电泳结束后将凝胶在阴极缓冲液中平衡5分钟。在半干式电转移仪上，由阳极至阴极依次放在阳极缓冲液I中浸过的与胶同样大小的Whatman 3mm滤纸4张，在阳极缓冲液II中浸过的与胶同样大小的Whatman 3mm滤纸2张，PVDF膜，凝胶，在阴极缓冲液中浸过的与胶同样大小的Whatman 3mm滤纸6张。1mA/cm电转移90分钟。完毕后膜在TTBS中稍事漂洗，即可进行下一步Western blot的封闭步骤。
3、Western杂交上一步转移到PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)上的蛋白以GFP免疫大鼠单克隆抗体GFP(B-2)sc-9996(Santa Cruz)和偶联辣根过氧化酶的绵羊抗大鼠二抗A-6782(Sigma)进行Western杂交检测。Western杂交检测的步骤如下将转移结束后的蛋白印迹膜(如为风干后的膜则先在甲醇中浸润)放入TTBS溶液中(TTBS20m mol/L Tris-HCl pH7.5；137m mol/L NaCl；0.05％Tween-20)漂洗2分钟。将膜置于5ml封闭缓冲液，室温轻轻摇动孵育1小时(封闭缓冲液含5％脱脂奶粉的TTBS)。将膜置于5ml一抗缓冲液(一抗缓冲液含1/2000体积一抗的封闭缓冲液)，轻轻室温摇动一小时。除去一抗缓冲液，用TTBS溶液洗涤3次，每次5分钟。加入5ml二抗缓冲液(二抗缓冲液含1/2000体积二抗的封闭缓冲液)，室温轻轻摇动孵育1小时。除去二抗缓冲液，用TTBS溶液洗涤3次，每次5分钟。将洗好的膜置于一干净平皿，将化学发光试剂(含pH9.0的0.1M Tris.Cl 4ml，68mM肉桂酸8μl，以100mg/ml溶于DMSO的Luminol(Gibicol BRL)15μl)均匀加在膜的表面反应1分钟。用镊子提起膜将膜面液体流去，然后迅速置于预先准备好的塑料膜之间，置于X光片片夹内进行X光片的曝光。适当时间取出X光片进行显影、定影。结果如图4所示，感染蚕丝腺腔及所吐茧丝蛋白中均有EGFP的存在，而对照蚕没有。
虽然以上仅列举了以绿色荧光蛋白egfp基因为外源目的基因构建的家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器，但是通过采用合适的酶切位点构建表达其他外源目的基因的家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器，对于本领域的技术人员来说是显而易见、且非常容易做到的，因此此处不再一一列举。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>家蚕丝腺生物反应器及其构建方法<130>041431N<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3691<212>DNA<213>silkworm<220>
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1.一种家蚕丝腺生物反应器，用于表达外源目的基因，其特征在于，所述反应器以家蚕为载体，以丝胶-1基因启动子及信号肽编码序列为调控元件。
2.如权利要求1所述的反应器，其特征在于，所述反应器克隆有含丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段、外源目的基因编码序列、丝胶-1基因polyA信号位点的序列的丝腺特异分泌表达质粒。
3.如权利要求1或2所述的反应器，其特征在于，所述外源目的基因为绿色荧光蛋白egfp基因。
4.如权利要求2所述的反应器，其特征在于，所述含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段具有SEQ ID NO1所示的序列。
5.如权利要求3所述的反应器，其特征在于，所述构建的丝腺特异分泌表达质粒具有SEQ ID NO4所示的序列。
6.一种家蚕丝腺生物反应器的构建方法，其特征在于包括以下步骤a、构建含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段、外源目的基因编码区序列、丝胶-1基因polyA信号位点的序列的丝腺特异分泌表达质粒；b、采用合适的内切酶切下丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的外源目的基因表达框，插入病毒表达系统的转座供体质粒；c、将克隆有丝胶-1基因启动子及信号肽编码序列带动的外源目的基因表达框的转座供体质粒转化进入病毒表达系统专用的菌株；d、抽提菌株的病毒DNA，导入载体细胞，装配成具有感染、复制能力的重组病毒颗粒，并对病毒进行大规模扩增；e、以得到的重组病毒接种家蚕，构建成由家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码序列带动外源基因表达的家蚕丝腺生物反应器。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤a包括含丝胶-1基因启动子及其信号肽编码区段的DNA片段的克隆、含丝胶1基因polyA信号位点的序列的克隆、外源目的基因编码区的克隆，以及用合适的内切酶将三者连接起来。
8.如权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述外源目的基因为绿色荧光蛋白egfp基因。
9.如权利要求6中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段具有SEQ ID NO1所示的序列。
10.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述构建的丝腺特异分泌表达质粒具有SEQ ID NO4所示的序列。
11.一种丝腺特异分泌表达质粒，其特征在于，所述表达质粒由含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码序列的DNA片段、含有丝胶-1基因polyA信号位点的序列、以及绿色荧光蛋白egfp基因构建而成。
12.如权利要求11所述的丝腺特异分泌表达质粒，其特征在于，所述含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段具有SEQ ID NO1所示的序列。
13.如权利要求11或12所述的丝腺特异分泌表达质粒，其特征在于，所述构建的丝腺特异分泌表达质粒具有SEQ ID NO4所示的序列。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕丝胶－1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器，通过构建由含有丝胶－1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段、外源目的基因、含有丝胶－1基因polyA信号位点序列的表达框构成的丝腺特异分泌表达质粒，再将表达框架亚克隆进病毒表达系统的供体质粒，然后转化DH10BacΔEGT感受态细胞，抽提重组病毒DNA，导入载体细胞包装成重组病毒质粒，大量扩增病毒，最后注射家蚕。本发明构建的家蚕丝胶－1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器，由于目标蛋白是分泌在丝蛋白中，而丝蛋白中蛋白种类只有约10种，因此，分离纯化非常方便；而且，家蚕作为高等真核生物，其丝腺一般能正确表达、修饰真核蛋白。
文档编号C12N15/86GK1786176SQ20041008920
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月8日 优先权日2004年12月8日
发明者陆长德, 郭秀洋 申请人:中国科学院上海生命科学研究院